ШТАММ BRUCELLA ABORTUS УФ-1 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K9/10 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии.

Известен штамм Brucella abortus 82 и 82 ПЧ, используемые при изготовлении сухой живой бруцеллезной вакцины для иммунизации крупного рогатого скота (1).

Недостатками известного штамма Brucella abortus 82 являются высокая остаточная вирулентность и абортогенные свойства при вакцинации.

Целью изобретения является штамм Brucella abortus, не обладающий абортогенными свойствами при использовании его в качестве вакцины для иммунизации тельных коров и обладающий высокой иммуногенностью

Штамм Brucella abortus УФ-1 (чувствительный к эритритолу, получен и шт.19 воздействием ультрафиолетовых лучей и последующим отбором на селективной питательной среде) имеет следующие морфологические и физиологические характеристики. Клетки представляют собой неподвижные овальные коккобактерии размером от 0,3 до 0,5 мкм, спор и капсул не образуют, в мазках располагаются отдельно, попарно или в виде цепочек из 2-3 клеток. Бактерии красятся по Граму отрицательно, по Козловскому - в красный цвет.

Штамм является факультативным аэробом. Хорошо растет на мартеновском агаре с переваром Хоттингера и пептонно-печеночном глюкозо-глицериновом агаре и бульоне. На искусственных питательных средах рост появляется на 2-3 сутки и проявляется в жидких питательных средах в виде мути и иногда с образованием пристеночного кольца и на плотных питательных средах - виде однородных колоний величиной от 1,5 до 2 мкм в диаметре. При визуальном осмотре под малым увеличением микроскопа окрашенные по методу Уайт-Вилсона 3-4-суточные колонии имеют фиолетовую поверхность и фиолетовый ободок. Популяции представлены из SR-колоний.

Дифференциальные среды. Brucella abortus УФ-1 растет на среде с фуксином 1:25000. Растет в синтетической среде следующего состава: фосфатный буфер 1/15М, рН 7,4-1,0 л, сернокислый магний - 0,1 г/л, железо-лимоннокислое закисное 50 мг/л, L-цистерн 50 мг/л, L-глутаминовая кислота - 100 мг/л, DL-лейцин - 100 мг/л, 1-гистидин - 100 мг/л, 1-цистин 50 мг/л, рибофлавин, тиамин, биотин, патентенат кальция по 2 мг/л. В отличие от штамма Brucella abortus 82 не растет на средах с тионином, пенициллином в дозе 5 ед./мл среды и эритритолом в концентрации 1 мг/л.

При росте на пептонно-печеночном агаре образует сероводород, проявляет уреазную активность.

Агглютинирует с монорецепторной М-сывороткой в S- и R-специфических бруцеллезных сыворотках; в 0,9% раствора хлористого натрия рН 7,0 образует гомогенную суспензию.

Дает слабо положительную термоагглютинацию, положительную пробу в растворе трипафлавина.

При подкожном заражении 1-5 млрд взвесью Brucella abortus УФ-1 морские свинки в течение 6 месяцев не имели клинических признаков заболевания. Культура штамма вызывает умеренное обсеменение морских свинок в течение 1-2 мес. Минимальная инфицирующая доза Brucella abortus УФ-1 для морских свинок находится в пределах 10000 микробных клеток.

Элиминируется из организма морских свинок после подкожной инъекции в дозах 1-2 млрд микробных клеток через 2 месяца. Иммуногенность для морских свинок в дозе 2-4 млрд микробных клеток составляет не менее 70%, а у штамма 82 ПЧ - только 50%.

Сыворотки крови, взятые от морских свинок, через месяц после введения препарата в реакции агглютинации со стандартным S-антигеном отрицательны. Лишь некоторые из них дают положительные реакции в титре 10-20 ME, а затем утрачивают эти показатели в короткие сроки. Телята в возрасте 6-8 месяцев, иммунизированные вакциной из штамма Brucella abortus УФ-1, через месяц реагируют отрицательно. Через 5 месяцев все подопытные животные дают отрицательные показатели.

Абортогенные свойства штамма Brucella abortus УФ-1 изучали на 22 коровах, находившихся в различной стадии беременности. В течение 6 месяцев после прививки у опытных животных прошли нормальные отелы. В отличие от штамма Brucella abortus 82 аборты не отмечались.

У морских свинок, привитых штаммом УФ-1 в дозе 2 млрд м.к., формируется длительный и стойкий иммунитет. Через 3 месяца 85% морских свинок устойчивы к контрольному заражению в дозе (10 МИД) вирулентным штаммом 54, а через 5 месяцев 66,6% животных. Штамм Brucella abortus УФ-1 обладает низкой остаточной вирулентностью и лишен абортогенных свойств.

