СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БРУЦЕЛЛ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/68 A61K39/10 

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается способа дифференциации различных вакцинных штаммов бруцелл, возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота и может быть использовано в научно-исследовательских и ветеринарных лабораториях.

Разнообразие видов, большой диапазон фенотипической изменчивости бруцелл создают значительные трудности в дифференциации и идентификации данного возбудителя.

В последнее время для идентификации микроорганизмов наряду с морфофизиологическими и культурально-биохимическими критериями начали использовать результаты сравнительного изучения структуры нуклеиновых кислот (см. I.ben. Microbiol. 1987, N 6, p.1423-1430;I.Infec.Desease, 1988, N 2, p.280-286). С этой целью применяют метод ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации с использованием радиоактивных изотопов и биотинилированных реперов (см. Abst.Annu.Meet.Amer. Soc. 1987, p. 113-121).

Ряд авторов (см. Abst. Annu.Meet.Amer.Soc. 1987, p. 109; Микробиология, 1988, N 10, с. 110-121) пытались использовать для идентификации бруцелл метод ДНК-ДНК гибридизации и установили, что все виды и штаммы бруцелл составляют генетически однородную группу. В связи с этим можно заключить, что метод ДНК-ДНК гибридизации не позволяет дифференцировать бруцеллы по видам и штаммам.

Jtffreys A.J.et al. (см. Nature, 1985, v. 314, 316, p. 67-73, 76-79) была выделена гипервариабельная, минисателлитная ДНК человека. С использованием этой ДНК в качестве меченой пробы для блот-гибридизационного анализа суммарной ДНК человека была разработана новая технология, получившая название геномной "дактилоскопии", которая позволяет получить для каждого индивидума специфическую и генетически закрепленную картину гибридизации.

Недавно было обнаружено, что ДНК фага М13 или полученные на ее основе рекомбинанты (см. Science, 1987, v. 235, p. 683-684; Генетика, 1988, N 2, т. 24, с. 227-238) могут быть использованы в качестве эффективных проб для геномной "дактилоскопии".

В ранее проведенных исследованиях (см. Генетика, 1990, N 1, т. 26, с. 130-133) нами было показано наличие гипервариабельных локусов в геноме бруцелл и проведена дифференциация видовой принадлежности их при помощи рестриктазы Eco 641 и М13.

Наиболее близким по технической сущности является способ дифференциации возбудителей бруцеллеза животных, предусматривающий выделение ДНК из исследуемых бактерий, расщепление ее ферментом рестрикции Eco 641, перенос полученных фрагментов на фильтры с последующим закреплением их на фильтрах, гибридизацией с меченной пробой М13 и выявлением полученных результатов.

Недостатком рассматриваемого способа является невозможность дифференциации штаммов бруцелл при использовании рестриктазы Eco 641. Данный фермент дает возможность установить только видовую принадлежность бруцелл, но не штаммовую.

Целью изобретения является возможность дифференциации различных вакцинных штаммов бруцелл и патогенного штамма возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота на основе применения ДНК-зонда 5'-СCAССAССAССAССAС-3' и рестриктазы Nco 1.

Поставленная цель достигается тем, что в известный способ дифференциации возбудителей бруцеллеза животных, предусматривающий выделение ДНК из исследуемых бактерий, расщепление ее ферментом рестрикции, перенос полученных фрагментов на фильтры с последующим закреплением их на фильтрах, гибридизацией с меченой пробой и выявлением полученных результатов, согласно изобретению в качестве фермента рестрикции используют рестриктазу Nco 1, перенос фрагментов ДНК на фильтры осуществляют в электрическом поле, закрепляют их на фильтрах путем облучения ультрафиолетом, в качестве пробы для гибридизации используют синтетический олигонуклеотид 5'-CACCACCACCACCAC-3', комплементарный гипервариабельным последовательностям ДНК бруцелл, и дифференцируют вакцинные и патогенные штаммы бруцелл.

