СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 1999 года по МПК C12N15/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу и набору для обнаружения ДНК особо опасного возбудителя африканской чумы свиней (АЧС) в культуре инфицированных клеток и пробах патологических материалов от свиней, и может быть использовано при диагностике АЧС в научно-исследовательских учреждениях, региональных, областных ветеринарных лабораториях и на предприятиях биологической промышленности для наработки набора.

В последнее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) широко используется для диагностики особо опасных вирусных и бактериальных заболеваний животных и индикации их возбудителей: КЧС, катаральная лихорадка овец и др. (Shin-Tunge Liu et all., J. Virol.Methods, 1991, 35, 227 - 236, Shodeyek Tomasz, Pejsak Zygmunt Med.Vet. 1994, 50, N3, с. 122 - 124, Lohensgard J.R. et al., J. Virol. Meth. - 1991, 34, N 1, 45 - 55).

В литературе описан способ диагностики африканской чумы свиней методом ПЦР (J. Steiger et all., J. Clin. Microbiology, 1992, v. 30, 1 - 8). Фрагмент ДНК размером 740 пар нуклеотидов (п.н.), выделенный из консервативной области генома вируса АЧС, был частично секверован и на основании этой последовательности были отобраны четыре праймера, позволяющие амплифицировать специфические фрагменты ДНК размером 640 и 440 пар нуклеотидов. Для идентификации этих продуктов методом молекулярной гибридизации в качестве ДНК-зондов авторами были использованы дополнительно синтезированный олигонуклеотид, а также рекомбинантная плазмида, содержащая данный фрагмент. Вместе с тем в представленной работе не описана пригодность данных праймеров для идентификации цитолитических, негемадсорбирующих штаммов и изолятов вируса АЧС.

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа и создание набора для обнаружения ДНК вируса АЧС в культуре клеток и нативных биологических материалах инфицированных свиней с использованием трех праймеров вместо пяти праймеров, предложенных указанными авторами.

Поставленная задача достигается тем, что для постановки ПЦР выбраны и синтезированы отличные от прототипа три праймера, комплементарные последовательности гена Vp72, основного структурного белка вируса АЧС, расположенного в консервативной области генома, что позволяет обнаруживать как гемадсорбирующие, так и негемадсорбирующие цитолитические штаммы. Праймер N 3 используется 2 раза: в первом цикле ПЦР для амплификации фрагмента размером 1144 п.н. (праймеры N1 + N3) и для повторной амплификации фрагмента размером 562 п.н. (праймеры N2 + N3). Кроме того, праймер N2 может быть использован в качестве олигонуклеотидного зонда для выявления продукта 1144 п.н. методом молекулярной гибридизации.

Последовательности трех праймеров, выбранные на основании компьютерного анализа и экспериментальных исследований по опубликованной последовательности гена Vp72 (C. Lopez-Otin et all. Virology, 1990, 175, 477 - 484), представлены в таблице 1.

Предлагаемый набор включает пластиковые пробирки, содержащие: специфические праймеры (N1, N2, N3); термостабильный фермент Tag-полимеразу; 10-кратный буфер для реакции; смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов; положительный контроль-рекомбинантную плазмиду, содержащую ген белка Vp72.

Пример конкретного выполнения
В работе нами были исследованы ДНК 13 вирулентных и авирулентных штаммов вируса АЧС, принадлежащих к различным сероиммунотипам, а также нетипированные изоляты (Таблица 2).

Нами были исследованы препараты ДНК, выделенные из органов свиней:
- ДНК, выделенная из крови подсвинков, зараженных вирулентным штаммом вируса АЧС (Киравира);
- ДНК, выделенная из органов подсвинков-хроников (печень, селезенка), забитых через 3 месяца после контрольного заражения свиней (штаммы КК-262, Катанга).

В качестве отрицательных исследований ДНК оспы овец, ДНК оспы вакцины, ДНК вируса Ауески, ДНК вируса инфекционного ринотрахеита КРС, а также ДНК культур клеток (КМС, ПП) и пробы органов здоровых свиней (кровь, печень, селезенка).

Приготовление образцов ДНК для постановки ПЦР.

Суспензию инфицированных клеток (КМС, ПП) или плазму крови (10 - 100 мкл) разводят в 100 мкл бидистиллированной воды. Образцы перемешивают, кипятят 15 мин и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге типа Эппендорф. 5 мкл супернатанта используют для ПЦР. Кусочки органов свиней (15 - 20 мг) гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе или в пробирке Эппендорф стеклянной палочкой, разводят водой до 1 мл (1% вес/об). Образцы кипятят, центрифугируют, как описано выше, и 5 мкл супернатанта используют для ПЦР. Для постановки ПЦР также пригодны образцы ДНК, выделенные традиционным фенольно-хлороформенным методом.

