СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПИДНОГО НОСИТЕЛЯ ХОЛЕСТЕРИНА Российский патент 1997 года по МПК A61K31/575 A61K31/685 

Изобретение относится к медицине и биохимии и более конкретно к технологии липосомального фосфолипидного носителя холестерина (ФНХ), представляющего собой липосомальную суспензию с высоким содержанием холестерина в бислоях липосом.

Изобретение может быть использовано в медицине, в частности в онкологии и иммунологии, а также экспериментальной биологии, как средство направленного транспорта холестерина в ткани организма.

В онкологии ФНХ может быть использован, как средство направленного транспорта гидрофобных биологически активных веществ в опухолевые клетки. Введение ФНХ в кровь приводит к избирательному взаимодействию последнего с липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) классом липопротеинов, ответственным за доставку холестерина в периферические ткани. Холестерин, как известно, обладает цитостатическими свойствами, а высокое содержание ЛПНП-рецепторов некоторых типах опухолевых клеток по сравнению с нормой, обеспечивает селективную доставку в них этого цитостатика [1] Совместно с холестерином в мембрану частиц ФНХ могут быть встроены и другие гидрофобные биологически активные вещества цитостатики, селективность доставки которых в опухолевые клетки будет обеспечена высоким содержанием холестерина в ФНХ.

В косметологии ФНХ может быть использован для проникновения биологически активных веществ в глубокие слои кожи [2] что позволяет доставлять туда гидрофильные биологически активные вещества, заключенные во внутреннем водном объеме липосом. При этом высокое содержание холестерина в бислоях липосом обеспечивает стабилизацию концентрации биологически активного вещества во внутреннем объеме, вследствие "уплотнения" холестерином бислоев.

Вопрос о роли холестерина в развитии онкологических заболеваний вызывает внимание многих исследователей. Литературные данные свидетельствуют, что изменение в молярном соотношения холестерин/фосфолипиды (ХЛ/ФЛ) путем встраивания холестерина из холестерин-донорных липосом в клетки асцитных опухолей гепатомы Зайдела и лимфоидной лейкемии L1210 "in vitro" оказывало выраженное цитостатическое действие на их дальнейшую пролиферацию [3] Существующие данные указывают, что в этом процессе перенос холестерина производят ЛПНП. Обнаружено, что введение высоких концентраций холестерина или его аналогов в состав липидных монослоев, липосом или мицелл приводит к появлению высокой селективности их взаимодействия с ЛПНП, по сравнению с другими классами липопротеинов [4]
Для получения липосомального препарата ФНХ, эффективно взаимодействующего с ЛПНП, необходимо получить липосомы с максимальным содержанием холестерина в них. При этом необходимо учитывать размер получаемых липосом т.к. он влияет на скорость выведения липосом из кровотока большие липосомы удаляются быстрее, чем малые [5, 6]
Известно, что молярное соотношение Х/Ф в нормальных мембранах эритроцитов человека равно 0,75-1,0. При заболевании печени оно может увеличиваться до 1,0-1,6. От соотношения Х/Ф в мембранах зависит структура бислоя. Так, например, при молярном соотношении Х/Ф 1:2 изменяется ассиметрия распределения холестерина на поверхностях бислоя и мобильность полярных головок и т. п. Молярное соотношение Х/Ф 1:1 в липосомах можно получить, если исходная смесь холестерина и фосфолипида имела избыточное соотношение от Х/Ф 1,1:1 до Х/Ф 1,9: 1, а УЗ-облучение было достаточно продолжительным. Для некоторых фосфолипидов (яичный фосфатидилхолин, сфингомиелин) молярное соотношение Х/Ф 2: 1 можно получить, если исходная смесь холестерина и фосфолипида имела избыточное соотношение более Х/Ф 2:1.

