ВАКЦИНА ПРОТИВ ГЕЛЬМИНТОЗОВ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/00 C07D403/00 A61K39/00 A61K39/385 A61K39/39 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для профилактики и лечения различных гельминтозов животных и человека.

В настоящее время основным методом борьбы с гельминтами является применение химиотерапевтических препаратов антигельминтиков, таких, как нилверм, ринтал, панапурм и др. Однако установлено, что антигельминтики высокотоксичны, вызывают иммуносупрессию, требуется многократная обработка, отмечается также развитие устойчивости паразитов к применяемым химиопрепаратам. Вакцинация снимает вопросы многократности обработок, резистентности паразитов к используемым препаратам, безопасности применения.

Известны способы получения инактивированных, генноинженерных и живых вакцин против гельминтозов (1,2,3). Недостатками таких вакцин является их высокая реактогенность, низкая иммуногенность, трудоемкость процесса получения, а также вероятность заражения вакцинирующим материалом, генноинженерных низкая иммуногенность. Кроме того, вакцины малоэффективны, эффект их узкоспецифичен и направлен только против определенного паразита.

Известна конъюгированная вакцина против гельминтозов на основе экдистероида и белковой макромолекулы. Недостатком указанной вакцины является низкая эффективность, использование в качестве макромолекулярного носителя белка, вызывающего при введении в организм ряд побочных иммунопатологических эффектов (4).

Наиболее близким аналогом является вакцина для профилактики гельминтозов, содержащая конъюгат протективного антигена гиалуронидазу мол.м. 63 КД с иммуностимулирующим носителем общей формулы:

где:
q (0,2-0,35)n
z (0,4-0,65)n
m (0-0,4)n
n 200-2000.

Кроме того, известная вакцина дополнительно содержит адъювант, например гидроокись алюминия, мурамилдипептид и/или синпол (полиоксидоний) (5).

Однако известная вакцина обладает нежелательными побочными эффектами, обусловленными низкой скоростью биодеструкции и выведения из организма. Кроме того, получение препарата с заранее заданной структурой и свойствами затруднено, поскольку синтез проводится в неконтролируемых условиях.

Технический результат, получаемый при реализации изобретения, состоит в повышении эффективности и безопасности вакцины за счет снижения ее токсичности, а также получения возможности контролируемого синтеза препарата с заданными структурой и свойствами.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Вакцина против гельминтозов, содержащая конъюгат иммуностимулирующего носителя с протективным антигеном, содержит в качестве протективного антигена белок, выделенный из структур соединительных тканей, обладающий гиалурозно-лиазной активностью и характеризующийся мол.м. 63000 Д, изоэлектрической точкой 5,7, имеет массовое соотношение антиген-носитель 1:1-10 и общую формулу:

где
R протективный антиген
n 200-2000 количество элементарных звеньев
q (0,1-0,35) количество алкилированных звеньев,
z (0,4-0,7) количество окисленных групп.

Описанный белок полипептид с молекулярной массой 63000 (П-63) является общим для различных форм гельминтов и его аминокислотный состав (первичная последовательность) протективного антигена был исследован и описан в известном источнике (6).

Источником для выделения белка П-63 могут служить, например, личиночные формы гельминтов Dictyocaulus filaria, Fasciola hepatica, Haemonchus contorius.

Белок выделяют путем измельчения исходного биоматериала, экстракции раствором уксусной кислоты (pH 4,5-4,7), отделения экстракта центрифугированием, концентрации экстракта методом ультрафильтрации, осаждения балластов белков, очистки целевого продукта методом хроматографии и лиофильное высушивание.

В качестве иммуностимулирующего носителя используют полиоксидоний - синтетический высокомолекулярный сополимер N-оксида 1,4-этиленпиперазина и N-карбоксиэтил-1,4-этиленпиперазиний бромида.

Описываемые в изобретении параметры структуры полиоксидония: n - количество элементарных звеньев, q количество алкилированных звеньев, z - количество окисленных групп определяют иммунобиологические свойства препарата в целом (эффективность воздействия, токсичность и безопасность применения).

Установлено, что эффективность препарата возрастает при повышении молекулярной массы. Используемые значения q (0,1-0,35) обеспечивают достаточную степень связывания и низкие токсические свойства даже при высоких молекулярных массах. Количество окисленных групп (z=0,4-0,7) обеспечивает снижение токсичности и регулирует скорость метаболизма и выведения препарата из организма.

