РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PZAT1, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-ЗОНДА, С ПОМОЩЬЮ КОТОРОГО ИДЕНТИФИЦИРУЮТ ТОКСИГЕННЫЕ ШТАММЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PZAT1 И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PZAT1 И ДНК-ЗОНДА, С ПОМОЩЬЮ КОТОРОГО ИДЕНТИФИЦИРУЮТ ТОКСИГЕННЫЕ ШТАММЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/00 C12N5/00 C12N15/31 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для идентификации токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы методом молекулярной гибридизации.

Известны способы идентификации возбудителя сибирской язвы, основанные на выявлении фенотипических признаков вида (антигенная структура, биохимические свойства, чувствительность к бактериофагам).

Недостатки этих методов связаны с нестабильностью фенотипических свойств микроорганизмов, что требует при идентификации вида изучения комплекса фенотипических признаков. В отличие от вариабельного фенотипа генотип по своей сути является первоосновой видовой принадлежности, то есть более стабилен, а следовательно, и специфичен.

Для разработки генотипических способов идентификации исходят из наличия в геноме консервативных нуклеотидных последовательностей, геномные перестройки в которых приводят к утрате видовой принадлежности. При поиске ДНК-зонда тактика сводится к клонированию того гена или его участка, который детерминирует наиболее важный видовой признак.

Сибиреязвенная плазмида рХ01 детерминирует синтез трехкомпонентного токсина, и ее присутствие необходимо для реализации патогенеза заболевания. Однако нативная плазмида рХ01 не может использоваться в качестве ДНК-зонда, так как содержит участки ДНК, гомологичные близкородственным В.cereus, B. thuringiensis, B.megaterium (собственное наблюдение).

Задача изобретения конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, несущей видоспецифический фрагмент сибиреязвенной плазмиды рХ01, и создание штамма Escherichia coli продуцента рекомбинантной плазмидной ДНК и ДНК-зонда, используемого для идентификации токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы методом молекулярной гибридизации.

Для решения поставленной задачи проводят рестрикционный и гибридизационный анализ фрагментов сибиреязвенной плазмиды рХ01. Плазмидную ДНК подвергают гидролизу рестриктазой BamHI и изучают специфичность гибридизационного связывания различных фрагментов. BamHI-рестрикты размером 14 т.п.н. обеспечивающие гибридизацию только с плазмидной ДНК рХ01, клонируют shot-gun методом после полного гидролиза ферментом HindIII в составе векторной ДНК рВR322. Лигазной смесью трансформируют штамм Е.соli HB101, отбирают клон, содержащий рекомбинантную плазмиду со вставкой 0,9 т.п.н. и выделяют из него плазмиду pZAT 1.

На чертеже изображена физическая карта рекомбинантной плазмиды рZAT 1.

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды рZAT 1.

Выделение плазмидной ДНК рХ01.

Выращивают 300 мл культуры штамма Bacillus anthracis Sterne 34F₂ в BH1-среде в течение 14 ч. Отмывают клетки 0,05 М трис-HCl, 0,01M ЭДТА, 0,05М NaCl, рН 8,0. Реcуcпендируют в 10 мл 0,05 М триc-HCl, 0,02 М ЭДТА, рH 8,0. Добавляют 10 мг/мл лизоцима и инкубируют 90 мин при 37^оС. Суспензию медленно добавляют в 200 мл лизирующего раствора: 20 мл 0,5М трис-НСl, рН 8,0; 16 мл 0,25М ЭДТА, рН 8,0; 20 мл 10% SDS; 120 мл воды. рН доводят до 12,45 свежим раствором 2М NaOH и добавляют воду до 200 мл. Лизис проводят в химическом стакане объемом 1 л на магнитной мешалке со скоростью вращения 50 об/мин в течение 10 мин. Титрацией 2М трис-НСl (рН 7,0) рН лизата доводят до 8,6. Последовательно добавляют 1/10 объема 5M NaCl, 200 мл фенола, уравновешенного 0,05М трис-НСl, 0,02M ЭДТА, 0,5М NaCl (рН 8,0). После разделения фаз водную фазу переносят в чистый стакан и в аналогичных условиях обрабатывают равным объемом смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1).