Проведение полимеразной цепной реакции.

В реакционную смесь добавляют 10 мкл 10-кратного буфера, 200 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,05 мкМ праймеров и 2,5 единицы фермента Tag-полимеразы. Конечный объем реакционной смеси доводят водой до 100 мкл, включая от 5 до 10 мкл ДНК-мишени с концентрацией от 1 мкг до 10 пкг. Стандартную процедуру, состоящую из 10 циклов (денатурация при 94^oC- 1 мин, отжиг праймеров при 57^oC- 1 мин, синтез при 72^oC- 2 мин) проводят на амплификаторе - Gene ATAQ Controller Pharmacia LKB или любой другой фирмы.

Идентификация продуктов полимеразной цепной реакции.

Идентификацию продуктов ПЦР проводили по крайней мере одним из 3-х методов:
1) определение молекулярной массы продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле (размеры 1144 и 562 п.н.);
2) амплификацией первичного продукта (1144 п.н.) путем использования второй пары праймеров (N2 + N3);
3) рестрикцией эндонуклеазой Rst I продукта ПЦР после амплификации ДНК с праймерами (N2 + N3) размером 562 пар нуклеотидов.

Определение молекулярной массы продуктов ПЦР
10 мкл продукта анализируют электрофорезом в 2,0% агарозном геле (100V, 30 мин) и гели окрашивают бромистым этидием и просматривают в проходящем ультрафиолетовом свете. В качестве отрицательных контролей возможно использование ДНК вируса болезни Ауески, ДНК вируса инфекционного ринотрахеита КРС, ДНК вируса оспы овец, ДНК вируса осповакцины, ДНК клеток костного мозга свиней (КМС), перевиваемой культуры клеток почки поросенка (ПП) и ДНК проб органов (печень, кровь, селезенка) здоровых свиней. Положительный контроль - рекомбинантная плазмида, несущая фрагмент гена Vp72 вируса АЧС. В качестве стандарта молекулярных масс используют ДНК фага лямбда, разрезанную эндонуклеазой Hind III.

Предложенные праймеры из консервативной области генома вируса АЧС (ген Vp72) специфически амплифицируют с помощью ПЦР фрагменты генома, размеры которых соответствуют рассчитанным размерам, и имеют электрофоретическую подвижность в 2,0% геле агарозы, одинаковую с продуктами ПЦР положительного контроля - рекомбинантной плазмиды, несущей фрагмент гена Vp72. Препараты ДНК отрицательных контролей - вирусов, относящихся к другим семействам, а также ДНК, выделенные из неинфицированных клеток и проб органов здоровых свиней, не амплифицируются.

Определение чувствительности метода ПЦР
С целью определения чувствительности метода готовят 10-кратные разведения ДНК очищенного вируса АЧС и после первой амплификации продукта размером 1144 п.н. (праймеры N1 + N3) отбирают аликвоты (2 - 5 мкл) и повторно амплифицируют в присутствии праймеров (N2 + N3) в том же режиме. Применение повторной амплификации с использованием гнездовых праймеров (N2 + N3), а также выявление продуктов ПЦР с помощью дот-гибридизации с олигонуклеотидным (праймер N2) и плазмидным ДНК-зондами на основе рекомбинатной плазмиды позволяет повысить чувствительность метода ПЦР в 1000 раз и выявляет до 1 - 10 фемтограмм ДНК вируса АЧС или 10 частиц в 1 мл инфекционного вируса в различных материалах, включая пробы органов свиней с хроническими и латентными формами течения болезни.

Определение специфичности метода ПЦР.

Специфичность метода ПЦР определяют амплификацией ДНК различных штаммов вируса АЧС и препаратов ДНК, выделенных из контрольных клеток и гетерологичных вирусов, по размеру синтезированного продукта ПЦР электрофорезом в геле агарозы, методом дот-гибридизации продуктов ПЦР с использованием радиоактивных (олигонуклеотидных) и нерадиоактивных (плазмидных) ДНК-зондов, а также расщеплением продукта размером 562 п.н. рестриктазой PstI. Продукты ПЦР (размер 562 п.н.) всех штаммов вируса АЧС имеют уникальный PstI сайт и расщепляются этой рестриктазой на два фрагмента размером 440 и 122 п.н. (таблица 3).

