СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и может быть использовано для лабораторной диагностики рассеянного склероза.

Известен способ диагностики рассеянного склероза /патент N 2007714, опубликованный 15.02.94. Бюл.N3/. Способ заключается в изучении ответа лимфоцитов крови больного на вводимый подкожно 0,1% раствор серотонина в реакции бляшкообразования.

Недостатки: метод сложный по постановке, требует дорогостоящих реактивов /агар Дифко, фикол-верографин, сухой комплемент, хлорид хрома/. Кроме того, подкожное введение раствора серотонина связано с опасностью возникновения у больного аллергической реакции и инфицирования.

Изобретение направлено на решение задачи: безопасность и упрощение способа при высокой точности и специфичности.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в условиях in vitro изучают ответ лимфоцитов крови больного на вносимый в суспензию клеток его крови серотонин с последующим определением числа розеткообразующих /РОК/ клеток, специфичных серотонину. И при отсутствии изменения их количества до и после внесения серотонина диагностируют рассеянный склероз (см. табл. 1 и 2).

Способ осуществляют следующим образом: З мл крови больного забирают в 5%-ный раствор цитрата натрия, затем отстаивают при комнатной температуре в течение 3 ч. После отстаивания забирают автоматической пипеткой по 0,4 мл взвеси лейкоцитов в 4 пробирки. С целью гемолиза эритроцитов добавляют к взвеси лейкоцитов 3 мл дистиллированной воды, встряхивают в течении 30 с и добавляют 3 мл 1.8%-ного раствора натрия хлорида. Смесь центрифугируют в течение 5 мин при 1.500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют пипеткой.

В одну пробирку с лейкоцитарной взвесью добавляют 1 мл пит. среды 199 для определения исходного числа РОК.

Во 2, 3, 4 пробирки последовательно добавляют разведения серотонина 1: 10, 1:100 и 1:1000 мкг/мл в объеме 0,2 мл. Смесь инкубируют в термостате при 37-37,5^oC в течение 30 мин. После инкубации добавляют 1 мл буферного раствора pH 7,2, встряхивают в течение 30 с, центрифугируют 5 мин при 1.500 об/мин с целью удаления избытка серотонина. Оттягивают надосадочную жидкость, добавляют 1 мл пит. среды 199, встряхивают в течение 30 с и выдерживают при комнатной температуре 20 мин Центрифугируют при 1.500 об/мин.

Оттягивают надосадочную жидкость, добавляют 0,1 мл пит. среды 199, встряхивают в течение 30 с и добавляют 0,1 мл серотонинового диагностикума до исходного объема 0,2 мл взвеси. После добавления диагностикума смесь выдерживают 15-20 мин при 37-37,5^oC и 30-40 мин при 2-4^oC.

После инкубации в холодильнике стягивают надосадочную жидкость, осторожно взбивают осадок, добавляют 0,01 мл 0,5%-ного раствора глютарового альдегида. Выдерживают 20 мин при температуре комнаты. Затем добавляют 0,75 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 1.500 об/мин, в течении 5 мин. Стягивают надосадочную жидкость, добавляют 0,5 мл бычьей сыворотки. Центрифугируют при 1.500 об/мин, в течение 5 мин. Стягивают пипеткой надосадочную жидкость, осадок осторожно взбивают, пипетируя его. Готовят из него мазки, высушивают на воздухе, фиксируют в этиловом спирте в течение 30 мин. Окрашивают мазки по Романовскому-Гимза. Подсчитывают под микроскопом при 900-кратном увеличении число РОК среди 100 средних лимфоцитов.

Розеткообразующим считают лимфоцит, фиксировавший на своей мембране 3 и более бараньих эритроцитов, сенсибилизированных серотонином. Рассеянный склероз диагностируют по отсутствию изменений числа РОК, специфичных серотонину, до и через 30 мин после внесения серотонина.

Приготовление серотонинового диагностикума:
На торсионных весах взвешивают 0,1 мг сухого серотонина. К сухому веществу добавляют 5 мл буферного раствора pH 6,4. Берут 0,1 мл взвеси глютаровых эритроцитов, центрифугируют 5 мин при 1.500 об/мин. Оттягивают надосадочную жидкость, добавляют еще раз 0,5 мл буферного раствора pH 6,4, центрифугируют в течение 5 мин при 1.500 об/мин. Оттягивают надосадочную жидкость, к осадку добавляют 0,1 мл раствора серотонина. Смесь инкубируют в термостате при З7^oC в течение 30 мин периодически встряхивая с интервалом 10 мин. Центрифугируют 5 мин при 1.500 об/мин. Стягивают надосадочную жидкость, к осадку добавляют 0,5 мл буферного раствора pH 7,2, центрифугируют в течение 5 мин при 1.500 об/мин. Стягивают надосадочную жидкость, добавляют 0,1 мл буферного раствора pH 7,2 и 0,9 мл пит. среды 199.

Метод глютаризации эритроцитов барана.

1 мл эритроцитов барана разводят 9 мл 0,9%-ного физ. раствора, встряхивают и центрифугируют 10 мин при 1.500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют шприцем с длинной иглой, добавляют 0.9%-ный физ. раствор 9 мл и центрифугируют 10 мин при 1.500 об/ мин. Таким образом, отмывают бараньи эритроциты 3 раза. Готовят 5%-ную взвесь: 0,5 мл осадка эритроцитов с раствором 0,25%-ного (глютарового альдегида 1:1 и выдерживают при З7^oC в термостате 3 ч и сутки в холодильнике. Хранят до 6 месяцев.