У крупного рогатого скота через два месяца после введения штамма антител в диагностических титрах не обнаруживаются. Через 5 месяцев все подопытные животные дают отрицательные показатели.

Полученный штамм обладает низкой остаточной вирулентностью и лишен абортогенных свойств.

Пример 1. Изготовление вакцины. Для изготовления вакцины против бруцеллеза штамм УФ-1 культивировали на печеночно-пептонном, глюкозо (1%) - глицериновом (2%) агаре (рН 7,2) в течение 72 часов при 37°С. Затем бактериальную массу смывали с поверхности питательного агара со средой высушивания следующего состава: сахароза - 5%, желатин - 1,5%, рН 6,6-7,0, разводили этой средой до конечной концентрации 200 млрд/мл, разливали в ампулы по 5 мл и лиофилизировали в аппарате «Lozanna».

По окончании лиофилизации ампулы с вакциной запаивали под вакуумом. Сохранность бруцелл при этих условиях лиофилизации была 75±5% при остаточной влажности 1,5-2%. Количество живых клеток определяли методом посева на ППГГА до и после лиофилизации препарата.

Пример 2. Имунногенность полученного вакцинного препарата определяли на морских свинках. Для этого лиофилизированную биомассу разводили до конечной концентрации 2 млрд микробных клеток разбавителем сухой живой вакцины (авторское свидетельство №1638855 от 30 октября 1989 г.).

Вакцину вводили подкожно в области внутренней поверхности правого бедра в дозе 1 мл. Контрольной группе морских свинок инициировали физиологический раствор хлористого натрия в той же дозе. Через 3 месяца опытных и контрольных групп морских свинок заражали культурой вирулентного штамма Brucella abortus-54 в дозе 50 (10 минимальных инфицирующих доз микробных клеток). Через месяц после заражения морских свинок усыпляли эфиром и определяли индекс инфицированности и количество иммунных животных. Опыты были повторены 5 раз с использованием 100 морских свинок. Количество иммунных морских свинок составляло 88,3±8,1% при 100%-ном инфицировании контрольных животных с индексом инфицированности 72.

Пример 3. В другой серии опытов определяли иммуногенность вакцины на крупном рогатом скоте.

Опыты проводили на трех группах крупного рогатого скота: 1 группа - 5 голов, привили суспензией бруцелл штамма УФ-1, 2 группа - 3 головы, иммунизировали вакциной из штамма 82, 3 группа - 2 головы, вводили вакцину из штамма 19. Вакцины штамма 19 и 82 использовали согласно Наставления по их применению. Для изготовления вакцины бактериальную массу бруцелл штамма УФ-1 получали из печеночно-пептонном глюкозо (1%) глицериновом (2%) агаре (ППГГА). Бактерии смывали через 2,5 суток культивирования при 37±0,5°С стерильным физиологическим раствором хлористого натрия, рН 7,1. Вакцину готовили в концентрации 20 млрд м.к./см³. Этой суспензией вакцинировали крупный рогатый скот. Доза 5 см³. Все препараты вводили подкожно в область верхней трети шеи.

В первой группе из 5 животных 4 были стельными и одна телка бесплодной, во второй и третьей группах все животные - стельные.

До вакцинации всех животных двукратно с интервалом 7 дней исследовали серологически на бруцеллез.

Через 6 месяцев после вакцинации всех 3 групп и группу непривитых коров заражали конъюктивально вирулентной культурой штамма 54 в дозе 40 МИД. Предварительно культуру вирулентного штамма оттитровали заражением аналогичного поголовья крупного рогатого скота. Через 40 дней после заражения опытных и контрольных животных убивали и исследовали бактериологически. Исследования производили из лимфоузлов (подчелюстные, заглоточные, околоушные, предлопаточные, надвымянные, крестцовые, брыжеечные), печени, селезенки, почек, матки, костного мозга на ППГГА, ППГГБ и эритрит-агар. Посевы инкубировали в термостате в течение 30 дней. По количеству выделенных культур определяли индекс инфицированности (И.И.) и процент иммунных животных по группам.

В первые дни после вакцинации у всех животных наблюдалось повышение температуры на 0,5-2,0°С, учащение пульса на 5-10 ударов/мин и дыхания на 4-8 движения в минуту. Эти показатели приходили к норме на 5-6 день после вакцинации.

На месте инъекции вакцин образовалась упругая, болезненная припухлость, размеры которой достигали максимума на 3-4 день после прививки и составили в среднем 5×6 см. Эта местная реакция полностью угасала через 25-28 дней после вакцинации.

Иммунологическая перестройка организма животных после вакцинации сопровождалась усилением фагоцитарной активности лейкоцитов.