Для гомогенных однослойных липосом, получаемых при длительной ультразвуковой обработке при высокой температуре, максимально достигаемое молярном отношении холестерин/фосфолипиды не превышает 1,8-2. При этом получаемые препараты имеют ограниченную концентрацию по общему липиду до 34 мг/мл, что ограничивает их возможности в применении [7]
Для гетерогенных липидных дисперсий, содержащих однослойные и многослойные липосомы, а также аморфные липидные структуры, значение молярного отношения холестерин/фосфолипиды может быть значительно выше. Оно достигало 3 для обработанных ультразвуком дисперсий на основе сфингомиелина и дипальмитоилфосфатидилхолина и 2,4 для дисперсий на основе яичного фосфотидилхолина [9] Однако, такие богатые холестерином липидные дисперсии не обладают стабильностью. Для стабилизации таких дисперсий вводятся детергенты или сыворотка крови [8, 9] Однако это вызывает при введении препарата в организм побочные аллергические реакции (реактогенность), что может привести даже к смертельному исходу.

Таким образом, требования предъявляемые к препарату следующие:
высокое молярное отношение холестерин/фосфолиды;
высокая стабильность;
малые размеры липосом и узкое распределение липосом по диаметрам;
отсутствие неприемлемых стабилизирующих добавок;
высокая концентрация по общему липиду;
минимальная токсичность и реактогенность после введения в организм.

Хорошо описаны различные методы получения липосом, включающих биологически активные вещества, в том числе и холестерин, основанные на растворении фосфолипидов и липофильных веществ, таких как холестерин, в органическом растворителе, упаривании их из растворителя и высушивание в виде пленки на стенках колбы роторного испарителя, гидратацию высушенной фосфолипидной пленки с образованием крупных липосомальных структур, гомогенизацию первичной липосомальной суспензии, центрифугирование, с целью отделения посторонних частиц и крупных липосомальных структур, и стерилизующую фильтрацию полученной липосомальной суспензии.

Существуют различные способы достижения необходимых параметров дисперсности липосомальных частиц при гомогенизации липосомальных препаратов. К ним относятся ультразвуковое облучение (УЗ), экструзия через фильтры и гомогенизация при высоком давлении с помощью плунжерных гомогенизаторов.

Известен способ получения липосом, содержащих холестерин, описанный в работе [9]
В этом способе решается задача максимального включения в фосфолипидные бислои липосом холестерина с целью последующего встраивания холестерина в мембрану эритроцитов путем инкубирования холестеринсодержащих липосомальных суспензий с сывороткой крови.

Молярное соотношение холестерин/фосфолипиды (Х/Ф) в приготавливаемых суспензиях изменялось от 0 до 3,0. При этом в мембранах эритроцитов после инкубации молярное соотношение Х/Ф изменялось от 0,4 до 2,7 и строго коррелировалось с соотношением Х/Ф в суспензиях.

Этот способ получения липосом, содержащих холестерин, включает растворение фосфолипидов и холестерина в органическом растворителе, смешивание этих растворов в нужном соотношении, выпаривание растворителя и высушивание в роторном испарителе с образованием тонкой пленки (метод пленок), смыв пленки бидистиллированной водой гидратацию с образованием бислойных структур нужной концентрации по фосфолипиду и холестерину, ультразвуковое (УЗ) облучение в течение 50 мин при мощности излучения 85 Вт на приборе "Branson Sonifier" со стандартным титановым наконечником и центрифугирование для осаждения титановых частиц, попавших с УЗ-наконечника в липосомальную суспензию.

Отличительной способностью способа является то, что для получения в липосомальной суспензии молярного соотношения Х/Ф 3,0, холестерин добавлялся в большом избытке, а именно в количестве 80 мг, что по молярному отношению к фосфолипиду дает отношение 4,0.

Было использовано 5 фосфолипидов. Все фосфолипиды имели не более 1% примесей других липидов.

Недостатками этого способа являются:
неконтролируемое содержание избыточного свободного холестерина в смеси при УЗ-излучении;
необходимость очистки суспензии от частиц титана;
широкий разброс размеров частиц в суспензии;
трудность поддержания нужной температуры из-за большого выделения тепла при УЗ-диспергировании;
невозможность получения заранее заданного среднего диаметра частиц и стандартного отклонения распределения частиц из-за неконтролируемости кавитационных эффектов в процессе УЗ-диспергирования;
низкая производительность процесса;
невозможность масштабирования процесса УЗ-диспергирования;
Известен способ получения липосом, содержащих холестерин, описанный в работе [10]
В этом способе решается задача максимального включения холестерина в фосфолипидные бислои липосом, т.е. создание фосфолипидного носителя холестерина. Целью этой работы было более детальное изучение возможности максимального включения холестерина в липосомы для различных фосфолипидов при УЗ-облучении.

