ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 1998 года по МПК A61K39/04 A61K47/48 

Изобретение относится к медицине, в частности иммунотерапии, особенно для лечения больных туберкулезом.

В настоящее время для лечения больных туберкулезом легких, особенно с выраженным вторичным иммунодефицитом, для повышения эффективности стандартной противотуберкулезной химиотерапии, применяются иммуностимулирующие средства, которые частично нормализуют некоторые сниженные иммунологические показатели и повышают эффективность лечения.

В этих случаях применяются следующие иммуностимуляторы:
1) синтетические - диуцифон, левомизол, нуклеонат натрия и др. [3, 6, 7] ;
2) вещества, выделенные из тимуса - тимолин, T-активин, тимактин и др. [1, 2];
3) вещества, выделенные из бактерий - рибомунил [3, 4, 5].

Кроме того, для повышения эффективности химиотерапии туберкулеза легких используются также методы специфической патогенетической терапии путем применения туберкулина или вакцины БЦЖ, также основанные на учете состояния специфической реактивности организма больных туберкулезом легких.

Однако индивидуальная туберкулино- и БЦЖ-терапия легче переносятся больными на раннем этапе заболевания. Тогда как при прогрессирующем туберкулезе легких, а также при наличии тяжелых форм сопутствующих заболеваний с нарушением функции сердечно-сосудистой системы, печени, почек применение данной специфической терапии противопоказано.

Применение вышеперечисленных препаратов как у впервые выявленных больных, так и у больных с хроническим течением туберкулеза легких, повышало эффективность комплексного лечения по сравнению с группой больных, получавших только химиотерапию. Частично нормализовались показатели иммунологического статуса больных. Однако такие показатели, как процентное выражение Т-лимфоцитов (СД3), пролиферативная активность Т-лимфоцитов на фитогемагглютинин (ФГА), в реакции бластной трансформации (РБТ) и соотношение субпопуляций лимфоцитов Т-хелперы: T-супрессоры (СД4 : СД8), имеющие важное значение в противотуберкулезном иммунитете, остались на исходно низких уровнях. Все это обусловило необходимость поиска новых иммуностимуляторов, полученных из туберкулезных микобактерий.

В более ранние годы показана роль рибосомального материала [3], а также клеточных стенок туберкулезных микобактерий в защите мышей от туберкулеза [10, 11].

В последние годы из микобактерий вакцинного штамма БЦЖ получены антигенные препараты, обладающие выраженным защитным действием на течение туберкулезного процесса у мышей [4, 5].

В связи с этим предлагается иммуномодулирующий препарат, который состоит из цитоплазмы и рибосом микобактерий вакцинного штамма БЦЖ, комплексированных с синтетическим полимером адьювантного действия - полиоксидонием (ЦП - БЦЖ).

За прототип принят препарат рибомунил, являющийся суммарным рибосомальным препаратом, полученным из бактерий, вызывающих патологию верхних дыхательных путей, таких, как klebsiella pneumania, Diplococcus pneumonia, streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzac и мембранного протяоглипана klebsiella pneumonia [9].

Данный препарат с успехом применялся при лечении как больных хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей, так и в последние годы в эксперименте и в клинике у больных туберкулезом легких в комбинированной терапии с противотуберкулезными препаратами [11].

Однако прототип не содержит соединений, выделенных из туберкулезных микобактерий, вследствие чего он не может в полной мере помочь в нормализации измененных показателей противотуберкулезного иммунитета.

Предлагаемый препарат ЦП-БЦЖ, кроме иммуностимулирующего общего действия, обладает специфически направленным стимулирующим действием на основные параметры иммунной системы больного туберкулезом и резко повышает эффективность противотуберкулезной терапии.

Специфическая часть препарата - цитоплазменный и рибосомольный материалы получены в результате дифференциального ультрацентрифуцирования разрушенной культуры микобактерий вакцинного штамма БЦЖ и стандартеризованы по содержанию в них белка.

Иммуностимулирующий носитель - полиоксидоний детально изучен и разрешен для применения в количестве 3 мг и 6 мг для 1-й инъекции (В.Ф.С 42-27-27-96). Обе субстанции, составляющие препарат, соединены между собой донорно-акцепторными связями в единый комплекс.