Отобранную водную фазу разводят в 2 раза водой и проводят трехкратную экстракцию диэтиловым эфиром. Поочередно растворяют в очищенном лизате 75 г полиэтиленгликоля 6000 и 27 г NaCl и оставляют на ночь при 4^оС. Центрифугируют при 9500 об/мин (Ja-14) в течение 10 мин. Осадок высушивают и растворяют в 16 мл 0,01М трис-НСl, 0,001М ЭДТА, рН 8,0 и подвергают центрифугированию в градиенте хлористого цезия в присутствии бромистого этидиума (плотность раствора 1,585) при 40000 об/мин, 15^оС, 24 ч (ротор 70.1.Ti). Отбирают суперскрученную форму плазмиды (нижняя полоса) и после удаления этидиума бромида экстракцией 1-бутанолом препарат очищенной плазмидной ДНК переосаждают 2,5 объема этанола в присутствии 0,3М ацетата Na (рН 7,0).

Выделение и клонирование видоспецифического фрагмента плазмидной ДНК рХ01.

ДНК плазмиды рХ01 в количестве 50 мкг подвергают гидролизу рестриктазой BamHI и проводят препаративный электрофорез в 0,6%-ной легкоплавкой агарозе (1,5 V/см, 16 ч). После элюции фрагментов размером 14 т.п.н. обработки фенолом и переосаждения этанолом 5 мкг препарата выделенных фрагментов подвергают гидролизу рестриктазой HindIII (10 ед.) в течение 1 ч при 37^оС в 30 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-HСl (рН 7,6), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотрейтола. Полноту рестрикции контролируют электрофорезом 1/10 объема реакционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. 1 мкг ДНК вектора рВR322 подвергают гидролизу рестриктазами BamHI (5 ед.) и HindIII (5 ед.) в течение 1 ч при 37^оС в 20 мкл вышеуказанного буфера. Полноту рестрикции контролируют электрофорезом 1/10 реакционной смеси в 0,8%-ной агарозе.

Препараты рестрикции фрагментов и вектора очищают фенольной экстракцией с последующим переосаждением этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия и ресуспендируют в 50 мкл лигазного буфера (66 мМ трис-НСl, рН 7,6, 5 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТР), добавляют лигазу фага Т4 (5 ед.). Лигазную реакцию проводят при 15^оС в течение ночи. Контролируют электрофорезом 1/10 объема лигазной смеси в 0,8%-ной агарозе.

Трансформацию клеток E. coli HB101 проводят следующим методом: 0,1 мл суспензии клеток E.coli HB101 вносят в 10 мл L-бульона и выращивают до плотности культуры ОД/600=0,5. После охлаждения на льду в течение 10 мин клетки осаждают центрифугированием (5000g, 10 мин, +4^оС), суспендируют в 10 мл 0,1 М раствора СаСl₂ и выдерживают 1 ч на льду. Повторно осаждают клетки и ресуспендируют в 0,5 мл 0,1 М CaCl₂ и хранят при 0^оС. 200 мкл компетентных клеток E. coli HB101 смешивают с 1/10 объема лигазной смеси, инкубируют 1 ч на льду и проводят тепловой шок при 42^оС в течение 2 мин. Добавляют 1 мл L-бульона, инкубируют 1 ч при 37^оС и высевают на L-агар с ампициллином (50 мкг/мл). Посевы инкубируют при 37^оС в течение ночи, выросшие колонии переносят на L-агар с тетрациклином и отбирают рекомбинантные клоны (Ap-r, Tc-s).

Анализ рекомбинантных клонов и получение штамма-продуцента.