Способ получения липосом, содержащих холестерин, включает операции аналогичные вышеописанным в [9] (метод плавок). Ультразвуковое (УЗ) облучения производилось в течение различного времени при мощности излучении 50-60 Вт на приборе "Branson Sonifier" со стандартным титановым наконечником. Затем производилось центрифугирование при 2000 g в течение 10 мин при комнатной температуре для осаждения титановых частиц, попавших с УЗ-наконечника в липосомальную суспензию. Включение холестерина в фосфолипидный бислой контролировалось методом флюоресцентного анализа с пробой N-phenyl-1-naphthylamine (NPN).

Установлено, что оптимальная температура и время УЗ-облучения зависят от вида фосфолипида и должны быть определены отдельно для каждого фосфолипида.

Отличительной особенностью способа является то, что оптимальное время УЗ-облучения было определено по максимальной интенсивности флюоресцентного излучения NPN в образцах при постоянной температуре, равной температуре фазового перехода, индивидуально для каждого фосфолипида. Для анализа использовались только липосомальные суспензии (супернатант), которые имели оптическую плотность менее 0,02 при λ 385 нм и длине светового пути в 1 см. Избыток свободного холестерина определялся количественно в течение всего процесса приготовления.

Суспензия хранилась в атмосфере азота при комнатной температуре и использовалась для анализа в течение 5 ч.

Недостатками этого способа получения ФНХ являются:
необходимость очистки суспензии от частиц титана;
широкий разброс размеров частиц в суспензии;
трудность поддержания нужной температуры из-за большого выделения тепла при УЗ-диспергировании;
невозможность получения заранее заданного среднего диаметра частиц и стандартного отклонения распределения частиц из-за неконтролируемости кавитационных эффектов в процессе УЗ-диспергирования;
низкая производительность процесса;
невозможность масштабирования процесса УЗ-диспергирования;
Известен способ получения липосом с помощью гомогенизатора высокого давления, описанный в работе [11] в котором использовались гидрогенированный фосфатидилхолин из лецитина сои с молярным соотношением стеароил/пальмитоил 6: 1, димиристоилфосфатидилхолин, хинолин желтый и судан красный. Судан красный и хинолин желтый использовались для определения внутреннего объема капсулы. В качестве растворителя наряду с дистиллированной водой использовали PBS-буфер.

Способ заключается в следующем: фосфолипиды, холестерин и, при необходимости, судан красный растворяли по методу пленок в смеси хлороформ/метанол (метиловый спирт 2/1 объемные части) и высушивали под вакуумом при 60^oC до образования пленки. После добавления водной фазы и гидратирования в течение 1 ч при 60^oC при встряхивании происходило образование везикул. Полученную таким образом грубую дисперсию пропускают через гомогенизатор высокого давления при давлении от 0 до 200 МПа. Соотношение фосфолипидов и холестерина во всех экспериментах было эквимолярным (1:1).

В данной работе показана возможность получения липосом разного липидного состава, в зависимости от длительности диспергирования (количества прохождения через гомогенизатор высокого давления), от размера сопла (гомогенизирующего клапана), давления и температуры. Конкретного лекарственного вещества для включения в липосомы не использовали, а в качестве модели инкапсулируемого вещества брали красители, например, судан красный или хинолин желтый. Задача максимального включения холестерина в бислои не ставилась. Холестерин использовался только для формирования липосом с различными размерами из-за изменения микровязкости бислоев.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому способу является способ, описанный в [12] который взят нами за прототип.

В этом способе решается задача максимального включения в фосфолипидные бислои липосом холестерина. С целью повышения специфической активности и взаимодействия с ЛПНП в качестве липидной дисперсии используется смесь фосфолипида и холестерина в молярном соотношении 1:2 в органическом растворителе. Смесь упаривается в роторном испарителе с образованием пленки, которая затем гидратируется с добавлением вещества, придающего отрицательный заряд образующимся бислойным структурам, а именно, дицетилфосфата, или фосфатидилсерина, или фосфотидной кислоты, или жирной кислоты, содержащей C₁₂, или C₁₄, или C₁₆, или C₁₈. Затем эта смесь обрабатывается ультразвуком мощностью 280-300 Вт в течение 9-10 мин с перерывами для охлаждения смеси до 0-4^oC, центрифугируется и фильтруется через ядерный фильтр диаметром пор 0,2 мкм.