Механизм защиты против гельминтозов, формирующийся в организме после иммунизации предлагаемой вакциной, связан как с воздействием на один из ключевых факторов патогенности на ранних стадиях развития гельминта, так и на процессы жизнедеятельности зрелого гельминта.

Белок П-63 является слабым иммуногеном, не вызывающим в организме заметный антительный ответ. В результате конъюгирования с иммуностимулирующим носителем полиоксидонием, способным в составе конъюгата вызывать существенное повышение антительного ответа к протективному антигену, образуются соединения, вызывающие в организме высокий антительный ответ против белка П-63, что обеспечивает высокую эффективность, стабильность и пролонгирование действия вакцины.

Усиление антительного ответа и протективной активности конъюгированной вакцины может быть достигнуто с помощью введения добавок различных природных и синтетических адъювантов в оптимальных иммуностимулирующих дозах.

Конъюгированную вакцину получают путем ковалентного связывания протективного белкового антигена П-63 с высокомолекулярным иммуностимулирующим носителем полиоксидонием азидным методом или методом активированных эфиров, в результате чего образуется ковалентная амидная связь между молекулами полимерного носителя и молекулами белкового антигена. Описываемый синтез проводится в контролируемых условиях и дает возможность получить препарат с заранее заданной структурой и соотношением белок-полимер.

Использование азидного метода требует тщательного соблюдения условий реакции температура 0-2^oC, pH 8,0-8,5, соотношение полимер-антиген 1:3-1:5, продолжительность реакции 12 ч. При проведении реакции в строго контролируемых условиях указанный способ конъюгации позволяет полностью избежать межмолекулярных и внутримолекулярных сшивок, сохранить антигенные детерминанты и получить конъюгаты с высоким выходом. При использовании метода активированных эфиров получение полимер-антигенной вакцины проводят в две стадии, первая стадия синтез сукцинимидного эфира полиоксидония, вторая стадия заключается в проведении реакции конъюгации между активированной формы полиоксидония и антигеном П-63.

Выделение конъюгата осуществляют хроматографическим методом, анализ конъюгатов проводят методами электрофореза в ПААГ, флуоресцентной спектроскопии.

Введение адъювантов в состав конъюгированной вакцины проводят добавлением адъювантов к конъюгированной вакцине в водном растворе при pH 6,5-7,45 с последующим выявлением путем лиофелизации. Количество добавляемого адъюванта зависит от его оптимальной дозы для человека или конкретного вида животных. Способ позволяет сохранить эффективность вакцины при низком содержании высокомолекулярного носителя, что уменьшает затраты на производство вакцины.

Для пояснения изобретения ниже приводятся конкретные примеры получения гельминтной вакцины различными способами и анализа протективных свойств вакцины.

Пример 1. Получение конъюгата полиоксидония с белком П-63 с использованием азидного метода конъюгации проводится в две стадии. Первая стадия получение гидразида полиоксидония.

500 мг полиоксидония (n=2000; q=0,1; z=0,7) растворяют в 25 мл метилового спирта. При температуре 20^oC добавляют 0,2 мл (2•10^-3 М) гидразин гидрата. Реакцию ведут в течение 24 ч. Метанол отгоняют на роторном испарителе, остаток растворяют в воде и проводят эфирную экстракцию. Выделяют продукт методом ультрафильтрации на полых волокнах (система "Amikon") с последующей лиофилизацией.

Содержание гидразидных групп определяют стандартным методом титрования первичных аминогрупп 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой.

Вторая стадия получение конъюгата по реакции конденсации гидразида полиоксидония с белком П-63. 100 мг гидразида полиоксидония растворяют в 4 мл 1н. HCl). Раствор охлаждают до 0-2^oC. Затем при перемешивании и охлаждении добавляют 1,15 мл 3%-ного раствора нитрита натрия. Через 15 мин доводят pH раствора до 8,5 добавлением 2н. NaOH. Раствор 12 мг белка П-63 в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера pH 8,5 добавляют к раствору активированного полиоксидония. Поддерживают pH реакционной смеси равным 8,5 добавлением 2н. NaOH. Реакция продолжается в течение 12 ч при перемешивании и охлаждении (0-2^oC). Для выделения и очистки конъюгата реакционную смесь наносят на колонку (2,6х90), заполненную биогелем P 100, в качестве элюента используют фосфатный буфер 0,05 М pH 7,5, содержащий 0,05 М NaCl. Выход конъюгата контролируют с помощью проточного спетрофотометра при 226 нм. Определение содержания белка и анализ конъюгата проводят методом флуоресцентной спектроскопии, электрофореза в ПААГ. В 1 мг препарата содержится 0,10 мг белка П-63.

