СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА ЛИДАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/56 

Изобретение относится к получению биологически активных веществ, используемых в медицине.

Известен способ производства натриевой соли ДНК из животного сырья /Патент РФ N 2005724, кл. C 07 H 21/04/. Способ включает измельчение и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе, обработку гомогената детергентов и концентрированным раствором хлористого натрия, обработку реакционной массы ультразвуком с частотой 8 35 кГц и интенсивностью 0,2 2,0 Вт/см², смешивание ее с кизельгуром, при соотношении сорбент: реакционная масса 1:5 - 25, фильтрование с последующим концентрированием барофильгарацией, осаждение продукта этиловым спиртом и сушку осадка соли ДНК при 20 60^oC.

Известен способ выделения ДНК /Патент РФ N 2026864, кл. C 07 H 21/04/, включающий обработку крови раствором хлорида триметилоктадециламмония в концентрации 0,5 1% в трис HCl буфере, солюбилизацию в 1 1,5 М растворе NaCl, и осаждение ДНК этанолом.

Известен способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения /Патент РФ N 2017496, кл. A 61 K 35/60/. Способ включает измельчение и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе /ССЦ/, трехкратную промывку ядерного материала ССЦ. Затем отмытый ядерный материал помещают в реактор с ССЦ и 6% раствором додецилсульфата натрия в 45% этиловом спирте, нагревают до 60^oC, добавляют равный объем раствора 5 М хлористого натрия, перемешивают, охлаждают до 12 16^oC; обрабатывают реакционную массу ультразвуком, отделяют раствор ДНК от осадка балластных веществ фильтрацией реакционной массы через кизельгур на нутч-фильтре; концентрируют фильтрат на мембране с размером пор 0,45 мкм /потери ДНК при этом до 3%/, отмывают концентрат диальфильтрацией на той же мембране до отрицательной реакции на белок в пермеате.

Полученная натриевая соль ДНК имеет следующие характеристики:
содержание белка не более 1,5%
молекулярная масса 450 к Дальтон,
молекулярный эффект 44%
содержание РНК не более 2%
содержание полисахаридов не более 2%
Известен способ получения ДНК и ее солей из рыбных молок /Патент ФРГ N 1142365, кл. A 61 K 36/56/, включающий измельчение молок, обработку их раствором гидроксида натрия, обработку 80% спиртом с получением натриевой соли ДНК, обработку ее спиртом, сушку, обработку осадка раствором сульфата кальция при температуре 80^oC, фильтрацию, выделение из фильтра ДНК обработкой 75
80% спиртом, содержащим 1,8 ч. соляной кислоты, и промывку осадка спиртом, затем ацетоном с последующей сушкой на воздухе готового продукта.

Известен способ получения дезоксирибомононуклеотидов из отходов производства протаминсульфата из молок рыб /Авт. свид. N 534236 кл. A 61 K 37/10/. Способ включает растирание отходов до порошкообразного состояния, перемешивание в 7% трехуксусной кислоте, встряхивание жидкости, центрифугирование, сбор надосадочной жидкости, содержащей кислоторастворимые продукты олигонуклеотиды, мононуклеотиды, азотистые основания.

Кислотный экстракт нейтрализуют 4 N аммиаком до pH 7,0, добавляют MgSO₄7H₂O и препарат нуклеаз. Реакционную смесь подвергают инкубации в течении 24 ч. После окончания ферментативного гидролиза олигонуклеотидов и добавления 96^o гидролизного спирта, полученный раствор фильтруют, упаривают, разводят дистиллированной водой и фильтруют через активированный уголь
Разделение смеси дезоксирибонуклеотидов осуществляют, используя смолу "Дауэкс-1" в хлоридной форме, достигая первоначального разделения продуктов гидролиза ДНК.

Идентификацию фракции нуклеотидов, собранных с колонки осуществляют при помощи спектрофотометрии.

Полученные растворы дезоксирибомононуклеотидов каждый в отдельности концентрируют путем реадсорбции на ионообменных колонках, промывают водой и элюируют разбавленными растворами соляной кислоты.

В качестве прототипа выбран способ получения протаминов /1144700, кл. A 61 K 35/08/, включающий очищение молок от жира и соединительной ткани, их измельчение /гомогенизацию/ с одновременной обработкой гимогената раствором Рингера (который в своем составе содержит хлориды калия, кальция, натрия, однозамещенный фосфорнокислый калий, кислый углекислый натрий и фосфат магния), фильтрацию через хлопковую ткань. Осадок промывают раствором Рингера и центрифугируют, после чего повторно обрабатывают в 0,1 М -трис HCl, pH 8, содержанием 1,4 М NaCl. На полученный гомогенизат действуют ультразвуком и выделяют целевой продукт на катионообменнике.