Способ осуществлялся следующим образом. Культуры клеток бруцелл патогенного штамма 544 и вакциинных штаммов 19, 82 и УФ, выращенных на пептонно-печеночном глюкозо-глицериновом агаре, смывали 3 мл буфера sTE-1 (0,1 M NaCl, 0,01 M трис-HCl, 0,001 M ЭДТА, pH-7,8). Осадок ресуспендировали в 1 мл этого же буфера, добавляли сухой лизоцим (14 мг/мл). Тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37 ^oC в течение 30 мин. Затем добавили 100 мкл водного раствора проназы (1 мг/мл) и 100 мкл 10-го додецилсульфата натрия (SDS) и инкубировали при температуре 50-60 ^oC в течение 30-40 мин. По окончании лизиса клеток в смесь добавили 5М NaCl до конечной концентрации 1М. Далее в эту смесь добавили равный объем, насыщенный буфером (pH-7,4) фенола. Тщательно перемешивали и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Недостаток отбирали в другую пробирку и данную процедуру повторяли 3 раза. Дальнейшую очистку смеси от белков осуществляли фенол-хлороформом и хлороформом. Манипуляции были такие же, как и при обработке фенолом.

ДНК из раствора осаждали добавлением 2,5 объема 96-го этанола при комнатной температуре. Затем осевший ДНК промывали 2 раза 70-ным этиловым спиртом и растворили в бидистилированной воде. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически. Далее проводили рестрикцию ДНК ферментом Nco 1, электрофорез и перенос фрагментов ДНК на капроновые фильтры. Для этого очищенный ДНК в количестве 7 мкг вносили в эпиндорфскую пробирку, туда же добавили 3 мкл 10х буфера рестрикции для Nco 1 (33 мМ трис-HCl, pH 7,9,10 мМ MgCL₂, 66 мМ ацетат калия, 0,1 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 0,1-ный дитиотриттол), 3-10 единиц активности фермента Nco 1 и объем смеси довели до 30 мкл бидистиллированной водой. Рестрикцию проводили при 37 ^oC в течение 4 ч. Реакцию остановили нагреванием смеси до 100 ^oC в течение 3-5 мин в водяной бане.

ДНК-фрагменты осаждали этанолом, высушивали и растворяли в бидистилированной воде. Затем проводили электрофорез в 1,4-ном агарозном геле при напряжении 0,6 В/см в течение 16-20 ч. ДНК окрашивали раствором этидий бромида в течение 10 мин. Для переноса фрагментов ДНК из агарозы в капроновые фильтры ДНК в агарозном геле дегатурировали инкубированием ее в 0,5 М NaOH с 1,5 NаCl в течение 1 ч. Далее промывали дистиллированной водой и вновь инкубировали в 0,5М трис-HCl, pH-8,0 с 1,5М NaCl в течение 1 ч с последующей отмывкой в дистиллированной воде.

Блоттинг проводили между двумя графитовыми пластинами, подключенными к источнику постоянного тока. Для этого на нижнюю пластину накладывали 4 слоя смоченных в буфере 1х SSC фильтровальных бумаг, на них помещали гель, на гель клали вырезанную по размеру геля капроновый фильтр (размер пор 0,22 мкм). Сверху капронового фильтра помещали 2 слоя фильтровальной бумаги, смоченной в 1х SSC. Обе пластины подключили к источнику тока (нижняя пластина подключается к "-") и давали напряжение 100 В в течение 2 ч.

После блоттинга капроновый фильтр выдерживали 5 мин в 6х SSC, подсушивали и облучали по 2 мин под ультрафиолетовыми лучами с обеих сторон.

Дальнейшим этапом работы являлось проведение гибридизации, где в качестве зонда применялся синтетический олигонуклеотид 5'-CACCACCACCACCAC-3'. К 1 мкг синтетического олигонуклеотида (CAC)₅ добавили 10 мкл буфера А (10х-0,5М трис-HCl,pH-7,6, 0,1M MGCl₂, 50 мМ дитиотриттол, 1 мМ спермидин и 1мМ ЭДТА), 50 пмоль (150 мкКи /[Y³²-P]dATP /уд. акт. 3000 Ки/ммоль), 10-20 ед. Т4- полинуклеотидкиназы и бидистиллированной воды до 50 мкл. Инкубировали при 37 ^oC в течении 30 мин. Реакцию остановили добавлением 2 мкл 0,5 ЭДТА. Экстрагировали один раз фенол-хлороформом и осадили ДНК холодным этанолом. Вновь растворили в 50 мкл буфера ТЕ, pH-7,9. ДНК-зонд отделили от невключившихся трифосфатов обычной хроматографией на микроколонках с G-50. Удельную активность зонда определяли на сцинтиляционном счетчике, которая была равна в среднем 2•10⁵±1•10⁵ имп/мин/мкг ДНК.