Пример 2. Получение конъюгата полиоксидония (мол.м. 25000, n=200, q=0,1, z=0,7) с белком П 63 приводят аналогично описанному в примере 1. Соотношение полимер-белок в реакционной смеси составляет 1:5, pH при проведении конденсации поддерживается равным 8. В 1 мг препарата содержится 0,15 мг белка П 63.

Пример 3. Получение конъюгата полиоксидония с белком П 63 методом активированных эфиров проводят в две стадии.

Первая стадия получение сукционимидного эфира полиоксидония.

100 мг полиоксидония (n=800; q=0,1; z=0,7), содержащего 0,30 ммоль COOH-групп, суспендируют в 4 мл диметилформамида, добавляют при перемешивании 77,2 мг (0,30 ммоль) дициклогексидкарбодиимида и 36 мг (0,30 ммоль) N-гидроксисукцинимида. Реакцию проводят при перемешивании и охлаждении (2-4^oC) в течение 24 ч. Для очистки осадок многократно промывают диоксаном, эфиром и ацетоном, высушивают в вакуумном сушильном шкафу. Отсутствие низкомолекулярных примесей проверяют методом тонкослойной хроматографии на пластинах "Силуфол" в системе н-бутиловый спирт-вода-уксусная кислота 4:1:1. Содержание активированных групп определяют стандартным методом (pH 8,5, 0,1 М водный раствор NH₃, 259 нм, коэффициент экстинкции 9700); содержание активированных групп составляет 9•10^-4 молей на 1 г полимера.

Вторая стадия проведение конъюгации. 100 мг активированного полиоксидония растворяют в 10 мл фосфатного буфера pH 6,0 0,05 М. При перемешивании и охлаждении добавляют раствор 15 мг белка П 63 в 12 мл фосфатного буфера 0,05 М pH 7,5. Реакцию конденсации проводят в течение 18 ч при 0^oC. После окончания реакции конъюгат выделяют хроматографическим методом, как описано в примере 1. Анализ конъюгата проводят аналогично описанному в примере 1.

В 1 мг препарата содержится 0,1 мг белка П 63.

Пример 4. Получение конъюгата полиоксидония с белком П 63 проводят аналогично описанному в примере 3. Соотношение полимер-белок в реакционной смеси составляет 1:2.

В 1 мг препарата содержится 0,5 мг белка П 63.

Пример 5. Получение комплексной вакцины.

Получение и выделение конъюгата полиоксидония с белком П 63 проводят аналогично описанному в примере 1. Соотношение полимербелок в реакционной смеси составляет 1:1, содержание полиоксидония 5 мг, белка П 63 5 мг. Затем к раствору очищенного конъюгата добавляют водный раствор адъюванта полиоксидония в количестве 40 мг. Раствор лиофилизуют, содержание белка определяют, как указано в примере 1. В 1 мг препарата содержится 0,1 мг белка.

Пример 6. Получение комплексной вакцины/
Получение комплексной вакцины проводят аналогично описанному в примере 5.

Получение и выделение конъюгата полиоксидония с белком П 63 проводят аналогично описанному в примере 3. В качестве адъюванта используют полиоксидоний в количестве 200 мг.

Пример 7. Получение комплексной вакцины.

Получение комплексной вакцины проводят аналогично описанному в примере 5.

Получение и выделение конъюгата полиоксидония с белком П-63 проводят аналогично описанному в примере 1. В качестве адъюванта используют полиоксидоний в количестве 200 мг.

Пример 8. Получение комплексной вакцины.

Получение комплексной вакцины проводят аналогично описанному в примере 5, в качестве адъюванта используют ГМДП (производное мурамилдипептида) в количестве 10 мг.

