ДНК-последовательности, предназначенные для вакцинации человека и животных от развития заболевания, вызванного штаммами Brucella Российский патент 2025 года по МПК A61K39/10 C12N15/86 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии, в частности к улучшенным ДНК-вакцинам для человека и животных.

Уровень техники

Для разработки вакцин против бруцеллёза использовались различные подходы. Относительно успешными оказались только вакцины на основе ослабленных живых штаммов бруцелл, которые, тем не менее, имеют много серьёзных недостатков. Было предпринято довольно много попыток разработать другие методы вакцинации против бруцеллёза, которые рассмотрены ниже.

Вакцины на основе генетически модифицированных штаммов бруцелл.

Для уменьшения вирулентности живых вакцин были проведены работы по генетической модификации бруцелл, с целью ещё больше ослабить их вирулентность и убрать боковую полисахаридную О-цепь (для предотвращения ложноположительных результатов при тестировании животных на бруцеллёз). В качестве примера можно привести работы по инактивации генов биосинтеза пуринов purL, purD и purE (Alcantara et al, 2004), инактивации гена-транспортёра жирной кислоты липида А (Ferguson et al, 2004), получение штаммов с мутациями в генах hemH, virB, pgk (соответственно, Almirón et al, 2001; Hartigh et al ,2004; Trant et al, 2010). Испытания на модельных животных показали эффективность таких штаммов, равную или даже большую, чем у штамма RB51. К сожалению, не было проведено испытаний этих вакцин на целевых животных, поэтому трудно сказать, насколько эти штаммы лучше, чем существующие вакцины. Можно предположить, что в целом генетически модифицированные штаммы бруцелл обладали примерно теми же недостатками, что и живые аттенюированные штаммы, используемые в настоящее время.

Вакцины на основе клеточных фракций и лизатов.

Такие вакцины были одними из первых попыток создать безопасную вакцину против бруцеллёза. Для изготовления вакцин использовались внешние мембранные белки (Montaraz et al, 1986), растворимые и нерастворимые экстракты клеточной оболочки (Dzata et al, 1991), убитые клетки (Blasco et al, 1993), периплазматические белки и белки, экстрагируемые с помощью соли (Tabatabai et al, 1992). И хотя такие вакцины действительно были безопасны, они не стали популярны из-за низкого уровня защиты, локальных реакций в месте введения и серологической проблемы (вакцинированные животные дают положительный сигнал при тестировании на бруцеллёз). Можно предположить, что большинство белков в экстрактах не способны вызвать протективный иммунный ответ и являются "балластом". Удельная доля "полезных" компонентов невелика и неспособна сформировать эффективную защиту.

Вакцины на основе отдельных белков.

Получение вакцин на основе очищенных белков является апробированным подходом для изготовления вакцин и используется, например, для приготовления вакцин против гепатита В и папиломавируса человека. Ряд белков бруцеллы был протестирован на способность формировать защитный иммунитет при иммунизации животных. Были протестированы белки P39, бактериоферритин, L7/L12, lumazine synthase, Bp26, InfC, L7/L12, Omp16 и Omp19, Omp25, Omp28, Omp31, P39, S-adenosyl-l-homocysteine hydrolase, DnaK and SurA, SodC (например, Cassataro et al, 2005; Al-Mariri et al, 2001; Pasquevich et al, 2008, Muñoz-Montesino et al, 2004) и некоторые другие. Как правило, необходимо использование адъюванта для усиления иммунного ответа против вводимых белков. Основной недостаток таких вакцин - относительно невысокая защита и необходимость использования множественных доз вакцины (Yang et al, 2013). Многократное введение вакцины характерно при использовании белков для иммунизации. Довольно сложно сравнить результаты использования различных белков в качестве вакцины, так как на конечную эффективность, кроме самого белка, влияет много других параметров, таких, как выбор адъюванта, кратность и доза введения, способ введения, выбор модели для тестирования и др. Тем не менее, на основе этих работ можно сделать ряд важных выводов. Некоторые белки, независимо от использования адъювантов, были неспособны вызвать иммунный ответ. Некоторые белки вызывали иммунный ответ, что, однако, не приводило к защите от бруцеллёза. Анализ этих работ позволяет выделить белки (например, Omp31, omp16, SOD, L7/L12+), которые, как правило, позволяют добиться формирования защитного иммунитета у животных (пусть и не такого сильного, как при использовании живых вакцин). Одновременное использование нескольких белков для иммунизации приводило к смешанным результатам. В некоторых случаях не наблюдалось синергичного или даже аддитивного эффекта, однако есть примеры, когда одновременное использование двух белков усилило протективную эффективность вакцины (Cassataro et al, 2007).

Векторные вакцины против бруцеллёза.

Из-за сходства в механизмах инфекции ослабленный штамм внутриклеточного патогена Salmonella был модифицирован так, чтобы экспрессировать один из белков бруцеллы. При иммунизации мышей образовывались антитела против белка бруцеллы, однако клеточный иммунный ответ (что необходимо для эффективной вакцины) был очень небольшой (Stabel et al, 1993). Для усиления иммунного ответа было предложено использовать сальмонеллы, экспрессирующие "коктейль" из белков бруцеллы - белки SOD, BLS, PrpA, и Omp19. Также для усиления иммунного ответа использовались очищенные липополисахариды. На модельных животных было показана эффективность такой вакцины, сравнимая с эффективность вакцины RB51 (Lalsiamthara et al, 2017), однако данные о дальнейших испытаниях этой вакцины на целевых животных отсутствуют.

Другой подход к созданию векторных вакцин против бруцеллёза основан на модификации штаммов Lactococcus lactis. Введение в этот штамм генов, кодирующих белок теплового шока бруцеллы GroEL, привело к созданию ещё одной векторной вакцины (Miyoshi et al, 2006), однако данные о её испытании на целевых животных также отсутствуют. Для создания векторной вакцины использовались и вирусные вектора. Так, были созданы модифицированные вирусы оспы, экспрессирующие белки бруцеллы HtrA, GroEL, GroES, Cu-ZnSOD, и YajC. Было показано формирование иммунного ответа против этих антигенов, однако уровень защиты был невысок (Toth et al, 1995).

РНК-вакцины.

Технология вакцинации на основе РНК, кодирующей целевые белки, была разработана относительно недавно и в настоящее время оценивается некоторыми экспертами как "новая эра" в вакцинологии (Pardi et al, 2018; Esteban et al, 2021).