Результаты проведенного экспериментально-клинического испытания препарата позволяют рекомендовать препарат ЦП-БЦЖ для лечения больных туберкулезом легких.

Проведено 2 эксперимента на мышах линии СВА самцах весом 20 г по 15-20 животных в группе.

Исследовали 7 групп мышей, зараженных вирулентной культурой туберкулезных микобактерий H37Rv в дозе 0,025 мкг на мышь, и 2 группы здоровых не зараженных мышей.

Токсическое действие препарата ЦП-БЦЖ изучено на здоровых мышах. Одноразовое внутривенное введение как исследуемых доз: 0,01; 0,05; 0,5; 5; 50 мкг белка, так и больших доз вплоть до максимальной 100, 200, 500, 1000 и 2000 мкг белка, не вызывало гибели ни одного животного. Мыши оставались живы в течение всего времени наблюдения - до месяца.

Препарат вводили мышам подкожно в заднюю ногу через 2 недели после заражения на фоне уже сформировавшегося туберкулеза 2 раза в неделю в течение 2-х недель (схема 2х2), как самостоятельно (см. табл. 1), так и в комплексе с противотуберкулезной химиотерапией (см. табл. 2).

Здоровые животные получали аналогичное лечение, и на следующий день после прекращения терапии было проведено патоморфологическое исследование печени, легких, селезенки и лимфатических узлов на предмет токсического и иммуностимулирующего действия на клеточном уровне.

В результате, из всех доз препарата, взятых на исследование, только дозы, содержащие 0,5 мкг, 0,05 мкг и 0,01 мкг белка не вызывали дистрофических изменений цитоплазмы клеток печени. Тогда как более высокие дозы препарата вызывали дозозависимое токсическое действие: белковую дистрофию цитоплазмы гепатоцитов, периваскулярный отек и повышенную проницаемость сосудов.

Аллергизирующего действия препарата ЦП-БЦЖ не выявлено. 4-разовое подкожное введение здоровым мышам препарата в дозах 0,5; 0,05 и 0,01 мкг белка по схеме (2х2) не вызывало ни в одном случае реакций анафилактического типа как немедленных, так и через 12, 24 и 48 ч. Аутоантитела к ДНК коллагену, соединительной ткани, общему белку мизлина, тканям легких, печени, почек (коммерческие иммуноферментные тест-системы) не выявлены.

Анафилактические и туберкулиновые свойства препарата ЦП-БЦЖ, как антигена, индуцирующего данное действие в вышеуказанных дозах при в/венном введении сенсибилизированным вакциной БЦЖ морским свинкам, не выявлены.

Канцерогенным действием препарат не обладает, так как известно, что микобактерии БЦЖ, из которых он приготовлен, используются для лечения злокачественных опухолей.

Тератогенные свойства у препарата ЦП-БЦЖ также отсутствуют, так как вакцина БЦЖ многие годы используется для вакцинации детей и взрослых.

Иммуномодулирующее действие препарата ЦП-БЦЖ в дозе 0,05 и 0,01 мкг белка при подкожном введении 2 раза в неделю в течение 2-х недель заключается в следующем.

1. Увеличивает фагоцитарную активность макрофагов.

2. Восстанавливает нарушенные показатели Т-звена иммунной системы.

3. Восстанавливает количество Т-лимфоцитов-киллеров и нормализует соотношение Т-хлеперы / Т-суппрессоры.

4. Восстанавливает пролиферативную активность Т-лимфоцитов in vitro (РБТ).

5. Значительно, статистически достоверно увеличивает среднюю выживаемость больных туберкулезом мышей, леченных как самостоятельно, так и особенно в сочетании со стандартной противотуберкулезной химиотерапией по сравнению с контрольными, нелеченных животных.

1. Фагоцитирующая активность макрофагов через 4 недели после заражения у мышей контрольной группы (без лечения) была резко снижена. Процент фагоцитирующих клеток (ПФК) составил 52%, а фагоцитарное число (ФГ) 1-2 клетки.

