СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к области медицины, а именно - к иммуноневрологии.

Известен способ диагностики рассеянного склероза путем подкожного введения больному раствора рауседила с последующим изучением эффекта его воздействия, заключающемся в том, что с целью диагностики заболевания исследуют кровь до и после подкожного введения раствора рауседила, выделяя лимфоциты, соединяя их с суспензией эритроцитов барана, нагруженных серотонином, с последующим подсчетом в мазке числа розеткообразующих лимфоцитов и при отсутствии достоверного увеличения показателя между обеими пробами диагностируют рассеянный склероз. (Авт. свидетельство N 1640653, G 01 N 33/48, 1990. Юшкова Т.А., Быкова А.А., Гаришина М.Ф. Б N 13 от 7.04.91 г.).

Недостатками способа являются: техническая сложность его постановки, необходимость наличия сложного оборудования, парентерального введения медикамента и связанная с этим опасность занесения инфекции, необходимость наличия большого количества одноразовых шприцев, возможность аллергической реакции больного на введение лекарства, отсутствие ампулированного рауседила, который не выпускается в настоящее время в России и не поставляется из других государств.

Изобретение направлено на решение задачи: упрощение и удешевление способа диагностики рассеянного склероза при высокой точности и специфичности.

Задача достигается путем определения в сыворотке крови больного титра противосеротониновых антител до и через 24 часа после дачи больному таблетированного резерпина и визуальной оценки результатов. При отсутствии достоверного повышения титра противосеротониновых антител диагностируют рассеянный склероз.

Способ осуществляют следующим образом: из вены больного в сухую центрифужную пробирку забирают кровь в количестве 1,5 мл. Кровь центрифугируют для получения сыворотки. Затем сыворотку инактивируют в течение 30 мин при 56^oC. Одноразовый планшет для постановки реакции промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия. В каждую лунку вносят по 0,1-0,2 мл фосфатного буферного раствора pH 7,2. Затем в первую лунку вносят 0,1-0,2 мл исследуемой сыворотки и методом переноса готовят разведения сыворотки, кратные 2. Затем в каждую лунку, кроме последней, вносят по 0,1-0,2 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного серотонинового диагностикума. В последней лунке содержится только фосфатный буферный раствор pH 7,2 и эритроцитарный диагностикум (контроль на разбавитель). Планшет встряхивают и инкубируют в течение 50-60 мин при 37,0-37,5^oC в термостате, затем в течение 22-24 ч при комнатной температуре.

Результаты оценивают визуально согласно оценке классической реакции непрямой гемагглютинации.

Для приготовления серотонинового диагностикума используют эритроциты барана, обработанные глутаровым альдегидом. Свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида pH 7,2, центрифугируют взвесь в течение 5 мин при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5%-ную взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного изотонического раствора натрия хлорида pH 7,2. При глутаризации смешивают 5%-ную взвесь эритроцитов с 0,25%-ным свежеприготовленным раствором глутарового альдегида в соотношении 1:1. Выдерживают смесь при 37,0 - 37,5^oC в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от глутарового альдегида забуференным изотоническим раствором натрия хлорида pH 7,2 и этим же раствором доводят объем до первоначального (5%-ная взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранят при 4^oC в течение 6 мес.

Для сенсибилизации эритроцитов серотонином глутаризованные эритроциты дважды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида pH 6,4. Затем соединяют с раствором серотонина (1 мг сухого вещества растворяют в 5 мл фосфатного буферного раствора pH 6,4) в соотношении 1:1. Смесь инкубируют 30 мин при 37^oC, периодически встряхивая, после чего дважды отмывают забуференным раствором натрия хлорида pH 7,2. Слив надосадочную жидкость, этим же буфером доводят объем до первоначального (5%-ная взвесь). Используют 1% взвесь сенсибилизированных эритроцитов, которую готовят из исходной (5%-ной) взвести путем соединения ее с фосфатным буферным раствором pH 7,2.