Первоначально к вакцинам на основе РНК было довольно скептическое отношение, связанное, в первую очередь, с нестабильностью РНК, её высокой неспецифической иммуногенностью и неэффективной доставкой в клетки. Однако в ходе дальнейших разработок удалось найти решение этих проблем. Современные РНК-вакцины обладают рядом неоспоримых достоинств:

1) Безопасность. РНК не способна вызывать инфекцию или приводить к инсерционному мутагенезу из-за встраивания в геном хозяина. Это биодеградируемая молекула, не вызывающая существенных побочных эффектов.

2) Эффективность. Имеющиеся данные указывают на то, что РНК-вакцины способны формировать сильный защитный иммунитет даже после 1-2 инъекций. Причина эффективности РНК-вакцин заключается, по-видимому, в их способности трансфецировать антиген - презентирующие клетки и способности РНК вызывать неспецифическую активацию иммунной системы, действуя, таким образом, как сильный адъювант (например, Pardi et al, 2018).

3) Скорость создания производства. С момента публикации генома коронавируса до первых испытаний РНК-вакцины на людях прошло 2 месяца.

В настоящее время в литературе нет данных о создании РНК-вакцин для борьбы с бруцеллёзом. Несмотря на несомненную эффективность данной технологии, стоит отметить, что у РНК - вакцин на настоящий момент есть существенный недостаток, который может помешать их использованию в ветеринарии - высокая себестоимость. По разным оценкам, себестоимость одной вакцинации РНК-вакциной от ковид-19 составляет 2.5-10 доллара, соответственно, продажная стоимость должна быть выше примерно в 2 раза. Такая цена на вакцину может быть приемлема при вакцинации людей, но слишком высока для вакцинации животных.

ДНК-вакцины

ДНК-вакцинация заключается во введении животным ДНК (возможно, в комплексе с трансфецирующим агентом), кодирующей белки бруцеллы. Используются в основном те же белки, что и при разработке белковых вакцин. Считается, что ДНК-вакцины обычно вызывают более слабый иммунный ответ, чем белковые вакцины. Возможно, это связано с низкой эффективностью доставки ДНК в клетки in vivo. Тем не менее, в некоторых случаях ДНК-вакцины против бруцеллёза обеспечивают сравнимую (Cassataro et al, 2005) или даже более сильную защиту (Velikovsky et al, 2002), чем белковые вакцины. Важный вывод, следующий из сравнения работ по применению белковых и ДНК-вакцин, заключается во влиянии типа вакцины на тип вырабатываемого животным иммунного ответа. Например, BLS, экспрессируемый ДНК-вакциной, не вызывает образования IL-10 продуцирующих клеток, тогда как белок BLS вызывает. Это может иметь значение, поскольку IL-10 может подавлять защитный иммунитет во время первичной инфекции B. abortus (Fernandes et al, 1995). Кроме того, после доставки Omp31 с помощью ДНК-вакцины стимулируются слабый гуморальный ответ и сильный CD8+ клеточный ответ. Это контрастирует с доставкой рекомбинантного белка, при которой CD4+ Th1 клетки обеспечивают иммунную защиту (Cassataro et al, 2005a). Другой важный вывод, который следует из работ по созданию ДНК-вакцин, заключается в целесообразности совместного использования различных белков бруцеллы для иммунизации. При создании ДНК-вакцины нетрудно сделать варианты ДНК, кодирующие разные белки бруцеллы, и протестировать целесообразность их совместного использования. В нескольких работах было показано, что совместное использование двух и более белков усиливает защитное действие вакцины. Так, одновременное введение нескольких плазмид, экспрессирующих BCSP31, SOD и L7 / L12, вызывало в 10-20 раз более высокие уровни антител и большую защиту против Brucella, чем вакцина S19 (Yu et al, 2007).

Производство ДНК-вакцин представляет собой достаточно простой процесс, который может быть практически полностью реализован с использованием отечественных легкодоступных реактивов. Себестоимость такого производства невысока, что делает её привлекательной для ветеринарии. Это хорошо известная платформа, её эффективность доказана наличием пяти одобренных к применению вакцин. Возможно, именно в силу простоты производства и низкой себестоимости ДНК-платформа была выбрана для создания вакцины против Covid-19, одобренной недавно в Индии, где доходы населения невелики (Lancet, doi: 10.1016/S0140-6736(22)00151-9). Недостатком ДНК вакцин считается трудность получения сильного иммунного ответа, что связано с низкой эффективностью трансфекции тканей и, в особенности, антиген-презентирующих клеток, непродолжительное время синтеза целевого белка (3-5 дней) и относительно малая иммуногенность ДНК, что часто приводит к необходимости использовать адъювант. В последние годы были предложены подходы к повышению эффективности ДНК-вакцин, такие как множественная иммунизация (в случае индийской ДНК-вакцины от Covid-19 трёхкратная инъекция с интервалом ~28 дней), использование нового поколения векторов, обеспечивающих намного более длительное время синтеза целевых белков, включение в состав ДНК-вектора CpG последовательностей и/или последовательностей для синтеза дополнительных белков для стимуляции иммунной системы и некоторые другие подходы.

Вектора, используемые для создания ДНК - вакцин

Подавляющее большинство ДНК-вакцин сделаны на базе обычных плазмид. Известно, что такие плазмиды содержат в своём составе ориджин репликации и ген устойчивости к антибиотику бактериального происхождения. Такие последовательности узнаются в эукариотических клетках с последующим подавлением экспрессии этих и близлежащих генов. Этим объясняется непродолжительное время работы таких плазмид - обычно 3-4 дня. Кроме того, эти элементы могут оказывать негативное влияние на стабильность, доставку ДНК в клетки и эффективность вакцины, а также могут создавать проблемы с безопасностью, из-за возможности горизонтального переноса маркеров устойчивости к антибиотикам, находящимся в составе плазмид, популяциям кишечных бактерий хозяина. В последнее время появился ряд подходов, позволяющих избавиться от описанных выше недостатков. Ниже рассмотрены наиболее перспективные варианты.

Модификации гена устойчивости к антибиотику

Как уже описывалось выше, протяжённые последовательности бактериальной природы, такие как гены устойчивости к классическим антибиотикам (канамицину, ампициллину) узнаются в клетках млекопитающих, что приводит к подавлению экспрессии целевых генов. Эта проблема была решена путем разработки маркеров селекции на основе небольших бактериальных РНК. Некодирующие РНК-маркеры очень малы (<200 пар оснований), что уменьшает общий размер вектора; это является преимуществом, поскольку эффективность векторной трансфекции обратно пропорциональна размеру вектора, возможно, потому, что меньшие векторы более устойчивы к силам сдвига, связанным с доставкой, и могут иметь лучшую ядерную локализацию, поскольку они более подвижны в цитоплазме. Кроме того, было показано, что некоторые бактериальные области, кодирующие белки устойчивости к антибиотикам, резко снижают экспрессию вектора. Например, ген устойчивости к канамицину NPT-II (kanR), полученный из TN5, в бактериальной области вектора pVAX1 значительно снижает экспрессию трансгена. Три группы исследователей продемонстрировали, что репрессию экспрессии трансгена, опосредованную бактериальной областью pVAX1, можно облегчить путем замены гена kanR или маркером селекции на основе тРНК, или маркером селекции с помощью антисмысловой РНК (RNA-OUT), или маркером селекции антисмысловой РНК эндогенного происхождения pUC RNAI.