Например, к 1 мл хлороформного раствора (100 мг/мл) хроматографически чистого лецитина из соевых бобов (Nattermann, ФРГ) добавляется 1 мл хлороформного раствора холестерина (100 мг/мл) и 125 мкл раствора дицетилфосфата (25 мг/мл) в смеси хлороформ-метанол 2:1 по объему. Смесь высушивается на роторном испарителе в течение 40 мин. В колбу добавляется 20,4 мл забуференного физиологического раствора, рН 7,4.

Смесь инкубируется во встряхивающем термостате в течение 1 ч при 37^oC. Далее смесь обрабатывается ультразвуком на диспергаторе "Sonic-300" (Fisher, США) мощность 300 Вт в течение 10 мин с перерывами для охлаждения. УЗ-обработка связана с интенсивным выделением тепла, что может отрицательно сказаться на ФНХ. Поэтому УЗ-процесс проводится чередованием облучения в течение 1 мин и охлаждения в течение 5 мин (температура охлаждения -40^oC, температура в пробе не выше +4^oC). Проба центрифугируется на центрифуге К-24 (Ianetzki, ГДР) для осаждения многослойных липосом и частиц титана. Полученная липосомальная суспензия продавливается через ядерный фильтр с порами диаметром 0,2 мкм (Nuckieopore,США).

Полученные по способу-прототипу ФНХ анализировался на холестерин и фосфолипиды с помощью биохимического анализатора "Центрифихем-400" (Baker,США) с использованием набора реактивов "Монотест Холестерол" (Boekringer, Австрия).

Физико-химические свойства липосом, полученных по способу-прототипу, проверялись с помощью стандартного метода преципитации (ЛПНП) и флотации в сыворотке крови при центрифугировании.

ФНХ, полученный по способу-прототипу, имеет среднее молярное отношение холестерин/фосфолипид или, иначе говоря, холестерин/фосфолипидный индекс (I_хол/фл) равный 1,67. Частицы ФНХ практически полностью преципитируют вместе с ЛПНП, что подтверждает взаимодействие ФНХ с ЛПНП. Средний диаметр частиц анализировался на фотонном корреляционном анализаторе "Coulter n 4" и равен 120 нм.

Недостатками этого способа получения ФНХ являются:
низкая производительность;
загрязнение липосомальной суспензии титановыми частицами;
прерывистость процесса приготовления ФНХ;
чрезмерно большое выделение тепла при УЗ-диспергировании;
необходимость перерывов для охлаждения;
неконтролируемость параметров дисперсности (средний диаметр частиц, стандартное отклонение и т.п.);
Изобретение позволяет увеличить производительность процесса при сохранении стерильности гомогенизируемого продукта.

Это достигается тем, что предлагаемый способ получения липосомального ФНХ, осуществляется с помощью гомогенизации при высоком давлении на плунжерном гомогенизаторе при оптимальных технологических параметрах. Способ включает растворение фосфолипида и холестерина в органическом растворителе, их перемешивание, упаривание, высушивание с помощью роторного испарителя с последующей гидратацией, гомогенизацию при высоком давлении в непрерывном процессе, центрифугирование липосомальной суспензии и стерилизующую фильтрацию. Отличительной особенностью способа является то, что растворенные холестерин и фосфолипиды в молярном соотношении от 1:1 до 2:1, фильтруют под давлением в атмосфере инертного газа и после выпаривания и гидратации подвергают циклической гомогенизации в замкнутом контуре при давлении 10-120 МПа, температуре 15-45^oC, преимущественно около температуры фазового перехода соответствующего фосфолипида, и количество циклов гомогенизации от 1 до 20, центрифугированием в течение 40 мин при 20 000 g и температуре +5^oC. При этом молярное соотношение холестерин/фосфолипид в липосомальной суспензии равно от 0,9-1,1 до 1,5-1,85, средний диаметр частиц равен 40-200 нм, а стандатртное отклонение распределения частиц 20-100 нм.

