СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 G01N27/48 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инфекций.

Изобретение направлено на решение задачи:
-диагностика в максимально ранние сроки от начала заболевания, повышение точности и производительности, объективизация и уменьшение трудоемкости способа.

Сущность изобретения: указанная задача достигается тем, что диагностическое исследование производят с кровью больного, определяя полярографическим методом количество антигена, связанного клетками крови больного в сравнении с контрольными исследованиями.

Исследование не плазмы, а чувствительности клеток крови к антигенам вирусов обеспечивает диагностику вирусных заболеваний в самые ранние сроки от момента заражения (с 3 дня от момента заражения).

Полярографическое исследование позволяет количественно (после составления калибровочной кривой) определить степень связывания антигена клетками крови. В свою очередь, сравнение полярограмм здоровых контрольных доноров и больных лиц позволяет поставить диагноз.

Поставленная задача достигается путем забора пробы крови, получение форменных элементов крови с последующим добавлением к ним 0,9% раствора хлорида натрия, а затем раствора гемагглютинина клещевого энцефалита, инкубирования полученной смеси и определения диагностически значимого показателя. Новое в способе то, что полученные форменные элементы крови больного разводят 0,9% раствором хлорида натрия до концентрации форменных элементов 5-10% к смеси добавляют раствор гемагглютинина клещевого энцефалита при их объемном соотношении 1:1, полученную взвесь инкубируют в течение 3-5 мин при температуре 37-37,5^oC с последующим центрифугированием, после чего снимают полярограмму надосадочной жидкости при использовании в качестве фонового раствора 0,01-0,02 N раствора хлорида калия и сравнивают с эталонной полярограммой, которую снимают после добавления в ячейки электролизера с фоновым раствором раствора гемагглютинина клещевого энцефалита в количестве, при котором величина отклонения пера самописца от нулевой отметки равна примерно 100 мм, и при снижении величины отклонения пера самописца от нулевой отметки более, чем на 15% по сравнению с величиной отклонения пера самописца на эталонной полярограмме, диагносцируют клещевой энцефалит.

Способ осуществляют следующим образом.

Сначала подбирают дозу антигена (гемагглютинин вируса клещевого энцефалита производства "Томского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института вакцин и сывороток, разведенный боратным буфером с pH-9,0), которая при полярографическом исследовании дает величину волны высотой около 100 мм.

Для исследования берут 0,1 мл крови донора, смешивают с консервантом (0,1 мл "Глюгицира"), центрифугируют в течение 5-10 мин при 500 об/мин, удаляют плазму с антикоагулянтом, разбавляют клетки крови в 0,9% растворе хлористого натрия до 5-10% смешивают 0,1 мл этой взвеси с 0,1 мл антигена (гемагглютинина клещевого энцефалита), инкубируют полученную смесь 3-5 мин в термостате при температуре 37-37,5 градусов, повторно центрифугируют, после чего снимают полярограмму антигена надосадочной жидкости в 0,01-0,02 N растворе хлористого калия. Полученную полярограмму принимают за эталон. У здоровых лиц связывание антигена клетками крови не превышает 5-15% в сравнении в величиной волны той же дозы антигена в 0,01-0,02 N растворе хлористого калия.

Первоначально составляется калибровочная кривая-эталон. Для составления электропроводности исследуемого нами антигена (гемагглютинина клещевого энцефалита) в фоновом растворе в ячейке электролизера ртутно-капельного полярографа при всегда одинаковых параметрах работы полярографа.

Ячейка электролизера предварительно заполнена фоновым раствором 0,01-0,02 N KCl. При подаче напряжения на электроды электролизера в фоновом растворе ячейки полярографа появляется электрический ток, который регистрируется самописцем полярографа в виде стандартной кривой 0,01-0,02 N KCl. Величина тока зависит от количества электропроводящих ионов в растворе ячейки электролизера полярографа, каковыми являются в нашем исследовании ионы KCl фонового раствора и добавляемый в ходе исследования антиген (гемагглютинита клещевого энцефалита). Самописец полярографа графически отображает величину тока между электродами ячейки полярографа на бумажной ленте. Определяют зависимость между величиной электрического тока между электродами ячейки по степени отклонения пера самописца на бумаге и количеством добавленного в ячейку антигена гемагглютинина клещевого энцефалита (фоновый раствор KCl всегда постоянный). На этом основании составляют калибровочную кривую эталон измеряя величину отклонения пера самописца полярографа после внесения в электролизер исследуемого нами количества антигена гемагглютинина клещевого энцефалита.