Миникольца.

Миникольца представляют собой кольцевые молекулы ДНК, в которых отсутствуют части бактериального происхождения, такие как ориджин репликации и ген устойчивости к антибиотику. Конечно, подобные кольцевые молекулы не способны сами амплифицироваться в бактериальных клетках, поэтому их получают из родительской плазмидной ДНК, в которой целевые последовательности ограничены сайтами рекомбинации. Такая плазмидная ДНК наращивается в специальном штамме E. coli, содержащим в составе геномной ДНК последовательности, кодирующие рекомбиназу под контролем индуцируемого арабинозой промотора. После наработки бактериальной биомассы, содержащей родительскую плазмиду, добавляют индуктор (арабинозу), в результате чего происходит удаление из плазмиды последовательностей ориджина репликации и гена устойчивости к антибиотику и получаются так называемые миникольца. Было показано, что миникольца обеспечивают намного более продолжительную экспрессию целевых генов, чем в случае использования обычных плазмид. Также зачастую несколько повышается уровень экспрессии. Недостатком технологии миниколец является наличие побочных продуктов рекомбинации, от которых трудно избавиться, и сравнительно невысокий выход миниколец. Кроме того, следует учитывать, что слишком длительная экспрессия небольших количеств антигена может привести к развитию толерантности, что, конечно, нежелательно. Имеются многочисленные данные об эффективности данной платформы для производства вакцин (например, 10.1016/j.vetmic.2022.109474, обзор 10.1007/978-1-4939-2727-2_18). Эта технология очень хорошо изучена и есть примеры проведения клинических испытаний препаратов на основе миниколец.

Мини-интронные вектора и наноплазмиды

Как уже отмечалось, миникольца нарабатываются на относительно невысоком уровне, что повышает себестоимость их производства. Невысокий выход миниколец связан с необходимостью этапа рекомбинации. В ходе решения данной проблемы были разработаны новые технологии, такие как мини-интронные плазмиды и наноплазмиды. В мини-интронном векторе ген устойчивости к антибиотику и ориджин репликации расположены в интроне, находящемся в 5' нетранслируемом районе целевого гена (Lu J, Zhang F, Kay MA. A mini-intronic plasmid (MIP): a novel robust transgene expression vector in vivo and in vitro. Mol Ther 2013; 21: 954-63; PMID: 23459514; https://doi.org/10.1038/mt.2013.33). Добавление такого интрона не меняет аминокислотную последовательность целевых генов, и практически не влияет на регуляцию их экспрессии. Активная транскрипция через бактериальные последовательности способствует поддержанию транскрипционно - активного варианта хроматина и предотвращает ингибирование экспресии целевых генов. Стоит отметить, что поддержание активного хроматина будет наблюдаться только в том случае, если бактериальные последовательности не слишком протяжённые. Поэтому в мини-интронных векторах используют маркеры устойчивости к антибиотикам на основе РНК. Несколько другой подход к борьбе против подавления экспрессии целевых генов используется в наноплазмиде (Williams JA, Paez PA. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Apr 7; 32: 494-503. doi: 10.1016/j.omtn.2023.04.003). В ней используются очень маленький по протяжённости ориджин репликации R6K и маркёр селекции RNA-OUT. В сумме длина бактериальных последовательностей составляет менее 500 пар оснований. Кроме того, была проведена оптимизация данных последовательностей с целью убрать элементы, которые вызывают ингибирование экспрессии. По своим свойствам мини-интронные вектора и наноплазмиды схожи: они позволяют кардинально увеличить время экспрессии целевых генов, при этом технология их производства довольна проста и экономически выгодна. Кроме того, оказалось, что мини-интронные вектора и наноплазмиды позволяют достигать более высоких уровней экспрессии целевых генов, по сравнению с обычными плазмидами. Недостатком данных подходов является относительно недавняя патентная защита и необходимость использовать для их наработки специальные бактериальные штаммы, которые в настоящее время труднодоступны для академического сообщества.

ДНК-кодируюмая самоамплифицирующающаяся РНК

Ещё один перспективный подход к экспрессии целевых ДНК последовательностей заключается в создании плазмиды, в которой предусмотрен синтез самоамплифицирующейся РНК (саРНК) альфавируса. Конкретная структура таких плазмид может несколько отличаться, в зависимости от того, какой конкретно вирус из семейства альфавирусов используется в качестве основы для саРНК. Так, плазмида, кодирующая саРНК на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), кроме гена устойчивости к антибиотику и ориджина репликации, содержит, как правило, следующие последовательности: для инициации транскрипции РНК модифицированный CMV промотор, в котором непосредственно после места старта транскрипции начинаются 5' нетранслируемые последовательности вируса VEE. Далее расположены последовательности, кодирующие неструктурные белки nsp1-nsp4 вируса VEE, которые необходимы для амплификации РНК. После последовательностей, кодирующих белки nsp1-nsp4, расположен так называемый субгеномный промотор, за которым следуют последовательности, кодирующие целевые белки, а после них - 3' нетранслируемые последовательности VEE, заканчивающиеся небольшой (15-30 нуклеотидов) полиА последовательностью. Для формирования правильной последовательности 3' конца после после полиА последовательности идёт последовательность рибозима (например, рибозима HDV). Рибозим обеспечивает расщепление синтезированной РНК, в результате чего участок рибозима отделяется и остаётся саРНК с интактным полиА хвостом.

Как известно, саРНК за счёт самоамплификации обеспечивает очень высокий уровень синтеза целевых белков. Кроме того, большое количество саРНК в клетке запускает активацию рецепторов иммунной системы, и обеспечивает, таким образом, так необходимую дополнительную неспецифическую стимуляцию иммунной системы. Такой подход использовался для разработки ДНК вакцин против ряда вирусных заболеваний (в том числе CVID-19 DOI: 10.1038/s41598-021-82498-5), туберкулёза и рака (см. обзор https://doi.org/10.3390/vaccines7010029). Ещё одним немаловажным достоинством данного подхода является многократное уменьшение количества ДНК, необходимое для вакцинации, что может быть немаловажно в случае крупных животных. Незначительным недостатком является большой размер ДНК-конструкции и сложность её создания.