При использовании иных праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям генома РНК- и ДНК-содержащих вирусов: классической чумы свиней (4F 5'-ATG CCC ATA GTA GGA CTA GCA-3' и 5F 5' - AGA GGC TAG CCA TGC CCT TAG T-3' S. Vilcek, A.J. Hertig, P.F. Nettleton, J.P. Lowings, D.J. Paton/Arch. Virol. , 1994, 136, 3 - 4, 309 - 323); бешенства (SAC1-F 5' -GAC TTG GGT CTC CCG AAC TGG GG-3' и SAC2-R 5' -CAA AGG AGA GTT GAG ATT GTA GTC-3', Debora Sacramento, Herve Bourhy and Noel Tordo/ Molecular and Cellular Probes 1991, v. 5, N-3, pp. 229 - 240); болезни Ауески (LOK2-F 5'-CCG TGC AGG AGA TCA CGG AC-3' и LOK3-R 5' -CCG ATC TTG GTG TAG GTG TC-3', J.R. Lokensgard, D.G. Thawley and T.W. Molitor/ J.Virol., Methods, 1991, 34, 45 - 55); ИРТ КРС (WIL-F 5' -AGG TTG CCG TCT ATA CTT AGC-3' и WIL- R 5' -TTG CAA ATA GCG TCT GGT CGA TTG AA-3', R.A. Williams, M. Ben- net et all./J. Gen. Virol., 1992, 73, 9, 2415 - 2420) ДНК вируса АЧС не выявлено.

Таким образом, предлагаемый способ и набор обладают новизной, позволяют достичь такого же уровня чувствительности с помощью трех праймеров вместо пяти, используемых в стандартной ПЦР, и могут быть промышленно применены. Это позволяет в течение 4 часов обнаружить до 10 фемтограмм ДНК вируса АЧС или 10 частиц в 1 мл инфекционного вируса в различных материалах, включая пробы органов свиней с хроническими и латентными формами течения болезни.

Набор препаратов для выявления ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР на 50 реакций состоит из следующих компонентов:
- 3 пары праймеров (21 нуклеотид), комплементарные различным участкам гена Vp72 вируса АЧС, фланкирующие фрагменты, размером 11144 и 562 пар нуклеотидов - 100 мкл;
- 10-кратный реакционный буфер - 300 мкл;
- смесь дезокситрифосфатов (по 2,0 мМ) - 600 мкл;
- Tag-полимераза (5 ед/мкл) - 500 ед.;
- положительный контроль (ДНК рекомбинантной плазмиды, несущей ген структурного белка Vp72 вируса АЧС) - 100 мкл;
- бидистиллированная вода - 1000 мкл;
- легкое минеральное масло - 1000 мкл.

Предлагаемый набор укомплектован 9 пластиковыми пробирками и может быть промышленно применен в необходимых случаях.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способу и набору для обнаружения ДНК возбудителя африканской чумы свиней (АЧС) в культуре инфицированных клеток и пробах патологических материалов от свиней. Амплифицируют фрагмент ДНК размером 1144 пар нуклеотидов с праймерами N1 и N3. И фрагмент 562 пары нуклеотидов (повторная амплификация) с праймерами N2 и N3, содержащий уникальный сайт для рестриктазы Pst I. Используют праймеры, комплементарные гену основного структурного белка Vp72, расположенному в консервативной области генома вируса АЧС. Набор включает пластиковые пробирки, содержащие специфические праймеры (N1, N2, N3); термостабильный фермент Tag - полимеразу; 10-кратный буфер для реации; смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов; положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую ген белка Vp72. Это позволяет в течение 4 ч обнаружить до 10 фентограмм ДНК вируса АЧС или 10 частиц в 1 мл инфекционного вируса в различных материалах, включая пробы органов свиней с хроническими и латентными формами течения болезни. 2 с.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней в пробах органов инфицированных свиней и культур клеток, включающий постановку полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, в том числе олигонуклеотидного зонда, отличающийся тем, что для постановки данной реакции предложены три праймера: N 1 + N 3 с нуклеотидной последовательностью N 1 5' ACG TAA GAT TCG ATG TAA ATG-3' и N 3 5'-CAA AGG TAA TCA TCA TCG CAC - 3'), фланкирующие фрагмент основного структурного белка Ур72 размером 1144 пар нуклеотидов и для повторной амплификации - внутренний праймер N 2 (5' -GAC GCC CCA GTA GAC GCA ATA-3'), который с прймером N 3 фланкирует фрагмент размером 562 пар нуклеотидов, содержащий уникальный сайт для рестриктазы PstI, и также используется в качестве олигонуклеотидного зонда (праймер N 2) для идентификации фрагмента, размером 1144 пар нуклеотидов методом молекулярной гибридизации. 2. Набор для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней, включающий термостабильный фермент Tag-полимеразу, 10-кратный буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена (Ур 72) указанного вируса, отличающийся тем, что набор содержит три праймера (N 1 5' -ACG TAA GAT TCG ATG TAA ATG-3' и N 2 5' -GAC GCC CCA GTA GAC GCA ATA-3', N 3 5'-CAA AGG TAA TCA TCA TCG CAC - 3'), фланкирующие 2 фрагмента данного гена размерами 562 и 1144 пар нуклеотидов.