Пример 1. Больной Р., 24 г. поступил в клинику неврологии 8.01.96 г. с жалобами на неустойчивость при ходьбе, слабость в руках и ногах, головокружение, императивные позывы к мочеиспусканию, дрожание головы, нечеткую речь. В неврологическом статусе: спастический тетрапарез с нарушением функции тазовых органов по центральному типу и мозжечковый синдром, представленный дизартрией, горизонтальным нистагмом, статической и динамической атаксией, дрожательным гиперкинезом. Из анамнеза известно, что болен в течение года, течение заболевания неуклонно прогрессирующее. Установлен клинический диагноз: Рассеянный склероз, цереброспинальная форма, гиперкинетический вариант, прогрессирующее течение.

Больному проведено иммунологическое исследование крови. С этой целью произведен забор крови, взято 0,4 мл взвеси лейкоцитов, проведен гемолиз эритроцитов, затем в 1 пробирку добавили 1 мл пит. среды 199.

Для определения исходного числа РОК, во 2, 3, 4, последовательно добавили разведения серотонина 1:10, 1:100 и 1:1000 мкг/мл. После инкубации при 37^oC, отмывали взвесь лейкоцитов с целью удаления избытка серотонина. Затем во взвесь лейкоцитов добавляли 0,1 мл серотонинового диагностикума, инкубировали при 37^oC в течение 15 мин и при 2^oC в течение 30 мин. Фиксировали розетки 0,01 мл 0,5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 20 мин, затем отмывали взвесь дистиллированной водой, готовили мазки и подсчитывали под микроскопом розеткообразующие лимфоциты, фиксировавшие на своей поверхности 3 и более бараньих эритроцитов, сенсибилизированных серотонином,
При исследовании у больного обнаружено: содержание серотониновых розеток в суспензии лейкоцитов равнялось 1%, после внесения в суспензию клеток серотонина число РОК не изменилось и составило 2% при дозе 10 мкг/мл на 10 ЯСК, 4% - при дозе 100 мкг/мл, 4% - при дозе 1000 мкг/мл.

Заключение: иммунологический анализ подтвердил клинический диагноз рассеянного склероза.

Пример 2. Больная К., 42 лет, поступила в клинику неврологии 18.06.96. с жалобами на периодическое головокружение, головные боли, слабость в ногах. Из анамнеза известно, что больна около 10 лет, течение заболевания с ремиссиями.

В неврологическом статусе: черепная иннервация без патологии, оживлены сухожильные рефлексы с ног без патологических знаков, отсутствуют брюшные рефлексы, легкая неустойчивость в позе Ромберга. Клинический диагноз: подозрение на рассеянный склероз.

Исследовали кровь, инкубируя взвесь лейкоцитов при 37,5^oC в течение 20 мин и при 4^oC в течение 40 мин. У обследуемой выявлено среди 10⁶ЯСК крови 3% РОК, специфичных серотонину. После инкубации клеток крови серотонином в дозе 10 мкг/мл число РОК возросло до 28 %, при инкубации серотонином в дозе 100 мкг/мл возросло до 25%, при инкубации серотонином в дозе 1000 мкг/мл возросло до 20%.

Заключение: лимфоциты крови больной реагируют на серотонин, вносимый in vitro. Реакция не характерна для больного рассеянным склерозом, диагноз рассеянного склероза отвергнут. При дальнейшим наблюдении за больной диагноз рассеянного склероза отвергнут окончательно.

Пример 3. Обследуемый А., 18 лет, практически здоров. При исследовании крови выявлено среди 10⁶ЯСК - 2% РОК, специфичных серотонину. После инкубации клеток крови серотонином в дозе 10 мкг/мл число РОК возросло до 16%, в дозе 100 мкг/мл число РОК возросло до 25%, в дозе 1000 мкг/мл - возросло до 18%.

Заключение: реакция не характерна для больного рассеянным склерозом.

Преимущества способа заключаются в его точности, специфичности, чувствительности, технической простоте, возможности с его помощью осуществить раннюю диагностику заболевания еще до клинических проявлений, возможности диагноза дебютов рассеянного склероза, стертых и атипичных его форм.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в неврологии и обеспечивает безопасность и упрощение способа при высокой точности и специфичности. Соединяют лимфоциты крови больного, взятые до и через 30 мин после контакта с раствором серотонина, с эритроцитами барана, обработанными серотонином. При этом лимфоциты крови больного соединяют с раствором серотонина ин витро в разведениях 1:10, 1:100 и 1:1000 мкг/мл, затем с эритроцитами барана, обработанными серотонином, взвесь выдерживают при 37 - 37,5^oC в течение 15-20 мин и при 2 - 4^oC в течение 30-40 мин. затем подсчитывают число РОК, специфичных серотонину, и при отсутствии изменения их числа до и после внесения серотонина диагностируют заболевание. 2 табл.

Способ диагностики рассеянного склероза путем соединения лимфоцитов крови больного, взятых до и через 30 мин после контакта с раствором серотонина, с эритроцитами барана, обработанными серотонином, отличающийся тем, что лимфоциты крови больного соединяют с раствором серотонина в разведениях 10, 100 и 1000 мкг/мл, затем с эритроцитами барана, обработанными серотонином, взвесь выдерживают при 37 - 37,5^oC в течение 30 - 40 мин, затем подсчитывают число РОК, специфичных серотонину, и при отсутствии изменения их числа до и после внесения серотонина диагностируют заболевание.