Сущность изобретения

Целью заявителя является создание мультивалентной вакцины, которая будет обеспечивать эффективный защитный и иммунный ответ против бруцеллеза человека и животных.

Объектом изобретения является экспрессионная ДНК-кассета, которая может быть включена в состав экспрессионных плазмид (пример 2) или миникольца (пример 3), и способная индуцировать иммунный ответ против бруцеллёза путём экспрессии белков бруцеллы. Эффективность ДНК-вакцин улучшают путем одновременного использования шести антигенов бруцеллы.

По определению, ДНК-вакцина включает в качестве действующего начала плазмиду, или иную последовательность ДНК, кодирующую и экспрессирующую ген или фрагмент гена. Термин "плазмида" означает транскрипционную единицу, включающую полинуклеотидную последовательность, содержащую последовательность экспрессируемого гена или генов и элементы, необходимые для его (их) экспрессии in vivo. Форма плазмиды предпочтительно кольцевая, "суперскрученная" или нет. В рамки настоящего изобретения также входит линейная форма.

Каждая плазмида включает промотор, обеспечивающий экспрессию встроенного гена в клетке. Обычно речь идет о сильном эукариотном промоторе и, в особенности, о раннем промоторе цитомегаловируса CMV-IE человека или мыши или другого вида, например крысы или морской свинки. Как правило, используют промотор либо вирусного происхождения, либо клеточного происхождения. В качестве вирусного промотора, отличного от CMV-IE, можно назвать ранний или поздний промотор вируса SV40 или промотор области LTR вируса саркомы Рауса. Также можно использовать собственный промотор экспрессируемого гена. В качестве клеточного промотора можно назвать промотор гена цитоскелета, такой, как, например, десминовый промотор, или актиновый промотор. Когда в одной и той же плазмиде присутствуют несколько генов, они могут находиться в одной транскрипционной единице или в двух разных транскрипционных единицах.

Согласно настоящему изобретению, можно получать эффективную защищающую животных и человека против бруцеллеза ДНК-вакцину. Оптимизацию вакцины проводят путем объединения в одной конструкции генов шести белков бруцеллы: omp31, p39 и sp41, 22.9-kDa белок, L7-L12 и Omp16. Последовательности генов доступны в GeneBank под идентификаторами AY484527, AF360361.1, AE0096981, AF196569, JF946742.1, JF918760.1.

Для повышения эффективности и стабильности вакцины, в настоящем изобретении также предусмотрено использование адъювантов и стабилизаторов. Адъюванты могут включать, но не ограничиваться, алюминиевыми солями, монофосфорил липидом A (MPL), и другими иммуностимулирующими агентами. Стабилизаторы могут включать сахарозу, трегалозу и другие вещества, предотвращающие деградацию ДНК. Кроме того, для улучшения доставки вакцины в клетки-мишени, могут использоваться липосомы, наночастицы или вирусные векторы. Эти системы доставки могут значительно повысить эффективность трансфекции и экспрессию антигенов в клетках. Вакцина может быть введена различными способами, включая внутримышечные, подкожные и интраназальные инъекции. Оптимальный способ введения определяется на основе экспериментальных данных и может варьироваться в зависимости от вида животного и условий применения. Таким образом, настоящее изобретение представляет собой комплексный подход к созданию эффективной мультивалентной ДНК-вакцины против бруцеллеза, включающий использование нескольких антигенов, адъювантов, стабилизаторов и современных систем доставки.

Перечень фигур

Фигура №1: Схема экспрессионной ДНК - кассеты

Фигура №2: Схема плазмиды для вакцинации

Список последовательностей

Seq. №1: Праймер для амплификации плазмиды

Seq. №2: Праймер для амплификации плазмиды

Seq. №3: Экспрессионная плазмида для вакцинации

Seq. №4: Последовательности экспрессионной ДНК-кассеты, кодирующей белки бруцеллы

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Согласно литературным и полученными нами ранее данным, иммунизация несколькими белками бруцелл обладает более сильным защитным действием, чем использование отдельных белков (автореферат Эльшазли Маха Ахмед Эльсайед https://www.dissercat.com/content/izuchenie-antigennoi-aktivnosti-rekombinantnykh-dnk-omp31-p39-sp41-bmelitensis-na-modelnykh). В состав экспрессионной ДНК-кассеты включены белки omp31, p39 и sp41 Brucella melitensis, которые относительно успешно использовались нами ранее при разработке ДНК-вакцины. Белок наружной мембраны omp31 является одним из наиболее популярных белков бруцеллы для создания вакцин. По нашим данным, при иммунизации животных плазмидами, кодирующими отдельные белки, именно omp31 вызывает наибольший титр антител у животных. Периплазматический связывающий белок B. melitensis p39 является Т-клеточным иммунодоминантным антигеном и вызывает сильную реакцию гиперчувствительности замедленного типа, поэтому его использование в качестве вакцинного антигена очень перспективно. Поверхностный белок (SP) с молекулярной массой 41 кДа (sp41) связан с бактериальной адгезией и инвазией клеток, и, безусловно, необходим для инфекционного процесса, что также делает его интересной мишенью для разработки вакцины (Cloeckaert A. et al, 2002; Al-Mariri et al, 2001; Castañeda-Roldán E.I. et al, 2006). Кроме того, в состав мультивалентной вакцины включены три белка, которые показали способность индуцировать защитный иммунитет в работах других авторов. Это 22.9-kDa белок, L7-L12 и Omp16.

Вакцина включает раствор линейного полиэтиленимина (Mw=25000Da) в 5% глюкозе в концентрации 1.6 мкг/мкл и раствор плазмиды pCMV-6ant-mini в 5% глюкозе в концентрации 0,4 мкг/мкл. Плазмида была получена путем клонирования в E. coli с последующим выделением плазмидной ДНК. Рабочий раствор вакцины получали путём смешивания равных объёмов раствора плазмиды и полиэтиленимина, после чего полученный раствор вводили внутримышечно в дозе 100 мкл на мышь. Экспериментальные данные показали, что такая комбинация генов обеспечивает защиту от инфекции Brucella melitensis.