После забора крови для определения исходного уровня титра противосеротониновых антител больной однократно перорально принимает 1 мг резерпина. Через 24 ч после приема препарата осуществляют повторный забор крови из вены и вновь определяют в сыворотке крови титр противосеротониновых антител вышеизложенным образом. Рассеянный склероз диагностируют при отсутствии достоверного повышения титра противосеротониновых антител.

Результаты проведенных исследований приведены в таблицах 1-4.

Пример 1. Больная Б., 33 лет, считает себя больной в течение года, когда после психотравмирующей ситуации развилась интенсивная диффузная головная боль, двоение, головокружение, пошатывание при ходьбе. Через 1 месяц появилась и стала прогрессивно нарастать слабость в правых конечностях. После курса лечения все описанные симптомы регрессировали. После гиперинсоляции вновь отметила слабость в правых конечностях, двоение, координаторные нарушения. На момент осмотра предъявляет жалобы на слабость в правых конечностях, пошатывание при ходьбе, приступы головокружения, двоение, шум в ушах на фоне периодической головной боли в теменно-затылочной области давящего характера. При объективном обследовании обнаружены: недостаточность лицевого и подъязычного черепных нервов центрального характера справа, двусторонний горизонтальный мелкоразмашистый нистагм; спастический правосторонний гемипарез с патологическими рефлексами, отсутствие брюшных рефлексов; снижение вибрационной чувствительности в правых конечностях.

Установлен диагноз: рассеянный склероз, цереброспинальная форма, ремиттирующее течение, фаза обострения.

Заявляемым способом проведено иммунологическое исследование исходной крови больной и взятой через 24 ч после приема резерпина. К разведениям сыворотки от 1: 2 до 1:1024 добавили 0,1 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана, обработанных серотонином, после чего смесь инкубировали при 37^oC в течение 60 мин, затем при комнатной температуре в течение 24 ч. В исходный сыворотке крови больной противосеротониновых АТ не обнаружено, после приема резерпина титр антител составил 1:2.

Таким образом, с помощью заявляемого способа иммунологически подтвержден клинический диагноз рассеянного склероза.

Пример 2. Больная Х., 47 лет, предъявляет жалобы на приступы несистемного головокружения, шаткость походки, снижение остроты зрения на оба глаза до 0,05, быструю утомляемость. Больной себя считает с 35 лет, когда впервые был диагностирован ретробульбарный неврит. Практически полное восстановление зрения под влиянием гормональной терапии наступило через 2-3 нед. Спустя 12 мес. после респираторного заболевания вновь развился ретробульбарный неврит с глубоким и стойким снижением остроты зрения. Третье обострение заболевания произошло через 6 лет во время приема горячей ванны: вновь развился ретробульбарный неврит, к которому вскоре присоединились мозжечковый синдром и пирамидные расстройства в виде правостороннего спастического гемипареза. После курса гормональной терапии симптомы заболевания полностью регрессировали. Неврологически определяется симметричное оживление сухожильных рефлексов с обеих сторон, отсутствие нижних брюшных рефлексов и асимметрия верхних и средних, слабо выраженная атаксия.

Клинический диагноз: рассеянный склероз, цереброспинальная форма, ремиттирующее течение, фаза ремиссии.

Заявляемым способом было проведено иммунологическое исследование исходной крови больной и взятой через 24 ч после приема резерпина. К разведениям сыворотки от 1:2 до 1:1024 добавили 0,2мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана, обработанных серотонином, после чего смесь инкубировали при 37,5^oC в течение 50 ч, затем при комнатной температуре в течение 22 ч. Исходный титр противосеротониновых АТ составил 1:4, после приема резерпина он не изменился и был равен 1:4.

Таким образом, с помощью заявляемого способа иммунологически подтвержден клинический диагноз рассеянного склероза.