После иммунизации телок вакциной из штамма бруцелл УФ-1 агглютинины в сыворотках крови в РА обнаруживались в титрах 1:40-1:80, а с вакциной из штамма 82 - в титрах 1:160. После иммунизации вакцин из штамма 19 титры антител достигли 1:640 и более. Максимальное содержание агглютининов в сыворотках крови отмечалось к 15 дню после вакцинации, затем их уровень постепенно снижался. Через 120-150 дней у коров, привитых штаммами УФ-1 и 82, агглютинины не обнаруживались, тогда как у коров, вакцинированных штаммом 19, они выделялись в титрах 1:320 даже через 180 дней.

Розбенгал-проба (РБП) и РСК была положительной у большинства привитых SR штаммами (УФ-1, 82) в течение первых 45 дней после вакцинации. У всех животных этих групп РБП стала отрицательной к 60 дню, тогда как у коров, привитых штаммом 19-0, так же как и РСК, она оставалась положительной в течение всего срока наблюдения (6 месяцев), Комплементсвязывающие антитела у коров, привитых штаммом УФ-1 и 82, уже не выделялись через 60 дней после вакцинации.

У всех коров, привитых штаммами УФ-1 и 19, беременность и роды проходили без осложнений. В группе животных, вакцинированных штаммом 82, одна корова №1-абортировала (возраст плода 7,5 мес), а у другой - (№9) после родов было задержание последа. Из абортированного плода коровы №1 и истечений матки были выделены культуры вакцинного штамма 82. У коровы №9 при бактериологических исследованиях выделений матки культуры вакцинного штамма не обнаруживали из-за пророста посторонней микрофлорой. Однако при радиоиммунологическом анализе истечений из матки была получена положительная реакция.

У коров №19, привитой вакциной из штамма 82, стельность протекала без осложнений в течение всего срока наблюдения. Телята, родившиеся от всех вакцинированных коров, развивались нормально.

В результате определения устойчивости животных конъюнктивальному заражению установили, что у непривитых коров происходило интенсивное расселение бруцелл штамма 54. При этом у всех трех животных наблюдалась генерализованная форма бруцеллеза (И.И. - 60,2), тогда как у всех вакцинированных групп животных проявилась более высокая устойчивость. В частности, в группе коров, привитых культурой штамма УФ-1, из 5 животных, иммунными были 3 (60%). В отличие от непривитых животных у вакцинированных коров, заразившихся бруцеллами, генерализация процесса не происходила и бруцеллы выделялись лишь из региональных лимфатических узлов (И.И. - 14,3).

Из трех коров, привитых штаммом 82, заразилась одна (И.И.-7,0). Из двух коров, вакцинированных штаммом 19, у одной отмечался прорыв иммунитета (И.И.-3,4).

Результаты исследований по определению иммуногенности лабораторных образцов вакцин из штамма УФ-1 в зависимости от сроков хранения приведены в таблице 1.

Таблица 1 Иммуногенность лабораторных образцов вакцин штамма УФ-1 для морских свинок в зависимости от срока хранения № п/п Группа морских свинок, привитых вакциной сроки хранения (мес) кол. жив. из них имм. выделено культ. И.И.   гол. %     1 Серия 1.2.87 10 20 15 75,0 8 4,0 2 Серия 1.2.87 6 28 22 78,6 26 9,2 3 Серия 6.1.88 4 34 28 82,4 26 7,6 4 Серия 4.2.88 3 22 18 81,6 34 15,6 5 Серия 25.4.88 10 дней 25 24 96,0 2 0,8 6 Серия 25.4.88 12 25 18 72,0 16 6,4 7 Контроль непривитые (зараж. шт. 54,108±7 м.к.)   10 0 0 64 64

Анализируя эти данные, можно отметить, что вакцина 6-12-месячным сроком хранения защищала от инфицирования 72,0-78,6% морских свинок, 3 и 4-месячного хранения 81,6 и 82,4%. При этом у всех непривитых морских свинок наблюдался генерализованный процесс (И.И. - 64). У свежеприготовленных вакцин иммуногенность несколько выше по сравнению с препаратами длительного хранения.

Вакциной серии 1.2.87 был поставлен опыт на трех телятах 4-4,5 месячного возраста. Вакцину, разведенную в специальном разбавителе, вводили подкожно в область верхней трети шеи - в объеме 4 см³ (50 млрд. м.к.). Спустя 4,5 месяца после иммунации вакцинированных и непривитых телят (контрольных) заразили конъюктивально культурой вирулентного штамма 54 в дозе 10 МИД.