Пример 1. Создание экспрессионной ДНК-кассеты

Для создания ДНК вакцины, обеспечивающей синтез шести белков бруцеллы, можно предложить два основных подхода. Первый заключается в создании шести различных плазмид, каждая из которых кодирует отдельный белок. Такой подход представляется нам менее технологичным и экономически выгодным. Более оптимальным представляется создание одной плазмиды, кодирующей все шесть белков. Для создания такой плазмиды мы решили использовать саморасщепляющиеся пептиды и ARES элемент. Так как эффективность синтеза каждого следующего белка, отделённого от предыдущего саморасщепляющимся пептидом, несколько падает, то был выбран следующий дизайн кассеты для экспрессии необходимых белков (фигура 1). Первые три белка бруцеллы, omp31, omp16 и p22-9, разделены саморасщепляющимися пептидами P2A и T2A. Это одни из наиболее активных саморасщепляющихся пептидов, описанных в литературе. Выбраны два разных пептида во избежание повторов ДНК, которые могут привести к повышенной вероятности рекомбинации и нестабильности плазмиды. Далее идёт хорошо известный ARES элемент из полиовируса (doi: 10.1038/334320a0), после которого расположены участки, кодирующие белки L7/L12, p39 и sp41, также разделённые саморасщепляющимися пептидами. Было решено не включать в последовательности белков метки (например, гистидиновую метку), по которым можно было бы легко следить за эффективностью синтеза этих белков в клетках. Это было решено сделать так как данные последовательности представляют только исследовательский интерес, а для работы вакцины не нужны. Более того, данные метки повышают антигенную нагрузку и могут потенциально быть источником нежелательной иммунологической реакции.

К началу последовательностей, кодирующих белки p22-9 L7/L12 и p39, после старт кодона были добавлены последовательности сигнального пептида из гена, кодирующего Igκ сабгруппы V человека (аминокислотная последовательность: METPAQLLFLLLLWLPDTTG, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29281112/). Данный сигнальный пептид часто используется для секреции гетерологичных белков. Стоит отметить, что сигнальный пептид не обеспечивает 100% секрецию белка. Компьютерный анализ распределения белков по компартментам клетки показал, что в нашем случае после добавления сигнального пептида значительная часть белка (до 50%) может сохранять свою внутриклеточную локализацию.

Экспрессионную ДНК-кассету, содержащую последовательности, кодирующие шесть белков бруцеллы, получили методом синтеза генов. Правильность сборки экспрессионной кассеты подтверждена методом секвенирования. Для повышения уровня экспрессии целевых белков была проведена оптимизация последовательностей, кодирующих требуемые белки (в основном учитывалась частота встречаемости кодонов). Синтезированная ДНК-кассета была клонирована фирмой-изготовителем в вектор pPCR-Script Amp SK(+) по сайту узнавания рестриктазы EcoR V.

Пример 2. Создание ДНК-плазмиды, кодирующей белки бруцеллы.

Для создания требуемой плазмиды необходимо было перенести синтезированную экспрессионную ДНК- кассету под контроль регуляторных элементов - промотора и терминатора транскрипции. Для этого из плазмиды, содержащей экспрессионную ДНК-кассету, кодирующих необходимые белки бруцеллы, с помощью рестриктаз NdeI и NotI вырезался необходимый фрагмент. При этом вначале проводили рестрикцию с помощью NdeI, полученный конец ДНК достраивали с помощью T4 полимеразы, после чего проводили рестрикцию ферментом NotI. Таким образом получали вставку.

Аналогично, вектор готовили так: плазмиду pEGFP-N1 разрезали с помощью рестриктазы BamHI, полученный конец ДНК достраивали с помощью T4 полимеразы, после чего проводили рестрикцию ферментом NotI. Для дальнейшего лигирования использовали более тяжёлый рестриктный фрагмент, содержащий, кроме ориджина репликации и гена устойчивочти к антибиотику, промотор цитомегаловируса CMV-IE и терминатор транскрипции.

Проводили лигирование вектора со вставкой, полученную смесь использовали для трансформации компетентных клеток. Выросшие после трансформации клоны анализировали методом ПЦР. Использовали праймеры:

CMV-6antigF: 5' GCAGTACATCAATGGGCGTG

CMV-6antigR: 5'AGGAGCTGAAAGGGTGCTTG

Параметры температурного цикла:

95°С - 20 сек

62°С - 20 сек

72°С - 30 сек

30 циклов

Клоны, давшие положительный сигнал, использовались для выделения плазмидной ДНК. С выделенной плазмидной ДНК проводился повторный ПЦР, для подтверждения результатов первичного анализа. Из двенадцати клонов положительный сигнал был только в одном случае. Этот клон использовался для выделения плазмидной ДНК.

Правильность сборки конструкции проверялась методом частичного секвенирования. Секвенирование подтвердило сборку требуемой конструкции. Была несущественная делеция в месте стыка вектор-вставка в районе соединения BamHI-NdeI (там, где проводилось затупление концов). Данная делеция находится в районе, не несущем функциональной нагрузки, поэтому является допустимой. Полученная плазмида получила название pCMV-6antig.

Пример 3. Создание ДНК-плазмиды для получения миникольца, кодирующего белки бруцеллы. Получение бактериального штамма, содержащего целевую плазмиду.

Описываемая экспрессионная ДНК-кассета, кодирующая белки бруцеллы, может находится как в составе обычной плазмиды (пример 1), так и в виде минкольца (minicircle). Миникольцо получается путём индукции рекомбинации родительской плазмиды в специальном бактериальном штамме ZYCY10P3S2T (пример 3). Родительская плазмида должна содержать сайты рекомбинации, фланкирующие экспрессионную кассету генов с регуляторными элементами, и множественные сайты узнавания рестриктазы SceI, находящиеся вне фланкированной последовательности.

Для получения родительской плазмиды было решено перенести экспрессионную кассету генов вместе с регуляторными элементами из плазмиды pCMV-6antig (пример 1) в вектор для получения миниколец pMC.EF1α-MCS-SV40polyA. Так как для данного переноса не было подходящих друг другу сайтов рестриктаз, а лигирование по тупым концам оказалось малоэффективным, то было решено соединение вектора со вставкой осуществить с помощью двух адапторов, сделанных из отожжённых друг на друга олигонуклеотидов. Таким образом, мы избегаем клонирования по тупым сайтам, однако в новом варианте требуется соединение не двух, а сразу четырёх фрагментов ДНК.