Для проведения реакции гибридизации капроновые фильтры с фрагментами ДНК помещали в небольшие плотно закрывающиеся кюветы и заливали 20 мл предгибридизационной смесью. Состав предгибридизационной смеси: 20х SSC- 10 мл, 20-ный SDS 0,2 мл, 50х Denchard 5,0 мл, дистиллированная вода 4,8 мл. Затем инкубировали при 37 ^oC в течение 1 ч. После этого предгибридизационную смесь сливали и вносили в кювету гибридизационную смесь в количестве 10 мл с меченым зондом. Инкубировали при 37 ^oC в течение 3-4 ч. После гибридизации фильтры отмывали раствором следующего состава: 20х SSC- 50 мл, 20-ный SDS 5 мл, дистиллированная вода 945 мл.

Вначале фильтры 1 раз отмывали при комнатной температуре в 200 мл отмывочного раствора, затем 1 раз в 200 мл этого же раствора при 37 ^oC в течение 30 мин и еще 2 раза этим же раствором при комнатной температуре.

Далее проводили радиоавтографию. Фильтры высушивали и помещали между двумя пластинками рентгенпленки РМ-В. Все это вложили в рентгенокассету с усиливающими экранами и оставили на ночь при температуре -70 ^oC в холодильнике. По истечении времени экспозиции пленку проявляли и делали фотоснимки (см. чертеж).

На чертеже показана радиоавтограмма (CAC)₅ комплементарных гипервариабельных участков ДНК вакцинных (19, 82, УФ) и патогенных (544) штаммов бруцелл, расщепленных рестриктазой Nco I.

В радиоавтографическом снимке показаны расположения фрагментов ДНК, содержащих гипервариабельные локусы класса (CAC)₅. Как видно из снимка, ДНК патогенного штамма 544 содержит 7 фрагментов. Мажорные фрагменты расположены на уровне 6,7, 4,3, 2,3 и 0,125 тысяч пар нуклеотидов (тыс. п.н.) Вакцинный штамм 19 имеет мажорные полосы в областях 3,0, 2,3, 2,0 и 0,56 тыс. п.н. Штамм 82 отличается от патогенного наличием двух мажорных фрагментов в области 2,0 и 1,0 тыс п.н. Недавно селекционированный штамм УФ отличается от остальных штаммов бруцелл большим количеством гипервариабельных локусов (14 фрагментов), которые расположены на радиоавтограмме специфично для этого вакцинного штамма.

Использование: ветеринарная биотехнология, разработка препаратов для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Сущность: для дифференциации патогенных и вакцинных штаммов бруцелл выделяют ДНК из исследуемых микроорганизмов, расщепляют ее с помощью рестриктазы N_co1 и гибридизуют с синтетическим олигонуклеотидным зондом. Известные способы позволяют устанавливать только видовую принадлежность бруцелл. 1 ил.

Способ дифференциации бруцелл крупного рогатого скота, предусматривающий выделение ДНК из исследуемых бактерий, расщепление ее ферментом рестрикции, перенос полученных фрагментов на фильтры с последующим закреплением их на фильтрах, гибридизацией с меченой пробой и выявлением полученных результатов, отличающийся тем, что в качестве фермента рестрикции используют рестриктазу Nсо 1, перенос фрагментов ДНК на фильтры осуществляют в электрическом поле, закрепляют их на фильтрах путем облучения ультрафиолетом, в качестве пробы для гибридизации используют синтетический олигонуклеотид 5'- САССАССАССАССАС-3', комплементарный гипервариабельным последовательностям ДНК бруцелл, и дифференцируют патогенные и вакцинные штаммы бруцелл.