В группе мышей, получавших препарат в дозе 0,01 мкг, вызвавшей наибольшие иммуностимулирующее действие, эти показатели приближались к норме: ПФК = 64% (N = 70%), ФЧ =2,5-3 клетки (N = 3-4 клетки).

В терминальном периоде у контрольных мышей ПФК стал еще ниже - 35%, а ФЧ составило 0,3 клетки.

В этот же период у мышей, леченных препаратом, данные показатели были намного выше: соответственно 57% и 2 клетки.

Таким образом, введение больным туберкулезом мышам ЦП-БЦЖ в дозе 0,01 мкг белка в инъекции по схеме 2х2 значительно повышало функциональную активность макрофагов перитонеального эксудата по сравнению с контролем - больные животные без лечения.

2-3. При изучении содержания Т и B-лимфоцитов и их субпопуляции в селезенке мышей было выявлено, что процентное содержание их у больных мышей в контроле изменено: СД3 = 33%, при норме у здоровых мышей N = 35%, из них СД4 = 26% (при N - 24%), СД8 - 7% (при N = 12%) и за счет этого был резко завышен индекс СД4 / СД8 и равнялся 4,5:1 (при N = 2:1).

Количество B-лимфоцитов (TJg) было повышено и составило 65% при N = 60%. Так что на пике туберкулезной инфекции основные параметры противотуберкулезного иммунитета были разбалансированы.

Введение мышам препарата ЦП-БЦЖ в дозе 0,01 мкг белка по схеме (2х2) оказало положительное действие на данные показатели, которые мало отличались от нормы и были равны: СД3 = 34%, СД4 = 23%, СД8 = 11%, СД4/СД8 = 2:1, TJg = 59%. У мышей отмечалось увеличение СД8 - Т-лимфоцитов киллеров с цитотоксическим действием и соответственно снижение и нормализация индекса СД4/СД8, снижение Т-лимфоцитов, хелперов, продуцирующих антитела и соответственно B-лимфоцитов, количество которых нормализовалось.

Таким образом, препарат ЦП-БЦЖ в оптимальной дозе 0,01 мкг является активным противотуберкулезным модулятором: он стимулирует и восстанавливает число Т-лимфоцитов цитотоксического действия, не увеличивая популяции лимфоцитов - продуцентов антител, восстанавливая тем самым нарушенные показатели Т-звена иммунной системы.

4. Индексы пролиферации Т-лимфоцитов на ФГА в РБТ во всех группах зараженных мышей, получавших препарат ЦП-БЦЖ, были статистически достоверно выше, чем в контроле в период гибели животных в этой группе (табл. 1).

Необходимо отметить, что кожные пробы у контрольных мышей в этот период отсутствовали. У мышей, получавших препарат, туберкулиновые пробы выявлялись достаточно отчетливо, что свидетельствует о высоком ответе Т-звена противотуберкулезного иммунитета.

Средняя продолжительность жизни в группах с ЦП-БЦЖ была статистически достоверно выше, чем в контроле (p < 0,05) (табл. 1). Причем разница в 4, 5, 6 и 7 группах по сравнению с контролем была в пределах 20 дней. Процент выживаемости мышей в этих группах также был высоким 65-78%.

Таким образом, результаты, полученные при оценке иммуномодулирующего действия препарата ЦП-БЦЖ, позволили отобрать две дозы: 0,01 мкг и 0,05 мкг белка, обладающие наиболее выраженным иммуностимулирующим действием и не оказывающие токсико-аллергического воздействия на организм мышей.

Во втором эксперименте на зараженных туберкулезом мышах изучена эффективность действия выбранной дозы 0.01 мкг белка препарата ЦП-БЦЖ в сочетании с общепринятой в клинике противотуберкулезной химиотерапией: стрептомицин - 125 мг на 1 кг веса и изониазид - 10 мг на 1 кг веса, а также 2 схемы лечения.

Имелись 4 группы мышей:
1 группа - мыши получали ЦП-БЦЖ 2 раза в неделю в течение 2-х недель (по схеме 2х2) в комплексе с химиотерапией;
2 группа - мыши получали ЦП-БЦЖ 1 раз в неделю в течение 3-х недель (по схеме 1х3) совместно с химиотерапией;
3 группа - мышей лечили 3 недели химиотерапией;
4 группа - контроль - больные мыши без лечения.