Первый адаптор получался путём отжига олигонуклеотидов AD1-1 и AD1-2:

AD1-1:

CCGGGCGCGACTAGTGAATT

AD1-2:

TAAATTCACTAGTCGCGC

Второй адаптор получался путём отжига олигонуклеотидов AD2-1 и AD2-2:

AD2-1:

GGCCGCGACTCTAGGACCGT

AD2-2:

TCGAACGGTCCTAGAGTCGC

Вставку готовили путём рестрикции плазмиды pCMV-6antig рестриктазами NotI и AseI, с последующей очисткой требуемого фрагмента. Вектор получали путём рестрикции плазмиды pMC.EF1α-MCS-SV40polyA по сайтам SalI и XmaI. В результате проведённого лигирования вектора, вставки, и двух адапторов, были получены три клона, давшие положительный сигнал при ПЦР-анализе. Отобранные по результатам ПЦР-анализа клоны были использованы для выделения плазмидной ДНК, которая затем была проанализирована с помощью рестрикции ферментом MfeI. При рестрикции целевой плазмиды CMV-6antig-mini рестриктазой MfeI должны образовываться продукты длиной примерно 9200 и 2650, что соответствуют теоретически предсказанным. Два клона были отданы на частичное секвенирование, которое подтвердило правильность сборки плазмиды. Полученная плазмида получила название pCMV-6antig-mini (Фигура 1).

Для получения бактериального штамма, из которого можно получать требуемое миникольцо, проводили трансформацию компетентных клеток ZYCY10P3S2T полученной родительской плазмидой.

Пример 4. Методика выделения и очистки миникольца

Приготовление стартовой культуры

1. 500 мл среды ТВ (terrific broth), содержащий канамицин в концентрации 50 мкг/мл, заразить штаммом ZYCY10P3S2T, содержащим плазмиду pCMV-6antig-mini

2. Растить 30°С 16 часов.

3. Центрифугировать 1500 g 15 минут

4. Осадок ресуспендировать в 30 мл среды ТВ, добавить 3 грамма глицерина, перемешать. Разлить по криопробиркам и хранить при температуре не меньше -60°С

Получение биомассы для выделения миникольца.

1. К 250 мл среды ТВ с содержанием канамицина 50 мкг/мл добавляем 2 мл 5М NaOH.

2. Добавляем 10 мкл. стартовой культуры.

3. Растим при 30°С в течении 14 часов

4. Центрифугировать 1200g 15 минут, к осадку добавить 1000 мл среды LB с содержанием арабинозы 0.05% без антибиотика. Ресуспендировать.

5. Растить при помешивании 1 час при 30°С, затем 1 час при 42°С.

Выделение и очистка миникольца (объёмы при необходимости можно пропорционально увеличить)

1. 10 мл культуры после индукции центрифугировать 1500g 10 мин

2. Осадок ресуспендировать в 200 мкл. раствора I (Глюкоза 50 мМ, ЭДТА 10мМ, Трис рН 8.0 25 мМ)

3. Добавить 400 мкл раствора II (SDS-1%, NaOH - 0.2H). Аккуратно перемешать.

4. Добавить 300 мкл холодного 3 M NaOAc pH4.5. Перемешать, добавить 540 мкл 4М хлорида кальция. Перемешать. Инкубировать при температуре 25°С 10 мин. Допустимо объединение растворов ацетата натрия и хлорида кальция в один нейтрализующий раствор.

5. Центрифугировать макс. обороты (не меньше 12000g) 10 мин при температуре 25°С.

6. Отобрать супернатант, добавить ПЭГ до конечной концентрации 10%, перемешать, инкубировать 10 минут при температуре 25°С.

7. Осадить ДНК центрифугированием 12000g 10 мин.

8. Осадок промыть 70% спиртом, просушить, растворить в минимальном объёме ТЕ рН8.0 (примерно 50-100 мкл)

Пример 5. Подбор оптимальных условий трансфекции ДНК вакцин на культурах клеток

Основные параметры, влияющие на эффективность трансфекции, это количество соли в растворе (ионная сила) при формировании трансфекционных комплексов и соотношение количества ДНК к трансфектанту. Известно, что эффективность трансфекции in vivo и in vitro может сильно отличаться. Одной из важных причин уменьшения эффективности трансфекции in vivo является большой размер трансфекционных комплексов, что не позволяет им выйти из места инъекции и трансфецировать соседние клетки. Известно, что при использовании полиэтиленимина (PEI) наименьший размер комплексов образуется в бессолевых условиях, которые и рекомендованы для трансфекции in vivo. Аналогично, для комплексов ДНК-липосомы (GenJect) отсутствие соли также приводит к наименьшему размеру трансфекционных комплексов (информация от разработчика). Мы получали трансфекционные комплексы при различных условиях и измеряли их размер на приборе zetasizer. Для формирования комплексов с PEI использовали буфер, содержащий 5% глюкозы (для поддержания необходимого осмотического давления). Для комплексов с липосомами тестировали два буфера: 5% глюкозы и фосфатный буфер (PBS). Особенностью трансфекции in vivo является необходимость вводить довольно большие дозы комплексов ДНК в сравнительно малом объёме, т.е. требуется получать трансфекционные комплексы в намного более высоких концентрациях, чем это делается при трансфекции in vitro. В таких условиях может усиливаться агрегация комплексов. В экспериментах на приборе zetasizer мы использовали концентрации, близкие к условиям in vivo. Для уменьшения агрегации липидных комплексов мы, по рекомендации производителя, использовали уменьшенное соотношение ДНК к липидам (1:1). Это не самое оптимальное соотношение с точки зрения эффективности трансфекции in vitro (см. ниже). Тем не менее, падение эффективности не очень большое, и, как нам представляется, эффект от возможного уменьшения агрегации должен быть существенней. Кроме обычного полиэтиленимина мы тестировали вариант PEImax, отличающийся более высокой плотностью протонируемых аминогрупп. По немногочисленным литературным данным и утверждениям разработчика, PEImax обеспечивает более высокую эффективность трансфекции. Также мы изучали, насколько стабильны полученные комплексы. Для этого мы инкубировали их при 4°С в течение 48 часов после чего анализировали на приборе zetasizer.

Комплексы ДНК с липидами даже при соотношении 1:1 формируют разнородные по размеру структуры с примесью агрегатов, что хорошо видно по корреляционным кривым. Такие комплексы нестабильны: при инкубации в течение 2 суток при 4°С наблюдается увеличение среднего размера комплексов и количества агрегатов. Визуально можно заметить слабый осадок.

Липиды GenJect40 показывают образование несколько более однородных комплексов. Также предпочтительно использовать фосфатный буфер, а не глюкозный.

С другой стороны, комплексы ДНК-PEI однородны по размеру и относительно стабильны: после 48-часового хранения наблюдается только небольшое увеличение среднего размера комплексов. Сравнение обычного PEI и PEImax показало, что обычный PEI позволяет получать более маленькие частицы (119 нм vs 152 нм).