После составления калибровочной кривой-эталона исследуют способность клеток крови здоровых лиц либо больных не клещевым энцефалитом связывать на своей поверхности антиген гемагглютинина клещевого энцефалита. Для этого клетки крови разводят в 0,9% растворе хлористого натрия, добавляют антиген гемагглютинина клещевого энцефалита и после инкубации в термостате клеток крови с антигеном гемагглютинина клещевого энцефалита эту смесь центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают микропипеткой и вносят в ячейку электролизера ртутно-капельного полярографа, в которую заранее внесен фоновый раствор 0,01-0,02 N KCl. При подаче напряжения на электроды электролизера в растворе появляется электрический ток, который вызывает отклонение пера самописца полярографа от стандартной кривой фонового раствора. Параметры исследования всегда являются постоянными. В этом случае величина тока зависит от количества электропроводящих ионов в растворе ячейки электролизера полярографа, каковыми являются в нашем исследовании ионы KCl фонового раствора и антиген гемагглютинина клещевого энцефалита. Самописец полярографа графически отображает величину тока между электродами ячейки полярографа на бумажной ленте, показывая зависимость между величиной электрического тока между электродами ячейки и количеством добавленного в ячейку антигена клещевого энцефалита, оставшегося в надосадочной жидкости после контакта с клетками крови здоровых лиц или лиц, больных не клещевым энцефалитом (фоновый раствор KCl всегда постоянный) Для определения степени связывания антигена гемагглютинина клещевого энцефалита клетками крови здоровых лиц или больных не клещевым энцефалитом величину электрического тока по степени отклонения пера самописца на бумаге в миллиметрах делят на величину электрического тока, полученную при определении эталона и определяют процент связывания количества антигена клещевого энцефалита в данном исследовании. У здоровых лиц или больных не клещевым энцефалитом степень связывания антигена не превышает 15%
Пример 1. Б-ой Черных О.К. 35 лет поступил в отделение клещевого энцефалита Областной клинической больницы 27 июня с жалобами на головную боль, слабость, тошноту, головокружение. Температура 38,8^oC. Отмечает мышечную слабость. Укус клеща не помнит. Потери сознания не было.

При полярографическом исследовании гемагглютинина клещевого энцефалита в 0,01 N KCl средняя величина отклонения пера самописца составила 98 мм. После 5 мин термостатирования при температуре 37,5 ^oC. С такой же дозы антигенна с 5% взвесью форменных элементов крови в 0,9% растворе NaCl в соотношении 1:1 средняя величина отклонения пера самописца была 86 мм, т.е. уменьшилась на 12 мм 8,7% что находится в пределах естественного связывания антигена кровью здоровых лиц или больных не клещевым энцефалитом.

Пример 2. Б-ая Тихонова Л.К. 31 года поступила в отделение клещевого энцефалита Областной клинической больницы 28 июня с жалобами на сильную головную боль, слабость, тошноту, рвоту, головокружение, ригидность затылочных мышц. Температура 39,3 ^oC. Потери сознания не было. Укус клеща был 2 недели назад.

При полярографическом исследовании гемагглютинина клещевого энцефалита в 0,02 N KCl средняя величина отклонения пера самописца составила 98 мм. После 5 мин термостатирования при температуре 37^oC такой же дозы антигена с 5% взвесью форменных элементов крови в 0,9 растворе NaCl средняя величина отклонения пера самописца составила 66,6 мм, т.е. уменьшилась на 31,4 мм 32% По последующем наблюдении диагноз клещевого энцефалита был подтвержден как клинически, так и серологически.

Пример 3. Б-ная Жукова Г.В. 29 лет поступила в отделение клещевого энцефалита Областной клинической больницы 28 июня с жалобами на сильную головную боль, общую слабость, тошноту, рвоту, головокружение, ригидность затылочных мышц. Температура 39,8 ^oC. Потери сознания не было. Уксус клеща был 10 дней назад.

При полярографическом исследовании гемагглютинина клещевого энцефалита в 0,01 N KCl средняя величина отклонения пера самописца составила 98 мм. После 5 мин термостатирования при температуре 37^oС. С такой же дозы антигена с 10% взвесью форменных элементов крови в 0,9% растворе NaCl средняя величина отклонения пера самописца была 50,3 мм,т.е. уменьшилась на 47,7 мм 51,3% При последующем наблюдении диагноз клещевого энцефалита был подтвержден как клинически, так и серологически.