При получении липосомального ФНХ использовались кроме фосфолипидов яичного желтка, лецитин обогащенная фракция соевых фосфатидов, а суммарная концентрация фосфолипидов и холестерина в липосомальной суспензии равна 1-10 вес/об.

Для измерения содержания холестерина использовали набор реактивов Монотест Холестерол (Boekringer, Австрия). Состав реактива: трис 100 мМ, pH 7,7; магний аспартат 50 мМ, 4-аминофеназон 1 мМ, натрий холат 10 мМ, фенол 6 мМ, 3,4-дихлорфенол 4 мМ, холестеринэстераза 0,4 ед./мл, холестериноксидаза 0,25 ед. /мл, пероксидаза 0,62 ед./мл. Анализ проводился путем смешивания 5 мкм пробы и 350 мкл реактива, инкубирование при 37^oC в течение 5 мин и фотометрирование при 510 нм. В качестве стандарта использовался стандартный раствор холестерина (200 мг/100 мл) (Boekringer, Австрия).

Для измерения содержания фосфолипидов использовался набор реактивов Комбинированный Тест (Boekringer, Австрия). Состав реактива: трис 50 мМ, pH 8,0, фенол 20 мМ, фосфолипаза Д 1,0 ед./мл, холиноксидаза 1,4 ед./мл, пероксидаза 0,8 ед./мл, 4-аминофеназон 8 мМ. Анализ проводили путем смешивания 10 мкл пробы с 350 мкл реактива, инкубировали при 37^oC в течение 10 мин и фотометрии при 510 нм. В качестве стандарта использовали прилагаемый к набору стандартный раствор холинхлорида (54,1 мг/100 мл).

Анализы холестерина и фосфолипидов в полученном ФНХ дают следующие результаты: холестерин 370 мг/100 мл, фосфолипиды 420 мг/100 мл. В результате получается целевой продукт в виде стерильного ФНХ с молярным отношением холестерин/фосфолипиды 1,76, учитывая, что средний молекулярный вес фосфолипидов в 2 раза больше холестерина. При повторении описанного способа получается целевой продукт с содержанием холестерина 330-370 мг/100 мл и фосфолипидов 400-440 мг/100 мл, что дает колебания отношения холестерин/фосфолипиды от 1,5 до 1,85.

Анализ среднего диаметра липосом производился с помощью лазерного фотонного корреляционного анализатора "Coulter N 4". Метод заключается в том, что измеряют коэффициент диффузии в разведенной водной суспензии липосом в проходящем лазерном луче и путем корреляции коэффициента диффузии, определяемого по броуновскому колебанию частиц, определяют средний диаметр частиц и стандартное отклонение распределения диаметров частиц.

Физико-химические свойства липосом, полученных по описанному способу, проверялись с помощью стандартного метода преципитации (ЛПНП) и флотации в сыворотке крови при центрифугировании.

При проверке активности препарата к 1 мл сыворотки крови добавляли 0,4 мл ФНХ, полученного по способу-прототипу, инкубировали при 37^oC в течение 1 ч. Преципитацию проб проводили путем добавления раствора фосфовольфрамовой кислоты (0,55 мМ) и хлористого магния (25 мМ) в соотношении проба/преципитант 1:2 по объему. Смесь отстаивается при комнатной температуре и затем центрифугируется 10 мин при 4000 g. ЛПНП преципитируют и удаляются вместе с осадком, в супернатанте и остаются только ЛПВП. Супернатант отделяется и анализируется вместе с пробой исходной сыворотки на холестерин и фосфолипиды. Проверка активности препарата показала, что он практически полностью взаимодействует с ЛПНП.

Ниже приведены конкретные примеры осуществления предлагаемого способа с различными составами липосомального ФНХ.