Для определения размеров вставки рекомбинантных клонов клетки выращивают в L-бульоне в течение ночи при 37^оС на шутеле, осаждают центрифугированием 1,5 мл культуры на микрофуге. Клетки ресуспендируют в 350 мкл лизирующего раствора (8% сахарозы, 1% SDS, 50 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-НСl, рН 8,0).

Выдерживают 5 мин при комнатной температуре и помещают в кипящую водяную баню на 1 мин. Центрифугируют на микрофуге в течение 15 мин, супернатант сливают в чистые пробирки и добавляют равный объем изопропанола. Выдерживают при комнатной температуре 10 мин и центрифугируют на микрофуге 15 мин. Осадок промывают 70^о этанолом, высушивают и ресуспендируют в 30 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НСl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). 10 мкл каждого препарата подвергают гидролизу рестриктазами BamHI и HidIII и контролируют размер вставки электрофорезом в 0,8% -ном агарозном геле в присутствии маркеров молекулярных масс (PstI-фрагменты фага лямбда).

Плазмидную рекомбинантную ДНК, состоящую из репликона векторной плазмиды рВR322 и вставки размером 0,9 т.п.н. обозначают pZAT 1, а клон, несущий гибридную плазмиду, отбирают как штамм-продуцент E.coli КМ-51.

Мол. м. плазмиды pZAT 1 равна 3,19 МДа (4,9 т.п.н.) и состоит из ДНК вектора pBR 322, размером 4,0 т.п.н. и BamHI-HindIII фрагмента сибиреязвенной плазмиды рХ01 размером 0,9 т.п.н. (чертеж).

Штамм E.coli КМ-51 продуцент рекомбинантной плазмиды pZAT 1 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические.

Клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Хорошо растет на простых питательных средах в диапазоне температур от 4 до 45^оС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. На мясопептонном агаре образует гладкие, серые, круглые, блестящие колонии с ровным краем. На мясопептонном бульоне образует ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические.

В качестве источника углерода использует многие углеводы, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота использует минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме), органические соединения (в виде пептона, триптона, аминокислот), нуждается в пролине. Проявляет устойчивость к ампициллину (50-100 мкг/мл).

Характеристика полезного продукта.

Клетки штамма содержат плазмидную ДНК (размером 4,9 т.п.н.), наличие которой подтверждается устойчивостью штамма к ампициллину (50-100 мкг/мл), а также путем выделения плазмидной ДНК любым известным методом.

Уровень синтеза рекомбинантной плазмиды в клетках штамма составляет 1,5-2 мг на 1 л питательной среды при плотности культуры 0,4 (при длине волны 600 нм).

Другие признаки.

Штамм E.coli КМ-51 является производным штамма E.coli HB101, не способен вызывать инфекционный процесс.

Генотип: F^-, hsdS20(r-, m-), supE44, recA13, ara14, proA2, rpsL20(str^r), xyl-5, mlt-5, supE44, λ-(amp^r).

Клетки штамма стабильно сохраняют плазмидную ДНК при культивировании на средах с ампициллином (50 мкг/мл), в лиофилизированном состоянии, а также при криоконсервации в присутствии 15% глицерина при температуре -70^оС.

П р и м е р 2. Получение радиоактивного зонда и его использование.

Клетки штамма КМ-51 выращивают ночь в 15 мл L-бульона с ампициллином (50 мкг/мл) и выделяют плазмидную ДНК pZAT 1. Аликвоту препарата, содержащую 10 мкг ДНК, подвергают гидролизу рестриктазами BamHI и HindIII и проводят препаративный электрофорез в 0,8%-ной легкоплавкой агарозе. Фрагмент размером 0,9 т.п.н. элюируют и после фенольной экстракции и переосаждения этанолом в присутствии 0,3 М ацетата аммония используют его для ник-трансляции.