В таблице дано изменение величины электрического тока между электродами ячейки электролизера полярографа по отклонению пера самописца в миллиметрах от стандартной кривой фонового раствора.

Как видно из таблицы, в N проб 1, 11 и 12 процент связывания антигена гемагглютинина клещевого энцефалита до и после контакта с клетками крови по степени отклонения пера самописца варьирует от 0 до 7,8% по сравнению с эталоном. Это больной не клещевым энцефалитом (N 1) и здоровые люди (N 11 и N 12).

В N проб 2 10 процент связывания антигена гемагглютинина клещевого энцефалита до и после контакта с клетками крови по степени отклонения пера самописца варьирует от 28,2 до 61,9% по сравнению с эталоном. Это уровень связывания антигена гемагглютинина клещевого энцефалита с клетками крови больных лиц.

Заключение: учитывая, что основным методом диагностики клещевого энцефалита являются клинические и серологические, результаты которых имеют лишь ретроспективное значение (серологические исследования парных сывороток производится через 10-15 дней от начала заболевания, а заявляемый способ позволяет поставить диагноз заболевания в течение 25-30 мин от начала обследования пациента (как при обращении по поводу укуса клеща, так и при заболевании) и может быть использован для дифференциальной диагностики от сходных с клещевым энцефалитом по клиническим признакам заболеваний.

Предлагаемый способ точен, т.к. при повторных полярографических исследованиях результаты были практически одинаковыми.

Предлагемый способ объективен, т.к. заключение о наличии заражения или заболевания клещевым энцефалитом делается на основании высоты полярографической волны антигена надосадочной жидкости, что осуществляется простым замером с помощью миллиметровой линейки, исключая всякий субъективизм в оценке результатов.

Предлагаемый способ значительно уменьшает трудоемкость и повышает производительность исследования по сравнению с аналогами.

Использование: медицина, для диагностики клещевого энцефалита. Сущность изобретения: берут пробу крови, получают форменные элементы с последующим добавлением к ним 0,9% раствора хлорида натрия, а затем раствора гемагглютинина клещевого энцефалита, инкубируют полученную смесь и определяют диагностически значимый показатель, при этом полученные форменные элементы крови разводят 0,9% раствором хлорида натрия до концентрации форменных элементов 5-10%, к смеси добавляют раствор гемагглютинина клещевого энцефалита при их объемном соотношении 1:1, полученную смесь инкубируют в течение 3-5 мин при температуре 37-37,5^oC с последующим центрифугированием, после чего снимают полярограмму надосадочной жидкости при использовании в качестве фонового раствора 0,01-0,02 N раствора хлорида калия, и сравнивают с эталонной полярограммой, которую снимают после добавления в ячейки электролизера с фоновым раствором раствора гемагглютинина клещевого энцефалита в количестве, при котором величина отклонения пера самописца от нулевой отметки равна примерно 100 мм, и при снижении величины отклонения пера самописца от нулевой отметки более, чем на 15%, по сравнению с величиной отклонения пера самописца от нулевой отметки на эталонной полярограмме, диагносцируют клещевой энцефалит. Способ прост, точен, не требует дополнительных материальных затрат.

Способ диагностики клещевого энцефалита, включающий забор пробы крови, получение форменных элементов крови с последующим добавлением к ним 0,9% раствора хлорида натрия, а затем раствора гемагглютинина клещевого энцефалита, инкубирование полученной смеси и определение диагностически значимого показателя, отличающийся тем, что полученные форменные элементы крови разводят 0,9%-ным раствором хлорида натрия до концентрации форменных элементов 5 10% к смеси добавляют раствор гемагглютинина клещевого энцефалита при их объемном соотношении 1 1, полученную смесь инкубируют в течение 3 5 мин при 37 37,5^oС с последующим центрифугированием, после чего снимают полярограмму надосадочной жидкости при использовании в качестве фонового раствора 0,01 - 0,02 N раствора хлорида калия и сравнивают с эталонной полярограммой, которую снимают после добавления в ячейки электролизера с фоновым раствором раствора гемагглютинина клещевого энцефалита в количестве, при котором величина отклонения пера самописца от нулевой отметки равна примерно 100 мм, и при снижении величины отклонения пера самописца от нулевой отметки более чем на 15% по сравнению с величиной отклонения пера самописца от нулевой отметки на эталонной полярограмме диагносцируют клещевой энцефалит.