Способ получения фосфолипидного носителя холестерина Советский патент 1991 года по МПК A61K31/685 A61K47/44 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и касается способа получения фосфолипидного носителя холестерина.

Целью изобретения является повышение специфической активности.

Способ осуществляется следующим образом,

В качестве липидной дисперсии используют смесь высоконенасыщенного фосфо- липида и холестерина в молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую вещество, придающее отрицательный заряд, обрабатывают ультразвуком мощностью 280-300 Вт в течение 9/JO мин при 0-4°С и фильтруют через ядерный фильтр диаметром пор 0,2 мкм.

Пример1.К1мл хлороформного раствора (100 мг/мл)хроматографически чистого лецитина из соевых бобов (фирма Nattermann, ФРГ)добавляют 1 мл хлороформного раствора холестерина (100 мг/мл) и 125 мкл раствора дицетилфосфата

(25 мг/мл) в смеси хлороформ - метанол 2:1 по объему. Смесь высушивают на роторном испарителе в течение 40 мин. В колбу добавляют 20,4 мл забуференного физиологического раствора. рН 7,4.

Смесь инкубируют в встряхивающем термостате в течение 1 ч при 37°С, Далее смесь обрабатывают ультразвуком на дис- пергаторе Соник-300 (Fisher, США) мощностью 300 Вт в течение 10 мин при охлаждении (температура охлаждения - 40°С), температура в пробе не выше 4°С). Пробу центрифугируют на центрифуге К-24 (lanetzki, ГДР) для осаждения многослойных липосом и частиц титана. Полученную суспензию продавливают через ядерный фильтр (диаметр фильтра 47 мм) с порами 0,2 мкм (Nuckleopore, США). Полученный фосфолипидный носитель холестерина (ФНХ) анализировали на холестерин и фос- фолипиды на биохимическом анализаторе Центрифихем-400 (Baker, США) Для измерения холестерина использовали набор ре(Л

С

о ю о

VI

Ov

о

активов Монотест Холестерол (Boekringer, Австрия). Состав реактива: трис 100 мМ, рН 7,7; магний аспартат 50 мМ, 4-аминофена- зон 1 мМ, натрий холат 10 мМ, фенол 6 мМ, 3,4-дихлорфенол 4 мМ, холестеринэстераза 0,4 ед/мл, холестериноксидаза 0,25 ед/мл, пероксидаза 0,2 ед/мл. Анализ проводился путем смешивания 5 мкм пробы и 350 мкл реактива, инкубировали при 37°С в течение 5 мин и фотометрии при 510 нм. В качестве стандарта использовали стандартный раствор холестерина (200 мг/100 мл) (Boekringer, Австрия). Для измерения фос- фолипидов использовали набор реактивов Комбинированный Тест фосфолипиды (Boekringer, Австрия). Состав реактива: трис 50 мМ, рН 8,0, фенол 20 мМ, фосфолипаза Д 1,0 ед/мл, холиноксидаза 1,4 ед/мл, пероксидаза 0.8 ед/мл, 4-аминофеназон 8 мМ. Анализ проводили путем смешивания 10 мкл пробы с 350 мкл реактива, инкубировали при 37°С в течение 10 мин и фотометрии при 510 нм. В качестве стандарта использовали прилагаемый к набору стандартный раствор холинхлорида (54,1 мг/100 мл).

Анализы холестерина и фосфолипидов в полученном ФНХ дали следующие результаты: холестерин 361 мг/100 мл, фосфолипиды 424 мг/100 -мл. В результате получается целевой продукт в виде стери- ального ФНХ с молярным отношением хо- лестерин/фосфолипиды 1,7, учитывая, что средний молекулярный вес фосфолипидов в 2 раза больше холестерина. При повторении описанного способа получается целевой продукт с содержанием холестерина 340-370 мг/100 мл и фосфолипидов 407- 440 мг/100 мл. что дает колебания отношения холестерин/фосфолипиды от 1,5 до 1,8.

Физико-химические свойства липосом, полученных по описанному способу, проверялись с помощью стандартного метода преципитации (ЛПНП) и флотации в сыворотке крови при центрифугировании.

Проверка активности препарата.