ДНК-зонд в количестве 1 мкг вносят в 50 мкл реакционной смеси: 50 мМ трис-НСl (рН 7,5), 5 мМ MgCl₂, 10 мМ меркаптоэтанол, 100 мкг/мл БСА, по 10 мкМ dATP и dGTP, по 50 мкСi [α 32-P]dTTP и [α 32-P]dCTP. Добавляют 2 мкл ДНК-азы I (100 нг/мл) и инкубируют 10 мин при 14оС. Вносят 2 ед. ДНК-полимеразы I и инкубируют 1 ч при 14^оС. От невключившихся нуклеотидов освобождаются хроматографией на миниколонках с сефадексом G-50 c последующим обсчетом активности фракций и определением удельной активности ДНК-зонда. Препарат ДНК-зонда денатурируют 10 мин в кипящей водяной бане, быстро охлаждают на льду и хранят при -20^оС до использования.

Тотальную ДНК из исследуемых штаммов выделяют следующим образом. Клетки засевают в 5 мл BHI-бульона, содержащего 10% инактивированной нормальной лошадиной сыворотки. Выращивают при 37^оС в течение 5 ч с интенсивным перемешиванием (150 об/мин). 0,1 мл бульонной культуры высевают на скошенный агар BHI с сывороткой (10%). Инкубируют ночь при 37^оС в анаэробных условиях.

Клетки смывают 5 мл TES-буфера (0,05 М трис-НСl, рН 8,0, 0,05 М NaCl, 0,005 M Na₂ЭДТА, рН 8,0), содержащего лизоцим в концентрации 10 мг/мл. Выдерживают 90 мин при 37^оС. К 3 мл суспензии клеток добавляют два объема лизирующего раствора: 50 мМ трис-ОН, 3% SDS, 0,5 M NaOH, рН 12,45. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре до полного просветления лизата.

Добавляют 0,8 мл 2 М трис-НСl (рН 7,0), 1 мл 5 М NaCl и равный объем свежеперегнанного забуференного фенола, перемешивают и выдерживают ночь при комнатной температуре. Центрифугируют при 6 тыс.g, 10 мин. Водную фазу отбирают, смешивают с равным объемом хлороформа, центрифугируют в указанном режиме и отбирают водную фазу. Добавляют 1/5 объема 10 М ацетата аммония и равный объем изопропанола. Выдерживают 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 12 тыс. g, 30 мин. Супернатант сливают, осадок высушивают при комнатной температуре и ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ-буфера. Концентрации полученных препаратов определяют на ДНК-флуорометре или электрофоретически.

К аликвоте растворов, содержащих 2 мкг тотальной ДНК (из расчета на одно пятно фильтра), добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия и два объема этанола, выдерживают 30 мин при -20^оС, центрифугируют при 12 тыс.g, 20 мин. Супернатант сливают, осадок высушивают и растворяют в 10 мкл 0,3 М NaOH. Помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Охлаждают на льду.

Нитроцеллюлозные (НЦ) фильтры вымачивают последовательно в 2хSSC и 20xSSC (SSC: 150 мМ NaCl, 15 мМ цитрата натрия, рН 7,0). Высушивают при комнатной температуре. Препараты денатурированных ДНК наносят на фильтры в объеме 10 мкл на одно пятно. НЦ-фильтры помещают на 10 мин на фильтровальную бумагу, смоченную 2М раствором ацетата аммония, высушивают при комнатной температуре и прогревают в вакууме при 80^оС в течение 2 ч.

Проводят предгибридизационную обработку НЦ-фильтров. Для этого их вымачивают 5 мин в 5хSSC и переносят в 10 мл предгибридизационного раствора: 5xSSPE (0,8 M NaCl; 50 мМ NaH₂PO₄, рН 7,4; 5 мМ ЭДТА, рН 7,4), 50%-ный формамид, 5х раствор Денхарда (0,1% фикола 400; 0,1% БСА; 0,1% поливинилпироллидона (ПВП), 0,1% SDS, 100 мкг/мл денатурированной тимусной ДНК. Инкубируют при 42^оС в течение 4 ч. Добавляют меченый зонд и проводят гибридизацию в течение ночи при температуре 42^оС. Фильтры отмывают 3-4 раза по 10 мин при комнатной температуре в 300 мл 2хSSC, 0,1% SDS и двухкратно при 68^оС по 1 ч в 500 мл 1хSSC, 0,1% SDS и высушивают при комнатной температуре.