Задача, решаемая изобретением переработка отходов от производства лидазы. когда в качестве сырья использовались семенники крупного рогатого скота или текучие молоки.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: отходы, полученные после экстракции лидазы, обрабатывают щелочным 7 10% раствором хлорида натрия с pH 8,0 8,5 в соотношении отходы: раствор 1 6 1 10. Экстракт отделяют и подают на ультрафильтрацию с концентрированием до содержания сухих веществ 1,3 3,0% после чего концентрированный раствор сушат при температуре 85 210^oC, сухой продукт обрабатывают 96% этанолом при 40 50^oC при соотношении продукт:этанол 1 (3-6), сушат на воздухе с получением готового продукта. Содержание ДНК около 70%
Пример 1. 125 г отходов после производства лидазы из семенников крупного рогатого скота (КРС) обрабатывают 7% щелочным раствором NaCl c pH 8,0 при соотношении 1 6 (отходы: щелочной раствор) в течение 2,5 ч. Полученный экстракт направляют на ультрафильтрационный волоконный аппарат с плоскими мембранами 100 тыс. дальтон. Сконцентрированный экстракт до содержания 1,8% сухих веществ сушат в аппарате распылительной сушки марки МАРС-1, после чего сухой продукт обрабатывают этанолом при температуре 40^oC в соотношении продукт: этанол (1:3) и сушат на воздухе.

Вес полученного препарата 7 г, что составляет 6% выхода ДНК, при содержании ДНК равном 69%
Пример 2. 500 г отходов производства лидазы из семенников КРС обрабатывают 10% щелочным раствором NaCl с pH 8,5 при соотношении 1:10 (отходы: щелочной раствор) в течение 3,5 ч. Полученный экстракт направляют на ультрафильтрационный волокнистый аппарат с плоскими мембранами 100 тыс. дальтон. Сконцентрированный экстракт до содержания 3% сухих веществ сушат в аппарате растительной сушки марки МАРС-1, после чего сухой продукт обрабатывают этанолом при температуре 50^oC в соотношении продукт:этанол (1:6) и сушат на воздухе.

Выход нуклеопротеина 28 г, что составляет 5%
Содержание ДНК в продукте составляет 69%
Пример 3. Получение нуклеопротеинового комплекса из 1000 г отходов производства лидазы проводят в условиях примера 1, но сушку концентрированного экстракта ДНК проводят сублимационным способом. Для этого экстракт наливают в кюветы слоем не более 10 мм, замораживают при -30^oC и сублимируют в течении 36 часов. Вес полученного препарата 56 г, что составляет 5,6% выхода ДНК, при содержании ДНК 70%
Пример 4. Получение нуклеопротеинового комплекса из 2 г отходов производства лидазы проводят в условиях примера 2, но сушку концентрированного экстракта ДНК проводят в вакууме при 10^-1 мм рт.ст при температуре 80^oC. Вес полученного препарата 70 г, что составляет 4,0% выхода ДНК, при содержании ДНК 72%
Пример 5. Получение нуклеопротеинового комплекса из 1000 г отходов производства лидазы проводят в условиях примера 1, но сушку концентрированного экстракта ДНК проводят в вакууме при 10^-2мм рт.ст при температуре 60^oC. Вес полученного препарата 54 г, что составляет 5,4 выхода ДНК, при содержании ДНК 69%

Сущность изобретения: отходы после производства лидазы обрабатывают 7-10% раствором хлорида натрия с pH 8,0 - 8,5 в течение 2,5 - 3,5 ч., отделяют экстракт ДНК от плотной части ультрафильтрацией с концентрированием экстракта до содержания сухих веществ 1,8 - 3,0%, сушат препарат, обрабатывают его эталоном при 40 - 50^oC, сушат на воздухе. Выход нуклеопротеина составляет 5 - 6%. Содержание ДНК - около 70%. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ получения нуклеопротеидного комплекса из отходов производства лидазы, включающий измельчение, обработку раствором солей, отделение экстракта, выделение из него конечного продукта и его сушку, отличающийся тем, что измельченные отходы обрабатывают щелочным 7 10%-ным раствором хлорида натрия при соотношении отходы щелочной раствор 1 6 10, pH 8,0 8,5, полученный экстракт направляют на ультрафильтрацию с концентрированием до содержания 1,8 3,0% сухих веществ, концентрат сушат, после чего сухой продукт обрабатывают этанолом при 40 50^oС в соотношении продукт этанол 1 3 6 и сушат на воздухе. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушку концентрированного экстракта ДНК проводят распылительным способом при температуре распыляемого воздуха на входе сушилки (225 ± 25)^oС, а на выходе сушильного агрегата (90 ± 5)^oС. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушку концентрированного раствора ДНК проводят сублимационным способом при -30 +20^oС. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушку концентрированного раствора ДНК проводят в вакууме при 10^- 1 10^-2 мм рт.ст. при 60 - 80^oС.