Пример 3. Больной Ш., 40 лет, поступил в клинику нервных болезней с жалобами на периодическое двоение, шаткость походки, невозможность выполнения мелких движений пальцами, постоянные головные боли давящего характера в затылочной и лобной областях. Болен в течение 5 лет, когда постепенно появились вышеописанные жалобы. Ухудшение состояния в виде усиления головных болей отмечает в теплое время года. Проводимое лечение заметного эффекта не давало. Летом 1995 года установлен диагноз: рассеянный склероз, цереброспинальная форма, прогредиентное течение. Больной освидетельствован ВТЭК, установлена II группа инвалидности по этому заболеванию. В неврологическом статусе выявляется резко выраженный двусторонний горизонтальный нистагм; сухожильные рефлексы равномерно оживлены с обеих сторон; речь скандированная, грубо выраженный атактический синдром. Больной эйфоричен, некритичен к своему состоянию.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови заявляемым способом установлен фоновый титр противосеротониновых АТ, равный 1:16, после приема резерпина он увеличился и составил 1:128. При исследовании сыворотки крови больного заявляемым способом диагноз рассеянного склероза не подтвердился.

При дальнейшем клиническом обследовании больному проведена компьютерная томография головного мозга, где обнаружены признаки атрофии мозжечка, расширение полушарных борозд, цистерн варолиева моста и среднего мозга, симметричное расширение желудочков, гипоплазия мозолистого тела. Диагноз рассеянного склероза был отвергнут, диагностирована: гередитарная атаксия с грубыми инкоординаторными нарушениями.

Пример 4. Больной Х., 32 лет, предъявляет жалобы на боли в пояснице с иррадиацией по наружной поверхности левого бедра и голени, онемение наружного края левой стопы. Боли усиливаются при движении. Болен 2 года, обострения бывают 1-2 раза в год после физических нагрузок. При осмотре отмечается вертебральный синдром в виде ограничения объема движений в поясничном отделе позвоночника, резкой сглаженности поясничного лордоза, левостороннего сколиоза, дефанса мышц поясницы; положительный симптом Ласега и Нери слева, гипестезия по наружной поверхности левой голени. Коленные рефлексы живые, равные. Правый ахиллов рефлекс снижен, левый не вызывается.

На рентгенограмме пояснично-крестцового отдела позвоночника определяются косвенные признаки грыжи диска L4. Клинический диагноз: остеохондроз поясничного отдела позвоночника, грыжа диска L4, компрессионно-корешковый синдром.

При исследовании крови заявляемым способом титр противосеротониновых АТ в исходной крови составил 1:32, после введения резерпина титр увеличился до 1:128. Иммунная реакция для рассеянного склероза не характерна.

Пример 5. Донор О. (женщина), 30 лет, практически здорова.

При исследовании крови заявляемым способом фоновый титр противосеротониновых АТ был равен 1:16, после введения резерпина титр увеличился до 1:64. Иммунная реакция для рассеянного склероза не характерна.

Преимущества заявляемого способа заключаются в его простоте, для его выполнения не нужна сложная аппаратура, дорогостоящие реактивы, он безопасен для больного, обладает высокой точностью и специфичностью.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммуноневрологии. Способ осуществляется путем взятия крови из вены больного до и через 24 часа после перорального приема 1 мг резерпина. При исследовании соединяют 0,1-0,2 мл сыворотки крови больного в разведениях, кратных 2, с 0,1-0,2 мл 1%-ной взвеси эритроцитов барана, нагруженных серотонином. Смесь выдерживают при 37,0-37,5^oC в течение 50-60 мин и при комнатной температуре в течение 22-24 ч. При отсутствии достоверного повышения титра противосеротониновых антител диагностируют рассеянный склероз. Способ прост, не требует сложной аппаратуры, дорогостоящих реактивов, безопасен для больного, обладает высокой точностью и специфичностью. 4 табл.

Способ иммунодиагностики рассеянного склероза путем взятия крови из вены больного до и после введения резерпина, отличающийся тем, что кровь исследуют до и через 24 ч после перорального приема 1 мг резерпина, соединяя 0,1 - 0,2 мл сыворотки крови больного в разведениях, кратных 2, с 0,1 - 0,2 мл 1%-ной взвеси эритроцитов барана, нагруженных серотонином, смесь выдерживают при 37,0 - 37,5^oC в течение 50 - 60 мин и при комнатной температуре в течение 22 - 24 ч и при отсутствии достоверного повышения титра противосеротониновых антител диагностируют рассеянный склероз.