После гибридизации фильтры экспонируют в кассете с рентгеновской пленкой РМ-В "Тасма" при -20^оС в течение 2 сут. Наличие гибридизационного связывания зонда оценивают по засвечиванию пленки в месте нанесения пятна соответствующего препарата тотальной ДНК исследуемого штамма.

Результаты ДНК-ДНК гибридизации с использованием ДНК-зонда приведены в таблице. Как видно из таблицы, предлагаемый в качестве изобретения ДНК-зонд, гибридизуется только с токсигенными штаммами возбудителя сибирской язвы, дифференцируя их от представителей других бактерий, в том числе близкородственных бацилл и авирулентных штаммов B.anthracis, не содержащих плазмиду рХ01.

Таким образом, полученный штамм-продуцент E.coli КМ-51, несущий рекомбинантную плазмиду pZAT 1, может быть использован для выделения данной плазмиды и наработки ДНК-зонда. Рекомбинантная плазмида pZAT 1 многокопийна, обладает селективным маркером устойчивости к ампициллину, амплифицируется в присутствии хлорамфеникола. Фрагмент, предлагаемый в качестве ДНК-зонда, легко изолируется при гидролизе плазмидной ДНК рестриктазами BamHI и HindIII, обеспечивает высокую видовую специфичность гибридизационного связывания с токсигенными штаммами B.anthracis, что позволяет применять изобретение для совершенствования схем идентификации возбудителя сибирской язвы с применением метода молекулярной гибридизации.

Использование: медицинская биотехнология, разработка методов идентификации возбудителей сибирской язвы. Сущность изобретения: конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК, несущей видоспецифический фрагмент сибиреязвенной плазмиды pXО1, которую используют для выделения ДНК-зонда, и получение штамма Escherichiacoli - продуцента рекомбинатной плазмидной ДНК и ДНК-зонда. Уровень синтеза рекомбинатной плазмиды в клетках штамма составляет 1,5 - 2 мг на 1 л питательной среды. ДНК-зонд, получаемый на основе рекомбинантной плазмидной ДНК pZ AT1, гибридизуется только с токсигенными штаммами возбудителя сибирской язвы, дифференцируя их от представителей других бактерий, в том числе близкородственных бацилл и авирулентных штаммов Bacillus anthracis, не содержащих плазмиду pXO1. 3 с. п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pZAT1, используемая для получения ДНК-зонда, с помощью которого идентифицируют токсигенные штаммы возбудителя сибирской язвы, размеров 4,9 т. п.н. содержащая участок плазмиды pBR 322 размером 4 т. п.н. Bam H I Hind III фрагмент сибиреязвенной плазмиды pX 01 размером 0,9 т. п.н. генетический маркер: bla-ген, обеспечивающий синтез β -лактамазы. 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pZAt1, заключающийся в том, что сибиреязвенную плазмиду pX01, детерминирующую синтез трехкомпонентного токсина Bacillus anthracis, гидролизуют рестриктазой Bam H I, выделяют фрагменты размером 14 т.п.н. обрабатывают их рестриктазой Hind III, клонируют полученные фрагменты shot дипметодом в плазмиде pBR 322, трансформируя клетки Escherichia coli штамма НВ101, отбирают клон, содержащий рекомбинантную плазмиду с вставкой 0,9 т.п.н. и выделяют из него плазмиду pZAT1. 3. Штамм бактерий Escherichia coli КМ-51, используемый для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pZAT1 и ДНК-зонда, с помощью которого идентифицируют токсигенные штаммы возбудителя сибирской язвы.