Таким образом, использование полиэтиленимина выглядит более привлекательным.

После выбора условий формирования трансфекционных комплексов оставалось подобрать соотношение количества ДНК к трансфектанту. Подбор оптимальных условий трансфекции миникольца производился путём трансфекции тестовой линии клеток плазмидой, предназначенной для экспрессии люциферазы. Во всех экспериментах неизменным оставалось общее количество ДНК на лунку, варьировалось только количество трансфектанта. Для PEI оптимальное соотношение составило 1:5, для PEImax 1:8.3, для GenJect40 1:4. Сравнение PEI и PEImax подтвердило наши более ранние наблюдения об отсутствии преимущества PEImax при трансфекции. Полученные в ходе работ результаты, такие как оптимальное соотношение ДНК-трансфектант, оптимальный состав буфера для формирования трансфекционных комплексов и наилучший вариант липосомального реагента для трансфекции, использовались для создания оптимизированной методики трансфекции. При создании методики также учитывались пожелания производителя липосомальных реагентов (увеличить соотношение ДНК к липиду), направленные на уменьшение агрегации трансфекционных комплексов при их формировании в высоких концентрациях (которые необходимы для трансфекциии животных).

Пример 6. Методы молекулярной биологии

Экстракция ДНК из агарозного геля:

Амплификаты вносили в агарозный гель для проведения электрофореза с целью оценки их качества и концентрации, чтобы определить сколько вносить матрицы в реакцию секвенирования.

Вносили в лунки геля максимальное количество амплификата, провели электрофорез и вырезали искомую полосу из геля. Сложили ее в полипропиленовую пробирку. Визуально определили объем геля (примерно 150 мкл). Далее провели очистку амплификата из агарозного геля с использованием набора для экстракции ДНК («CleanupMini» ЗАО, Евроген).

Лигирование вектора со вставкой

Лигирование вектора со вставкой осуществляли следующим образом: вектор и вставку лигировали в молярном соотношении приблизительно 1:5 с использованием ДНК-лигазы Т4 (SibEnzyme) при 16°С в течение 2 часов.

Реакционная смесь для лигирования

Вектор (25 нг/ мкл) 2 мкл Вставка 5 мкл 10x лигазный буфер 2 мкл T4-ДНК-лигаза 0.5 мкл Вода очищенная "milli-Q" 11 мкл

Образцы хранили при -20°C до будущего использования.

Анализ клонов методом ПЦР

Праймеры были подготовлены программой Primerblast и заказали в ООО Евроген.

Для скрининга использовали пару праймеров. В качестве матрицы для ПЦР реакции использовали соскрéб из случайно выбранных колоний на чашке Петри, которые были полученны после трансформации компетентных клеток лигазной смесью. Наличие или отсутствие требуемой плазмиды в бактериальной колонии определяли по присутствию продукта ПЦР. Для дальнейшей работы отобрано 3-4 клона с положительным сигналом при ПЦР- анализе.

Реакционная смесь для ПЦР-анализа

dNTPase 2 мкл 10хбуфер 2 мкл Бетаин 4М 8 мкл Taq polymerase (5 ЕД/мкл) 0.4 мкл Праймеры (10 pmol/ мкл) 2 мкл Дистиллированная вода 6 мкл Всего 20 мкл

Затем добавили колонии. Профиль был следующим: Один начальный цикл при 94°C в течение 4 мин, затем 30 циклов: 94°C 20 секунд, 52°C 20 секунд, 72°С 30 секунд.

Продукты ПЦР подвергали электрофорезу на 2% агарозном геле с добавлением буфера для нанесения на гель с ксиленцианолом

Создание бактериального музея для длительного хранения плазмид

Культуры, которые далт положительный сигнал, использовали для создания бактериального музея. К 1 см³ культуры добавляли 200 мкг глицерина, перемешивали, хранили при -80°С.

Приготовление чашек Петри с LB-агаром и канамицином

Приготовленный LB-агар охлаждали до 45°С и добавляли антибиотик канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл, тщательно перемешивали и раливали в стерильные чашки Петри и оставляли на 15-20 минут для застывания.

Подготовка компетентных клеток

1. Разморозили компетентные клетки E. Coli XL1 на льду. Разлили 50 мкл клеток в каждую охлажденных пробирок, инкубировать клетки на льду в течение 10 минут.

2. Пять см³ продукта лигирования добавляли к каждой аликвоте клеток, пробирки инкубировали на льду в течение 30 минут.

3. Нагрели пробирки на водяной бане при 42°С в течение 45 секунд. Продолжительность теплового импульса имеет решающее значение для максимальной эффективности.

4. Инкубировали пробирки на льду в течение 2 минут, добавили 1 см³ предварительно нагретой среды LB и инкубировали пробирки при 37°С в течение 30 мин. Центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об / мин.

Пересев бактерий после трансформации на чашки Петри

1. Посеяли бактерий на чашки Петри с агаровой средой проводят с помощью стерилизованного стеклянного шпателя. Шпатель увлажняли этанолом и стерилизовали на огне для каждой культуры.

2. Посев бактерий осуществляли в ламинарном шкафу

3. Затем культивировали на чашках с LB-агаром. Инкубировали чашки при 37°С в течение ночи.

Пример 7. Приготовление вакцинных композиций плазмид

Все компоненты хранили замороженными (-20°С). Замороженные компоненты можно размораживать и замораживать снова. Растворы ДНК желательно долго не держать при комнатной температуре. PEI - раствор линейного полиэтиленимина (Mw=25000Da, Polyscience) в 5% глюкозе. Концентрация - 1,6 мкг/мкл. Плазмида - раствор плазмиды pCMV-6ant-mini в 5% глюкозе. Концентрация - 0,4 мкг/мкл. Компоненты смешивали в соотношении 1:1 исходя из объема 100 мкл на животное.

Рассчитывали, сколько реактивов должно быть в пробирке (зависит от количества мышей плюс «мёртвый объём» шприца). Готовили реактивы в пробирке. Перемешивали содержимое пробирок. Ждали 10 минут. Добавляли содержимое пробирки 2 к пробирке 1, тщательно перемешивали. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре для формирования трансфекционных комплексов. По завершению инкубации проводили инъекции. Комплексы с PEI были стабильны как минимум 1 час, в течение которого необходимо было использовать трансфекционный комплекс. Комплексы с GenJect-40 необходимо было использовать в течение 30-40 минут, поскольку они были менее стабильны, чем комплексы с полиэтиленимином.