Пример 9. Получение комплексной вакцины. Получение комплексной вакцины проводят аналогично описанному в примере 5, в качестве адъюванта используют гидроокись алюминия в количестве, необходимом для стимуляции иммунного ответа.

Пример 10. Испытание эффективности вакцины для профилактики эхинококкозов проведены на 45 собаках. Препараты, полученные согласно примерам 1 и 5, вводят дважды с интервалом 21 день. Через 14 дней после второй иммунизации животных заражают перорально протосколексами эхинококков в дозе 30000 протосколексов на животное. На 30-й день после заражения животных забивают и определяют количество гельминтов в кишечнике. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.

Оценку острой токсичности препарата (ЛД₅₀) во всех случаях проводили по стандартной методике, изложенной в Сборнике инструкций, утвержденном приказом Минздрава СССР от 13.01.83 N 31, с. 76.

Острая токсичность препаратов, полученных согласно примерам 1 и 5, составляет 2000 мг/кг массы животного.

Пример 11. Испытания проводили на Украинской НИВС на 12 собаках. Собакам, разделенным на 4 группы, вводили препарат, полученный, как описано в примере 2.

В первой группе собак иммунизируют дважды в дозе 5 мг на животное. Собак второй группы вакцинируют дважды в дозе 10 мг. Собакам третьей группы первую иммунизацию проводят в дозе 5 мг, вторую в дозе 10 мг. Четвертая группа сложит контролем.

На 14-й день после второй иммунизации собак заражают протосколексами эхинококков в дозе 5000 на животное.

Через 35 дней после заражения животных забивают и определяют количество гельминтов. Результаты следующие: 1 группа 1-2 гельминта на животное, 2 группа 6-12, 3 группа 2-3, контрольная группа 1574-2510 гельминтов на животное. Установлена оптимальная доза препарата 5 мг на голову, что совпадает с результатом эксперимента, описанного в примере 1. При этом острая токсичность ЛД₅₀ составила 2500 мг/кг массы животного.

Пример 12. Испытание протективных свойств препарата при фасциолезе проводят на ягнятах 3-4- месячного возраста. Препарат, полученный как описано в примере 3, вводят дважды внутримышечно с интервалом в 21 день. В течение пастбищного периода (май-январь) за животными ведутся наблюдения, периодически исследуют фекалии на наличие яиц фасциол. В конце пастбищного периода животных забивают и подсчитывают количество фасциол в печени. Результаты эксперимента приведены в табл. 2. ЛД₅₀ 500 мг/кг.

Пример 13. Для сравнительного изучения протективных свойств различных серий препарата, полученных согласно примерам 1, 5, 6 и 7, проводят испытание на 60 ягнятах текущего года рождения. За месяц до выгона на пастбище проводят двухкратную вакцинацию ягнят согласно схеме, указанной в табл. 3.

Инвазия проводилась на 14 день после вторичной вакцинации в дозе 50 адолескариев на голову. Затем животные были отправлены на пастбище, неблагополочное по фасциолезу. Результаты копрологического исследования, проведенного через 10 мес. выявили наличие лишь отдельных яиц фасциол в I, III, IV, V группах и полное отсутствие таковых у животных во II группе. В контрольной группе в печени каждого животного определяли 30-42 фасциол.

Пример 14. Протективные свойства Пр-1 при дактиокаулезе испытывались на телятах текущего года рождения. Животных иммунизировали дважды с интервалом в 21 день.

Через 14 дней после вторичной иммунизации телят заражали личинками диктиоакул в дозе 500 на животное. На 30-й день животных забивали и определяли количество гельминтов в кишечнике. Результаты представлены в табл. 4.

Пример 15. Протективные свойства вакцины, полученной согласно примеру 1, были проведены в производственных условиях на 11000 ягнят пастбищного содержания.

За 45 дней до выгона на пастбище вакцина вводилась дважды в дозе 5 мг на голову ягнятам первого месяца жизни. Интервал между вакцинами составил 21 день.

Через год после вакцинации при забое 1127 ягнят лишь у 6 животных были обнаружены 3-4 ценуры. Не было обнаружено ни диктиоакул, ни эхинококков, ни фасциол. Экстенсивность инвазии невакцинированных животных составила 80-100%
Пример 16. Протективные свойства вакцины, полученной, как описано в примере 1, были проверены в производственных условиях на 11700 ягнят пастбищного содержания.