После прекращения лечения через день у мышей обследовали иммунологические показатели и оставляли на выживаемость. Как видно из табл. 2, препарат ЦП-БЦЖ в дозе 0,01 мкг белка совместно со стандартной химиотерапией в режиме 1 раз в течение 3-х недель имел как наибольший терапевтический успех (мыши прожили на 38 дней дольше контрольных и на 14 дней дольше мышей, получавших только противотуберкулезную терапию), так и более высокую стимуляцию параметров Т-иммунитета.

Исходя из экспериментально-клинических исследований, предложен препарат, полученный из микобактерий туберкулеза вакцинного штамма БЦЖ в комплексе с синтетическим иммуностимулятором - полиоксидонием, введение которого в дозе 0,01-0,05 мкг белка нормализует в организме больных мышей основные параметры противотуберкулезного иммунитета, при этом не вызывая никаких токсико-аллергических и других негативных реакций. Этот препарат может быть с успехом использован в клинике для лечения больных туберкулезом легких.

Доза препарата в пересчете 1 кг веса - 0,500-2,5 мкг для взрослого человека весом 70 кг должна составить 35-175 мкг на 1 инъекцию.

Рекомендация по введению: подкожно в область плеча 1 раз в неделю в течение 4-х недель.

Препарат рекомендуется для назначения:
1. Впервые выявленным и ранее леченым больным с активным туберкулезом легких, у которых при иммунологическом обследовании обнаружено резкое снижение количества и функциональной активности Т-лимфоцитов, а также при дисбалансе субпопуляций лимфоцитов Т-хелперов и Т-супрессоров.

2. При замедленной клинико-рентгенологической регрессии туберкулезных изменений в легких и одновременном наличии снижения вышеперечисленных признаков Т-звена иммунитета.

Способ применения и дозировка с целью лечения.

Препарат ЦП-БЦЖ назначается больным в виде подкожных инъекций в наружную поверхность плеча в дозе 35 мкг белка в объеме 1 мл. При отсутствии через сутки аллергической реакции после 1-го введения проводится весь курс лечения.

Препарат ЦП-БЦЖ вводят больным 1 раз в неделю в течение 4-х недель. Затем необходимо провести иммунологическое обследование. В случае сохранения низкого уровня вышеописанных показателей или их дальнейшего нарушения необходимо повторить курс лечения препаратом. Повторный курс необходимо провести полностью, как описано, но не раньше, чем через 2 недели. Препарат предварительно разводится в 1 мл физиологического раствора шприцом с соблюдением правил асептики и антисептики.

Реакция на введение: возможна небольшая кожная аллергическая реакция.

Противопоказания: противопоказан беременным и гемотологическим больным.

Форма выпуска: флаконы овальцованные с сухим препаратом. 1 флакон содержит 1 рабочую дозу (0,035-0,175 мг белка в цитоплазме и 3-6 мг полиоксидония). Флаконы упакованы в картонные коробки.

Срок годности 1 год, хранить при 4^oC.

Клинический пример. Больная Е., 28 лет, поступила в клинику ЦНИИТ 1995 г. с диагнозом: инфильтративный туберкулез легких с распадом, микобактерии туберкулеза присутствовали в материале содержимого бронхов в большом количестве. Рентгенологически слева в верхней доле определялся инфильтрат типа перицисеурита с нечеткой верхней границей. На фоне инфильтрации определялись множественные полости распада. Иммунологическое исследование крови выявило иммунодефицит, проявляющийся в снижении индекса СД4 / СД8 1,08, снижении СД3 клеток 50%, показателя РБТ с ФГА 53%, резкое повышение TJg 36%.

На фоне проведенной химиотерапии в течение 4-х месяцев пиразинамидом 1,5 г, рифампицином 0,45 г, этамбутолом 1,2 г в сутки получено медленное обратное развитие процесса; исчезли симптомы интоксикации, прекратилось бактериовыделение, однако рассасывание очаговых и инфильтративных изменений шло медленно.

Иммунологические показатели остались практически без изменения, лишь несколько снизились количество TJg 29%.