Пример 1. 50 мл лецитин-стандарта (10%-ный раствор лецитина в этиловом спирте) смешивают с 100 мл 10%-ного раствора холестерина в этиловом спирте и фильтруют под давлением 1,1 атм инертного газа, например, азота, затем помещают в 2,0 л колбу роторного испарителя и при 32 35^oC высушивают до образования тонкой пленки на стенках колбы испарителя. К образовавшейся пленке добавляют 100 мл хлороформа, содержащего 2,5 об. дицетилфосфата, и вновь проводят упаривание до образования абсолютно сухой пленки, продувают инертным газом, например, азотом, а затем проводят гидратацию и смыв пленки до образования однородной суспензии 1000 мл забуференного физиологического раствора рН 7,4, что дает суммарную концентрацию фосфолипида и холестерина 1,5 вес/об. и молярное соотношение холестерин и фосфолипида Х/Ф 2:1. После этого смесь подвергают гомогенизации в замкнутом контуре в непрерывном процессе с помощью плунжерного гомогенизатора под давлением 10 МПа и при 30^oC. Количество циклов гомогенизации равно 4, после чего проводится центрифугирование при 20 000 g в течение 40 мин при +5 ^oC.

Суспензия гомогенизации получается в виде полупрозрачной липосомальной суспензии с молярным соотношением Х/Ф 1,52. Липосомы согласно данному примеру получаются со средним диаметром 200 нм, а стандартное отклонение их распределения по диаметрам равно 100 нм.

Пример 2. Повторяют способ по примеру 1, но используют при этом, 1000 мл 10%-ного раствора в спирте фосфолипидов соевых бобов и 2000 мл 10%-ного раствора в спирте холестерина. Смесь фильтруют, и упаривают в пятилитровой колбе роторного испарителя по примеру 1. Затем пленку перерастворяют в 2000 мл хлороформа, содержащего 2,5 об. дицетилфосфата, снова упаривают до образования сухой пленки, проводят гидратацию физиологическим раствором рН 7,4 до общего объема суспензии 1000 мл, что дает суммарную концентрацию фосфолипида и холестерина 6 вес/об. и молярное соотношение холестерин и фосфолипида Х/Ф 2: 1. Давление в процессе гомогенизации составляет 80 МПа, температура 35^oC, количество циклов 8. Средний диаметр липосом для данного примера составляет 80 нм, а стандартное отклонение распределения 35 нм. Молярное соотношение Х/Ф 1,76.

Пример 3. Повторяют способ по примеру 1, но используют 250 мл 10%-ного лицитин-стандарта, 750 мл 10%-ного раствора холестерина в этиловом спирте. После гидратации физиологическим раствором рН 7,4 до общего объема смеси 1000 мл, что дает суммарную концентрацию фосфолипида и холестерина 10 вес/об. и молярное соотношение холестерин и фосфолипида Х/Ф 2:1. Давление в процессе гомогенизации составляет 120 МПа, температура 45^oC, количество циклов 20. Средний диаметр липосом для данного примера составляет 110 нм, а стандартное отклонение распределения 54 нм. Молярное соотношение Х/Ф 1,36.

Пример 4. Повторяют способ по примеру 1, но используют 250 мл 10%-ного раствора фосфолипидов соевых бобов, 250 мл 10%-ного раствора холестерина в этиловом спирте. После гидратации физиологическим раствором рН 7,4 до общего объема смеси 1000 мл, что дает суммарную концентрацию фосфолипида и холестерина 5 вес/об. и молярное соотношение холестерин и фосфолипида Х/Ф 1:1. Давление в процессе гомогенизации составляет 60 МПа, температура - 35^oC, количество циклов 10. Средний диаметр липосом для данного примера составляет 40 нм, а стандартное отклонение распределения 20 нм. Молярное соотношение Х/Ф 1,036.

Эффективность включения холестерина в бислои липосом согласно предлагаемого способа иллюстрируется следующими фигурами.

На фиг. 1 приведены кривые зависимости суммарного содержания фосфолипида и холестерина (Х+Ф, мг/мл) от давления гомогенизации P (МПа) при различных количествах циклов гомогенизации N. С увеличением давления и количества циклов гомогенизации суммарное содержание фосфолипида и холестерина в липосомах увеличивается. При этом, одно и то же суммарное количество фосфолипида и холестерина можно получить при низком давлении и большом количестве циклов гомогенизации или при высоком давлении и малом количестве циклов гомогенизации.