Пример 8. Контроль живой вакцины Брувак Rev-1 на чистоту и ростовые свойства до заражения

Вакцину разводили стерильным физиологическим раствором в количестве, соответствующем объему вакцины до сушки, в данном случае в 3,0 см³ и посеяли на бруцеллагар. На 4 сутки роста на питательной среде наблюдали типичный чистый рост бруцелл.

Пример 9. Иммунизация животных и тестирование протективного действия вакцины

Для иммунизации использовались белые мыши массой 18-20 гр, 24 головы. Были сформированные 3 группы по 8 голов. Опытным животным вводили ДНК-вакцину по следующей схеме:

I группа опытная - 8 голов вакцину вводили внутримышечно.

II группа опытная - 8 голов вакцину вводили подкожно.

III группа контрольная 8 голов (не вакцинированные).

Через 14 дней после вакцинации провели контрольное заражение вакцинированных мышей вакциной Брувак Rev-1' в дозе 500 млн м.к. внутрибрюшинно.

За мышами наблюдали в течение 30 дней, в период наблюдения животные оставались в пределах физиологической нормы, падежа не было.

В конце эксперимента вскрыли мышей из каждой группы по 6 голов. Кровь отсевали на МПА и Бруцеллагар, вытяжку из сердца и селезенки на МПБ. Посевы инкубировали при 37°С в течение 4 суток.

Учет результатов

Номера животных,
группа/№ Питательные среды Бруцеллагар МПА МПБ Кровь Сердце Селезенка I группа опытная 1/1 слабый рост 4 колоний бруцелл единичные колонии рост +
помутнение среды рост +
помутнение среды 1/2 нет роста нет роста нет роста, среда просветлённая- нет роста - среда
просветлённая 1/3 нет роста нет роста рост +
помутнение среды рост +
помутнение среды 1/4 5 колоний роста нет роста нет
среда просветлённая- роста нет- среда просветлённая- 1/5 нет роста нет роста рост +
помутнение среды рост +
помутнение среды 1/6 нет роста нет роста рост +
помутнение среды рост +
помутнение среды II группа опытная 2/1 единичные колонии роста нет роста нет роста нет 2/2 Больше 100 колоний бруцелл Рост единичных колоний рост + рост + 2/3 Слабый рост мелкие изолированные колонии бруцелл (8 колоний) роста нет рост - рост - 2/4 Умеренный рост бруцелл (11 колоний) слабый рост рост + рост + 2/5 Умеренный рост бруцелл (8 колоний) слабый рост рост + рост + 2/6 Умеренный рост бруцелл (10 колоний) слабый рост рост + рост + III группа контрольная 3/1 Роста нет роста нет рост +
помутнение среды рост ++
помутнение среды 3/2 5 колоний бруцелл Роста нет рост ++
помутнение среды рост +++
помутнение среды 3/3 Характерный обильный рост бруцелл Изолированные колонии бруцелл
(8 колоний) рост ++
помутнение среды рост +++
помутнение среды 3/4 Характерный обильный рост бруцелл Изолированные колонии бруцелл
(15 колоний) рост ++
помутнение среды рост +++
помутнение среды 3/5 8 колоний бруцелл Роста нет рост ++
помутнение среды рост +++
помутнение среды 3/6 Характерный обильный рост бруцелл Изолированные колонии бруцелл
(12 колоний) рост ++
помутнение среды рост +++
помутнение среды

Пересевы из МПБ на бруцеллагар рост 2/3, 2/2 единичные колонии бруцелл.

По результатам проведенных исследований установлено, что во II опытной группе, где ДНК вакцину вводили подкожно рост бруцелл был более обильный, в пробе 2/2 не возможен был подсчет КОЕ (колоний образующих единиц). В I опытной группе в пробах 1/1 и ¹/₄ на Бруцеллагаре отмечали рост единичных колонии бруцелл. В вытяжке из сердца и селезенки на МПБ отмечали слабое помутнение. В мазках отмечали характерную для бруцелл морфологию. Во второй группе (иммунизация подкожно) - на Бруцеллагаре у 4-х из 6 были изолированы характерные колонии для бруцелл.

В контрольной группе в пробе крови от мыши 3/1 роста не наблюдалось. В материале от остальных мышей были изолированы бруцеллы (в 4 образцах обильный рост на Бруцеллагаре) и умеренный рост на МПА. Из вытяжки сердца и селезенки от всех мышей на МПБ отмечали характерное помутнение.

Таким образом, испытуемый образец ДНК-вакцины обеспечивал защиту при контрольном заражении вирулентным вакцинным штаммом. Протективная эффективность при внутримышечном введении вакцины была выше, чем при подкожном.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложена экспрессионная ДНК-кассета, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную на Seq. 3, и кодирующая 6 иммуногенов патогена Brucella melitensis, а именно белки omp31, p39, sp41, p22.9, L7-L12 и Omp16, одновременно кодирующая 6 белков Brucella melitensis: omp31, p39 и sp41, 22.9-kDa белок, L7-L12 и Omp16. Предложен способ получения плазмиды для защиты организма хозяина против патогена Brucella melitensis. Способ предусматривает встраивание экспрессионной ДНК-кассеты в плазмидный вектор-носитель для экспрессии белков omp31, p39, sp41, p22.9, L7-L12 и Omp16 под контролем сильного эукариотического промотора, такого как ранний промотор цитомегаловируса CMV-IE, и терминатора транскрипции. Данная экспрессионная ДНК-кассета может находиться под контролем сильного эукариотического промотора, такого как ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE), и терминатора. Предложена плазмида pCMV-6antig-mini для защиты организма хозяина против патогена Brucella melitensis, полученная указанным способом, представленная на фиг. 2. Изобретение расширяет ассортимент ДНК-вакцин и может быть использовано для иммунизации человека и животных против заболевания, вызываемого штаммами Brucella. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 9 пр.

1. Экспрессионная ДНК-кассета для включения в плазмиду для защиты организма хозяина против патогена Brucella melitensis, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную на Seq. 3, и кодирующая 6 иммуногенов патогена Brucella melitensis, а именно белки omp31, p39, sp41, p22.9, L7-L12 и Omp16.

2. Способ получения плазмиды для защиты организма хозяина против патогена Brucella melitensis, предусматривающий встраивание экспрессионной ДНК-кассеты по п. 1 в плазмидный вектор-носитель для экспрессии белков omp31, p39, sp41, p22.9, L7-L12 и Omp16 под контролем сильного эукариотического промотора, такого как ранний промотор цитомегаловируса CMV-IE, и терминатора транскрипции.

3. Плазмида pCMV-6antig-mini для защиты организма хозяина против патогена Brucella melitensis, полученная способом по п. 2, представленная на фиг. 2.