Было добровольно проведено лечение ЦП-БЦЖ в дозе 0,035 мг и 1 мг по 4 раза в течение 5-го месяца болезни (1 инъекция подкожно в область плеча) совместно с химиотерапией. Через 5,5 месяцев рентгенологически отмечалось активное рассасывание очаговых и инфильтративных изменений, закрытие полостей распада и нормализация иммунологических показателей: СД3 60%; TJg 20%; СД4/СД8 1,7; РБТ с ФГА 63%.

Больная была выписана на амбулаторное лечение.

Источники информации
1. Арион В.Я. кн.: Итоги науки и техники. Серия: Иммунология. 1982. Т.Ю. с. 45-53.

2. Арион В. Я. , Иванушкин Е.Ф. Принципы иммунокорригирующей терапии препаратом тимуса Т-активин. Хирургия, 1984, N 11, с. 23-26.

3. Баранова Т.В. Роль нуклеината Na в комплексном лечении больных туберкулезом легких: Автореферат дисс. канд. мед. наук.- М.: 1986.

4. Романова Р.Ю. Иммунологический анализ и антигенные свойства поверхностных белков микобактерий БЦЖ. Сб. трудов "Актуальные вопросы лабораторной диагностики туберкулеза в эксперименте и клинике".- М.: 1989, т. III, с. 122-126.

5. Романова Р. Ю. Иммуногенные свойства и диагностическая ценность антигенов микобактерий БЦЖ: Автореферат дисс. доктора биологических наук. М.: 1991.

6. Хоменко А.Г., Инсанов А.Б. Иммунохимиотерапия левамизолом и диуцифоном в комплексном лечении больных хроническим деструктивным туберкулезом легких. Пробл. туб. 1984. N 9, с. 15-18.

7. Хоменко А.Г., Инсанов А.Б. Эффективность терапии антибактериальными препаратами в сочетании с левамизолом и диуцифоном деструктивного туберкулеза легких в эксперименте. Пробл. туб. 1984. N 4, с. 55-59.

8. Хоменко И. С. Течение деструктивного туберкулеза легких у больных с иммунодефицитом. Автореферат дисс. докт. мед. наук. М.: 1983.

9. Dussourd D'Hinterland U., Serre H. Preparation de vaccins a base de fractions ribosomales antigenigues. Brevet Pierre Fabre S.A. 1973, N 73, p. 439-457.

10. Youmans A. S. , Youmans G.P. Immunogenic activity of a ribosomal fraction obtained from M. tuberculosis. Journ Bacteriol. 1965. 1989, p. 1291-1298.

11. Youmans A.S., Youmans G.P. Immunogenic Mycjbacterial ribosomal and ribonucleic acid preparation. Chemical and physical characteristics. Infect. and Immunity. 1970. N 2, p. 659-668.

Изобретение относится к медицине. Предложен препарат - ЦП-БЦЖ, специфический иммуномодулятор, содержащий вытяжку из туберкулезных микробактерий вакционного штампа БЦЖ, комплексированную с полиоксидонием - синтетическим иммуностимулятором при соотношении (1:30) - (1:120). Сочетание данного препарата со стандартной противотурбекулезной химиотерапией превышало эффективность последней за счет восстановления нарушенных показателей Т-звена иммунитета: восстанавливалось количество Т-лимфоцитов-киллеров и нормализовалось соотношение Т-хелперы / Т-суппрессоры, восстанавливались пролиферативная активность Т-лимфоцитов in vitro и фагоцитарная активность макрофагов, а также увеличивалась средняя продолжительность лечебных мышей по сравнению с нелеченными и леченными только одной противотурбекулезной химиотерапией. 2 табл.

Лекарственное средство - специфический иммуномодулятор, представляющий собой соединение, состоящее из специфического антигенного комплекса и синтетического иммуностимулятора, отличающееся тем, что в качестве специфического антигенного комплекса использован материал цитоплазмы и рибосом микобактерий вакцинного штамма БЦЖ, а в качестве иммуностимулятора - Полиоксидоний в соотношении микобактериальный белок - Полиоксидоний от 1:30 до 1: 120.