Вакцина вводилась дважды в дозе 5 мг на голову ягнятам в возрасте 20-30 дней за 45 дней до выгона на пастбище. Интервал между вакцинациями составил 21 день.

Через 7 мес после вакцинации при забое 5000 ягнят лишь у 25 животных были обнаружены 1-3 диктиокаулы. Не было обнаружено ни эхинококков, ни фасциол. Экстенсивность инвазии невакцинированных животных составила 90-100%
Пример 17. Протективные свойства вакцины, полученной, как описано в примерах 8 и 9, были проверены 20 коровах.

Вакцина вводилась дважды в дозе 30 мг на голову с интервалом между вакцинациями в 21 день. Через 14 дней после второй вакцинации животных заражали личинками диктиокаул в дозе 500 на голову. Через 30 дней был проведен забой животных и определено количество гельминтов в кишечнике. Результаты представлены в табл. 5.

Пример 18. Лечебные свойства вакцины, полученной согласно примеру 1, были проверены на 45 овцах. Перед иммунизацией животных заражают перорально протосколексами эфинококков в дозе 30000 протосколексов на животное. На 30-й день после заражения у животных определяют количество гельминтов в кишечнике. Вакцину вводят в дозе 5 мг на голову пятикратно или десятикратно с интервалом между введениями 3 дня. Через 14 дней после последней иммунизации животных забивают и определяют количество гельминтов в кишечнике. Результаты эксперимента представлены в табл. 6.

Пример 19. Лечебные свойства вакцины, полученной, как описано в примере 1, были проверены в производственных условиях на 500 овец пастбищного содержания.

Вакцина вводилась пятикратно в курсовой дозе 50 мг на голову. Интервал между введениями вакцины составил 3 дня.

Через 7 мес после вакцинации при забое 3000 овец лишь у 50 животных были обнаружены 2-5 диктиокаулы. Не было обнаружено ни эхинококков, ни фасциол. Экстенсивность инвазии невакцинированных животных составила 90-100%
Источники информации принятые во внимание:
1. Анакина Ю.Г. Иммуннопрофилактика эндопаразитарных болезней животных. М. ВНИИТЭИагропром, 1990 г. 54 с.

2. Шишков В.П. "Иммунология и современные проблемы ветеринарии. Проблемы ветеринарной иммунологии". ВАСХНИЛ, Агропромиздат, 1985 г. с. 3.

3. Conto Alarcon C. et al. "Ensayo de vaccination contra babesia bovis utilizando antigenos procedentes de cultivo in vitro". Tech. pec. en Mexico, 1982, N 43, p. 43.

4. Патент Великобритании N 2037163, кл. A 61 K 39/00, 1983
6. Wayne L. et al. Jnfection and Jmmunity 1989, p. 533 539.

5. WO, заявка 95/07100, кл. A 61 K 39/00, 1995.

Использование: биотехнология, вакцина для профилактики и лечения различных форм гельминтозов животных и человека. Сущность изобретения: вакцина против гельминтозов представляет собой конъюгат иммуностимулирующего носителя с протективным антигеном. В качестве протективного антигена она содержит белок, выделенный из соединительных тканей и обладающий гиалурозно-лиазной активностью, имеющей мол. м. 63000 Д, изоэлектрическую точку 5,7. Массовое соотношение антигена и носителя составляет 1:1-10. Вакцина может содержать адъювант, например полиаксидоний, мурамилдипептид, гидроокись алюминия. 2 з. п. ф-лы, 6 табл.

1. Вакцина против гельминтозов, содержащая конъюгат иммуностимулирующего носителя с протективным антигеном, отличающаяся тем, что она представляет собой конъюгат общей формулы

где n 200 2000 количество элементарных звеньев;
q 0,1 0,35 количество алкилированных звеньев;
z 0,4 0,7 количество окисленных групп;
R протективный антиген, представляющий собой белок, выделенный из структур соединительных тканей, обладающий гиалурозно-лиазной активностью и характеризующийся мол.м. 63000 Д, изоэлектрической точкой 5,7,
при массовом соотношении антигена и носителя 1 1 10. 2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит адъювант. 3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит полиоксидоний, и/или мурамилдипептид, и/или гидроокись алюминия.