На фиг. 2 показана зависимость молярного соотношения Х/Ф от давления при различных циклах гомогенизации. Молярное соотношение Х/Ф в смеси до гомогенизации было 1:1. При гомогенизации под давлением P 0 МПа молярное соотношение Х/Ф 0.466 было получено после осаждения центрифугированием крупных аморфных липосомальных структур. С увеличением давления индекс Х/Ф сначала возрастает до давления P 40-60 Мпа, а затем уменьшается после давления P 60-80 МПа. Эта зависимость сохраняется для всех циклов гомогенизации.

На фиг. 3 показаны две кривые зависимости молярного соотношения Х/Ф от давления при различных циклах гомогенизации, различающиеся начальным молярным соотношением холестерина к фосфолипиду в исходной смеси до гомогенизации. У нижней кривой это соотношение было 1:1 при количестве циклов гомогенизации N 4, а у верхней 2:1 при количестве циклов гомогенизации N 10. Максимальное молярное соотношение Х/Ф 1,76.

На фиг. 4 показана зависимость среднего диаметра полученных липосом от давления гомогенизации при количестве циклов гомогенизации N 2 (кривая 1) и при N 20 (кривая 2). Средний диаметр липосом уменьшается с увеличением давления гомогенизации и мало зависит от количества циклов гомогенизации.

На фиг. 5 показана гистограмма распределения диаметров липосом в суспензии, т.е. количество частиц определенного диаметра. Распределение имеет средний диаметр липосом равный 123 нм и стандартное отклонение распределения равное 49. Оно получено при гомогенизации исходной смеси лецитина яичного желтка с холестерином при Х/Ф 2:1 под давлением 40 МПа и количестве циклов гомогенизации N 16.

Преимущество предлагаемого способа получения липосомального ФНХ заключается в том, что способ позволяет получить липосомы с большим молярным соотношением холестерина к фосфолипиду с высокой производительностью и большой концентрацией дисперсной фазы (суммарное содержание холестерина и фосфолипида).

Проведение циклической гомогенизации при оптимальном давлении и количестве циклов гомогенизации обеспечивает получение липосом заданного размера.

Температуру в процессе гомогенизации регулируют путем охлаждения гомогенизирующего устройства с внешнего контура хладагентом.

Предлагаемый способ обеспечивает надежное масштабирование процесса приготовления липосомального ФНХ.

Проведение циклической гомогенизации в непрерывном процессе позволяет сохранить стерильность исходных компонентов.

Список использованной литературы
1) W.Wohlob und I.Lasch. Dermatologica, 174, 18, 1987.

2) Egbaria K. Ramachandran C. Kiffayananed D. Weiner N. Topical delivery of liposomally encapsulated interferon evaluated by in vitro diffusion studies. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1990, v. 34, N 1, 107-110.

3) Иванова Л.Н. Халилов Э.М. Арчаков А.И. Лопухин Ю.М. Изменение свойств плазматических мембран нормальных и опухолевых клеток при встраивании холестерина. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1984, т. 97, N 4, с. 450-452.

4) Иванов А.С. Направленный транспорт оксистеринов-цитостатиков с помощью липопротеинов низкой плотности. Дисс. на соиск. уч. степ. д.б.н. в форме научного доклада. М. 1992.

5) Juliano R.L. Stamp D. 1975; + The effect of particle size and change on the clearance rates of liposomes and liposome encapsulated drugs. Biochem. Biophys. Res. Column.1975, v. 63, p. 651-658.

Ruipers F. et al. 1986 + Lipoproteine and liposomes as in vivo cholesterol vesicles in the rat: preferential use of cholesterol carried by small unilamellar liposomes for the formation of muricholic acids. Biochim. Biopys. Acta, 1986, v. 876, N 3, p.559-566.

7) Lundberg B. Properties of mixed vesicles of lecitin:cholesterol up to 1:2 molar ratio. Chem. Phys. Lipids, 1977, v. 18, pp. 212-220.

8) Shinitzky, 1978; An efficient method for modulation of cholesterol level in cell membranes. FEBS Lett. 1978, v. 85, p. 317-320.

Cooper R.A. et al. Factors influencing the lipid omposition and fluidity of red ctll membranes in vitro: production of red cells possessing more than two cholesterols per phospholipid. Biochemistry, 1978, v. 17, N 2, pp. 327-331.