К 1 мл сыворотки крови добавляли 0,4 мл ФНХ, полученного по предлагаемому способу или по известному способу, инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Преципитацию проб проводили путем добавления раствора фосфовольфрамовой кислоты (0,55 мМ) и хлористого магния (25 мМ) в соотношении проба:преципитант 1:2 по объему. Смесь стояла при комнатной температуре и затем центрифугировалась 10 мин при 4000д. При ЛПНП преципитируют и удаляются вместе с осадком, в супернатанте и остаются только ЛПВП. Супернатант отделяли и анализировали вместе с пробой исходной сыворотки на хо лестерин и

фосфолипиды, как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице.

Из данных, приведенных в таблице, видно, что ФНХ, полученный по предлагаемому способу, имеет более высокий холестерин (фосфолипидный индекс 1,67), чем ФНХ, полученный по известному способу (0,99) и практически полностью преципити- рует вместе с ЛПНП в отличие от прототипа,

что подтверждает взаимодействие ФНХ с ЛПНП.

Сыворотку крови смешивали с ФНХ и инкубировали как описано, в микропробирку наливали пробу и центрифугировали на

ультрацентрифуге с воздушным приводом (Аэрофуга, Bekman. Австрия) с ротором А- 100 в течение 2,5 ч при 300 ОООд. С помощью ручного фракционатора аэрофуги содержимое пробы фракционировали по вертикали

на 11 фракций и в каждой фракции определяли концентрацию холестерина, как описано в примере 1. Для каждой фракции получали свое значение концентрации холестерина. Аналогичные процедуры проводили и с контрольной пробой, где к сыворотке крови вместо ФНХ добавляли физиологический раствор. Для каждой фракции из значений холестерина, полученных в опытной пробе, вычитали значения холестерина,

полученные в контрольной пробе.

В результате проведенных исследований выявлено, что ФНХ, полученный таким образом, флотирует в области ЛПНП, в то время как ФНХ, полученный по известному

способу, гетерогенен по удельной плоскости и флотирует как в области ЛПНП, так и в области липопротеидов высокой плотности.

Пример 2. Способ осуществляется

аналогично примеру 1, за исключением то го, что вместо дицетилфосфата используется фосфатидилсерин в тех же соотношениях. В результате был получен целевой продукт с концентрацией 8,2 мг липида/мл. Полученный продукт не уступал продукту, полученному по примеру 1.

Пример 3. Способ осуществляется аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо дицетилфосфата используют

фосфатидную кислоту в тех же соотношениях. В результате был получен целевой продукт в концентрации 8,5 мг липида/мл, не уступающий по своим свойствам продукту, полученному по примеру 1.

Примеры 4.5,6,7.

Способы осуществляются аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо дицетилфосфата используют жирную кислоту Ci2, или Си, или Cie, или Cie в тех же

соотношениях, в результате были получены

продукты с концентрацией соответственно 8,0,8,0,8,3 и 8,5 мг липида/мл, не уступающие по своим свойствам продукту, полученному по примеру 1,

Предлагаемый фосфолипидный носитель холестерина позволяет повысить холе- стерин/фосфолипидный индекс с 0,99 до 1,67, а также практически полностью взаимодействует с липопротеидом низкой плотности в отличие от известного, который такой специфичностью не обладает. Формула изобретения Способ получения фосфолипидного носителя холестерина, включающий обработ0

ку липидной дисперсии ультразвуком при охлаждении и центрифугировании, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности и взаимодействия с липопротеидом жидкой плотности в качестве липидной дисперсии используют смесь лецитина из соевых бобов и холестерина при молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую дицетилфосфат или фосфатидилсерин, или фосфотидную кислоту, или жирную кислоту, содержащую Ci2, или Ci4, или Cie, или Cis, и затем фильтруют через ядерный фильтр диаметром 0,2 мкм.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и касается способа получения фосфолипидного носителя холестерина. Целью изобретения является повышение специфической активности. Способ осуществляется путем обработки липидной дисперсии, представляющей смесь лецитина из соевых бобов и холестерина при молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую дицетилфосфат или фосфати- дилсерин, или фосфатидную кислоту, или жирную кислоту, содержащую Cia, или С14, или Cie, или Cis, ультразвуком при охлаждении, центрифугирования и последующей фильтрации через ядерный фильтр диаметром 0,2 мм. 1 табл