СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСНОВНЫХ ЭТАПОВ ФОРМИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1997 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано при изучении патогенеза хронических инфекций и может послужить основой для разработки способов и методов лечебного воздействия при ряде хронических инфекционных заболеваний (туберкулез, лепра и т.д.).

Известен аналогичный способ моделирования хронической инфекции в брюшной полости лабораторных животных (Учитель И.Я. Макрофаги и иммунитете. М. Медицина. 1978 с.138-186). Однако, в этой модели не учтено одно из важнейших звеньев процесса взаимодействия фагоцитов с микроорганизмами. Давно известно, что, например, микобактерии в первую очередь захватывают нейтрофилы. Затем нейтрофил разрушается и в действие вступают макрофаги, которые захватывают микобактерии и остатки нейтрофилов. При этом не учитывают тот факт, что микобактерии находятся в нейтрофиле в мембранной упаковке (фагосоме) и при разрушении нейтрофила эти фагосомы поступают в межклеточную среду. Там их захватывают макрофаги и в макрофаге они находятся уже в двойной мембранной упаковке. При слиянии такой фагосомы с лизосомой (в макрофаге) лизосомальные ферменты реагируют не на микобактерию, а на мембрану нейтрофила и разрушают ее. В результате фаголизосома, по-видимому теряет способность к слиянию с другими лизосомами, а микобактерии получают полный комплекс субстратов для своего существования и развития. Таким образом, во всех способах моделирования инфекционных процессов не учитывается эта важная стадия.

Целью изобретения явилось выделение в процессе взаимодействия микроорганизмов с фагоцитами двух промежуточных форм существования микроорганизмов в одно- и двухмембранной упаковке.

Способ осуществляется следующим образом.

Внутрибрюшинно мыши вводят 0,5 мл взвеси бактерий вакцинного штамма БЦЖ (1 мг вакцины разведенный в 5 мл физраствора). Через сутки забирают содержимое брюшной полости путем отмыва ее физраствором и вводят перитонеальный смыв (нейтрофилы с фагоцитированными бактериями) в брюшную полость стимулированных и нестимулированных мышей (которым предварительно вводился или не вводился внутрибрюшинно какой-либо стимулятор макрофагов). Через 10, 20, 30, 60 мин и т.д. осуществляют забор содержимого брюшной полости с последующим исследованием при помощи люминесцентной и электронной микроскопии на наличие фагосом с двойной мембранной упаковкой.

О взаимосвязи процесса хронизации с формой мембранной упаковки бактерий.

Прежде всего следует отметить тот факт, что все формы мембранных упаковок микобактерий изолируют антигенные детерминанты бактерии от иммунной системы организма-хозяина. Клетки иммунной системы активно взаимодействуют только со свободными бактериями, находящимися в межклеточном пространстве. Если бактерия упакована в мембранные оболочки, то нейтрофилы вообще не реагируют с такими образованиями, а макрофаги воспринимают их как свои, нечужеродные, внеклеточные образования. Например, макрофаг фагоцитировал нейтрофил с находящимися в нем фагосомами с микобактериями, в результате в макрофаге сформировалась трехмембранная внутриклеточная упаковка микобактерий. После этого лизосомы макрофага сливаются с этой гигантской фагосомой и ферменты начинают расщеплять мембраны и другие структуры нейтрофила. Пока ферменты достигнут бактерий, они потеряют свою активность. Одновременно они создадут огромное количество разнообразных субстратов для ее роста и развития. В результате бактерии начинают размножаться в фаголизосоме макрофага с последующим его разрывом и выходом во внеклеточную среду. Порочный круг замкнулся.

Проведенное автором исследование по изучению начальных этапов развития хронической инфекции подтверждает вышеприведенные положения. Опыты проводили на мышах линии СВА. В брюшную полость вводили по 0,5 мг БЦЖ. Через 1-7 суток мышей забивали и забирали перитонеальный смыв. После центрифугирования из части центрифугата делали мазки. Их окрашивали по Романовскому-Гимза и Циля-Нильсену для световой микроскопии, а также акридиновым оранжевым для люминесцентного исследования.

Исследовали фагоцитарную активность макрофагов по отношению к микобактериям и завершенность фаголизосомного слияния (ФЛС). Так фагоцитарный показатель (процент фагоцитирующих макрофагов) через 2 суток составил 38,7±2,0% а фагоцитарный индекс (среднее число микробов поглощенных одним макрофагом) 2.9. Индекс завершенности ФЛС (отношение числа фаголизосом к фагосомам) составил 0,2. Учитывая то, что макрофаги по критерию завершенности ФЛС оказались гетерогенными, мы разбили их на три группы: 1. Макрофаги с завершенным ФЛС ФЛС+. 2. Макрофаги с незавершенным ФЛС ФЛС-. 3. Смешанные макрофаги ФЛС±. Полученные результаты представлены в таблице. Из таблицы видно, что наибольшее количество микобактерий сконцентрировано в группах ФЛС и ФЛС±, Наименьшее количество макрофагов составило группу ФЛС+. Эти данные указывают на то, что в большинстве макрофагов фагоцитировавших микобактерии начинает формироваться эндоцитобиоз, т.е. уже на ранних этапах инфекционного процесса имеются четкие признаки его хронизации.

Использование: в экспериментальной биологии и медицине и может применяться для изучения патогенеза хронических инфекций и послужить основой для разработки способов и методов лечебного воздействия при ряде хронических инфекционных заболеваний (туберкулез, лепра и т.д.). Сущность изобретения: экспериментальному животному в брюшную полость вводят микроорганизмы, после чего осуществляют исследование в процессе фагоцитоза с помощью электронной и люминисцентной микроскопии формы мембранной упаковки бактерий, а именно фагосома с бактерией во внеклеточной среде, фагосома с находящейся в ней бактерией в фагоците и макрофаг с нейтрофилом с находящейся в нем фагосомой с бактерией. Способ позволяет учесть в данной модели процесс взаимодействия фагоцитов с микроорганизмами. 1 табл.

Способ моделирования основных этапов формирования хронической инфекции путем введения микроорганизмов в брюшную полость экспериментального животного с последующим исследованием процесса фагоцитоза, отличающийся тем, что исследуют в процессе фагоцитоза при помощи люминесцентной и электронной микроскопии форму мембранной упаковки бактерий, а именно фагосома с бактерией во внеклеточной среде, фагосома с находящейся в ней бактерией в фагоците и макрофаг с нейтрофилом с находящейся в нем фагосомой с бактерией.