10) Reiber H. Cholesterol-lipid interaction in membranes. The saturation concentration of cholesterol in bilayers of various lipids. Biochem. Biophys. Acta, 1978, v. 512, pp. 72-83.

11) Mentrup E. and Stricker H. Herstellung von Liposomtn mit einem Hochdruckhomogenisator. Pharm. Ind. 1990, v. 52, N 3, pp. 343-347.

12) Авторское свидетельство SU N 1690769, кл. A 61 K 37/22, 31/685. Иванов А.С. Захарова Т.С. Халилов Э.М. Торховская Т.И. Бачманова Г.И. Маркин С. С. Лопухин Ю.М. и Арчаков А.И. Способ получения фосфолипидного носителя холестерина, приоритет от 08.04.86, опубл. 15.11.91. Бюл. N 42.

Изобретение относится к медицине и биохимии и более конкретно к технологии получения липосомального фосфолипидного носителя холестерина (ФНХ). Изобретение может быть использовано в медицине и медицинской промышленности для получения высокодисперсных липосомальных препаратов с цитостатическим действием на опухоли. Кроме того, оно может быть использовано в экспериментальной биологии, медицине, в частности онкологии, иммунологии, как средство направленного транспорта холестерина в ткани организма. ФНХ, представляя собой липосомальную суспензию, может избирательно взаимодействовать с липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) плазмы крови человека и может быть предназначен для направленной доставки холестерина в периферические органы и ткани организма. Предлагаемый способ получения липосомального ФНХ, осуществляется с помощью гомогенизации при высоком давлении на плунжерном гомогенизаторе при оптимальных технологических параметрах. Способ включает растворение фосфолипида и холестерина в органическом растворителе, их перемешивание, упаривание, высушивание с помощью роторного испарителя с последующей гидратацией, гомогенизацию при высоком давлении в непрерывном процессе, центрифугирование липосомальной суспензии и стерилизующую фильтрацию. Отличительной особенностью способа является то, что растворенные холестерин и фосфолипиды в молярном соотношении от 1:1 до 2:1, фильтруют под давлением в атмосфере инертного газа и после выпаривания и гидратации подвергают циклической гомогенизации в замкнутом контуре при давлении 10-120 МПа, температура 15-45^oC, преимущественно около температуры фазового перехода соответствующего фосфолипида, и количество циклов гомогенизации от 1 до 20, центрифугированием в течение 40 мин при 1200 об./мин и температуре +5^oC. При этом молярное соотношение холестерин/фосфолипид в липосомальной суспензии равно от 0,9-1,1 до 1,5-1,85, средний диаметр частиц равен 40-200 нм, а стандартное отклонение распределения частиц 20-100 нм. При получении липосомального ФНХ использовались кроме фосфолипидов яичного желтка, лецитин обогащенная фракция соевых фосфатидов, а суммарная концентрация фосфолипидов и холестерина в липосомальной суспензии равна 1-10 вес/об.% . Способ позволяет повысить производительность процесса. 1 з.п.ф-лы, 5 ил.

1. Способ получения фосфолипидного носителя холестерина, включающий растворение фосфолипида и холестерина в органическом растворителе, их перемешивание, упаривание, высушивание с помощью роторного испарителя с последующей гидратацией, гомогенизацию при высоком давлении в непрерывном процессе, центрифугирование липосомальной суспензии и стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что растворенные холестерин и фосфолипиды в молярном соотношении 1 1 2 1 фильтруют под давлением в атмосфере инертного газа и после выпаривания и гидратации подвергают циклической гомогенизации в замкнутом контуре при давлении 10 120 МПа, температуре 15 - 45^oС, преимущественно около температуры фазового перехода соответствующего фосфолипида и количество циклов гомогенизации 1 20, центрифугированием в течение 40 мин при 20000 g и температуре +5^oС, при этом молярное соотношение холестерин/фосфолипид в липосомальной суспензии от 0,9 1,1 до 1,5 1,85, средний диаметр частиц 40 200 нм, а стандартное отклонение распределения частиц 20 100 нм. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарная концентрация фосфолипидов и холестерина в липосомальной суспензии равна 1 10 вес.об.