Через 33 дня после заражения всех животных убивали и подвергали бактериологическим исследованиям (таблица 2).

Как видно из приведенных данных, все непривитые телята заразились и инфекционный процесс у них имел генерализованную форму (И.И. - 48,1). Все три вакцинированных телят оказались устойчивыми к заражению вирулентным штаммом бруцелл и от них культуры не выделялись.

Таблица 2 Результаты бактериологических исследований материала от вакцинированных и непривитых телят после заражения их вирулентным шт.54 Группы животных кол-во животн. из них заразилось иммун. %% количество И.И. иссл. орг. выд. 1. Привитые вакциной из штамма УФ-1 3 0 100,0 65 0   2. Непривитые 3 3 0 76 32 48,1

В другой серии опытов 10 телок 15-16-месячного возраста привили сухой вакциной из штамма УФ-1 в дозе 100 млрд м.к. Для исследования брали пробы пункцией яремной вены до и через 7, 14, 30, 45, 60 дней и через каждый месяц до 300 дней после вакцинации. С сыворотками крови ставили объемную РА со стандартным антигеном (единый бруцеллезный) и гомологичным (приготовлен из штамма УФ-1 в лаборатории биохимии). РСК ставили со стандартным и Р-антигенами, приготовленным в лаборатории по изучению бруцеллеза с.н.с. А.М.Фоминым. Результаты исследований свидетельствуют о слабой агглютиногенности вакцины из штамма УФ-1. Агглютинины у привитых животных на 7-15 дни после вакцинации регистрировались со стандартным антигеном в титрах 1:40-1:80 ME. С 30 дня после прививки титры агглютининов начали снижаться. В РСК со стандартным антигеном две телки реагировали положительно в титре 1:5 на 7 день. У одной из них положительная реакция на этом уровне сохранялась и к 15 дню исследования. Последующие сроки исследования РСК у всех животных была отрицательной. РА с гомологичным антигеном у отдельных животных была несколько выше по сравнению со стандартным. Однако тенденция нарастания и угасания агглютининов с обоими антигенами была сходной.

Все привитые животные реагировали в РСК положительно с R-антигеном, что свидетельствует о приживаемости вакцинного штамма в организме. На 7 сутки титры антител составляли 1:5-1:20, на 14 день - 1:5-1:10. Через месяц началось снижение количества антител и через 45 дней лишь две телки реагировали в титре 1:5. В более поздние сроки антитела с R-антигеном не обнаруживались.

Для определения иммуногенности вакцины телок, привитых в дозе 100 млрд м.к., через 315 дней после вакцинации заразили конъюнктивально оттитрованной культурой вирулентного штамма 54 (10 МИД - 50 млн.м.к.). Одновременно заражали трех аналогичных телок, непривитых против бруцеллеза.

Результаты бактериологических исследований, приведенные в таблице 3, показывают, что иммунизированные вакциной УФ-1 телки проявляли высокую устойчивость (70%) к возбудителю бруцеллеза в дозе 10 МИД через 10,5 месяца после вакцинации. Лишь от трех животных выделялись культуры вирулентного штамма из отдельных региональных лимфатических узлов. У невакцинированных животных развилась генерализованная бруцеллезная инфекция (И.И.- 49,3).

В этих опытах две телки были стельными к моменту вакцинации (срок стельности 1-1,5 месяца). У этих животных беременность протекала без осложнений и завершилась родами. Полученные телята нормально развивались в течение срока наблюдения (до 1 месячного возраста). Кроме того, две телочки были осеменены в период опыта и от них родились телята через 20 и 35 дней после заражения.

У всех 4 телят в сыворотках крови после рождения (до приема молозива) антитела в РА и РСК не обнаруживались. При бактериологических исследованиях их через 10 и 30 дней после рождения культуры бруцелл не выделялись.

Таблица 3 Результаты бактериологических исследований крупного рогатого скота после заражения Группы животных количество животных иммунных % колич. иссл. орг. выделен. культ. И.И. в опыте из них зараж. 1. Привитые шт. УФ-1 10 3 70 248 5 2,0 2. Контроль непривитые 3 3 0 75 37 49,3

В результате проведенных исследований отобран слабоагглютиногенный неабортогенный вакцинный штамм Бруцелла абортус УФ-1, который имеет отличительные генетические маркеры: имеет SR-форму, чувствителен к пенициллину и эритриту.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Вакцинный штамм Brucella abortus УФ-1 используется для приготовления биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ» под регистрационным номером 289. Штамм имеет низкую остаточную вирулентность и высокую иммуногенность. 3 табл.

Штамм Brucella abortus УФ-1 для приготовления биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики бруцеллеза сельскохозяйственных животных депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ» под регистрационным номером 289.