Способ получения биологически активной добавки из гонад гидробионтов Российский патент 2024 года по МПК A23L33/10 A23L33/17 A23J3/04 

Изобретение относится к пищевой и биотехнологической промышленности, касается способа получения препарата на основе ДНК, а именно биологически активной добавки (БАД) минерально-нуклеопротеинового состава, обладающей кардиотропным, иммуномодулирующим действием, которая может быть использована в пищевой промышленности для получения БАД для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и обладающей общеукрепляющим и иммуномодулирующим свойствами.

Начиная с 90-х годов прошлого столетия, ДНК начали использовать в качестве биологически активного продукта в медицине и косметической промышленности. Нуклеиновые кислоты (в частности, ДНК, ее соль - нуклеинат натрия) широко используются в медицине в качестве иммуномодуляторов, в кардиологии для лечения ишемической болезни сердца, при лечении онкологических заболеваний, лимфогранулематоза, для повышения физической и умственной работоспособности.

В связи со способностью ДНК создавать комплексы с ионами металлов жизненно важных элементов, появилась возможность создания новых биологически активных добавок лечебно-профилактического действия.

В настоящее время существует ряд способов получения биологически активных добавок лечебно-профилактического действия. Чаще всего БАДы получают на основе растительного сырья. Но, несмотря на разнообразие способов их получения из различных источников, вопрос подбора и подготовки сырья не остается без внимания производителей.

Известен способ получения БАД к пище, который заключается в экстракции плоских морских ежей в течение 22-24 час 96% этиловым спиртом при соотношении сырье: этиловый спирт 1:(1-1,2) с добавлением водного раствора аскорбиновой кислоты. При этом соотношение раствора аскорбиновой кислоты к этиловому спирту составляет 1:(25-35). Далее экстракт фильтруют и упаривают в вакууме до 30-33% первоначального объема. Затем полученный концентрат спиртового экстракта разводят 1,5-2,5% раствором фруктозы в питьевой воде до первоначального объема. Затем раствор помещают на 6-8 суток в холодильную камеру при температуре 4°С.Осадок отделяют, а раствор подвергают очистке методом микрофильтрации через полые волокна. Изобретение позволяет получить БАД к пище, предназначенной для профилактики, вспомогательной терапии в целях снижения риска развития обменных нарушений, сердечно-сосудистых и других заболеваний, связанных с понижением антиоксидантного статуса организма (патент РФ 2340216 A23L 1/30, A23L 1/325, публ. 10.12.2008 г).

Недостаток этого изобретения заключается в применении органических растворителей - агрессивных веществ. Наличие спирта в конечной форме ограничивает возможность применения для определенной группы людей. Кроме того, получение такой БАД длительный и затратный процесс.

Известен способ получения БАД из молок осетровых рыб, который гомогенизируют в стандартном цитратно-солевом растворе. Гомогенат помещают в аппарат, добавляют стандартный цитратно-солевой раствор додецилсульфата натрия. Не прекращая перемешивания, нагревают до 60°С и инкубируют при этой температуре в течение 1-1,5 часов. По окончании выдержки при работающей мешалке добавляют в реактор раствор хлорида натрия и перемешивают еще 1 час при 60°С. По истечении этого времени реакционную массу охлаждают и передают на установку для ультразвуковой обработки. Ультразвуковую обработку проводят в открытых ваннах. Для чего в ванну помещают порцию реакционной массы, добавляют водный раствор гидроперекиси изопропилбензола, водный раствор диоксималеиновой кислоты и раствор соли Мора, также на стадии ультразвуковой обработки вводят специальные добавки, которые представляют собой одно-, двух- или трехкомпонентные системы.

Озвучивание проводят в течение 10 минут при температуре 18°С при частоте тока 750 НГц и интенсивности 8-10 вт/см². По окончании озвучивания раствор переносят в смеситель, в котором объединяют все обработанные ультразвуком порции, смешивают их с кизельгуром, и после 15-минутной выдержки подают на фильтрацию. Отфильтрованный раствор целевого продукта дополнительно очищают и концентрируют методом ультрафильтрации на разделительных колоннах. Из очищенного раствора 70%-ным этанолом осаждают целевой продукт, промывают многократно этанолом с переменной (уменьшающейся) концентрацией воды, отделяют от жидкой фазы и сушат. Получают препарат N 1 с содержанием РНК 3,25% белка 0,9% железа менее 0,001% соотношением N/P 1,3, ММ 460 кД (заявка РФ 94041110 А23К 31/70, публ. 20.09.1996 г).

Недостаток указанного способа заключается в том, что ДНК в полученном препарате содержится в высокополимерной форме, соответственно препарат имеет низкую растворимость и плохо усваивается организмом. Кроме того, применение органических растворителей также ограничивает применение препарата. А многостадийность процесса снижает эффект способа.

Известна биологически активная добавка к пище, которая содержит Тинростим, нуклеопротеиновый комплекс, выделенный из молок лососевых рыб, содержащий низкомолекулярную ДНК с молекулярной массой от 100 до 300 кДа в количестве 75-80%, в определенном соотношении компонентов. В биологически активную добавку могут быть включены целевые добавки: аскорбиновая кислота, микрокристаллическая целлюлоза и/или крахмал, а также компоненты для таблетирования или капсулирования. Способ получения осуществляется путем смешивания ингредиентов в определенном соотношении в смесителе до равномерного распределения и последующего таблетирования или капсулирования или фасуют в порошки по 500 мг. Компоненты смешивают в следующем соотношении, мас.%: Тинростим - 0,1 Нуклеопротеиновый комплекс, выделенный из молок лососевых рыб - 99,9.

Изобретение позволяет расширить ассортимент БАД, обладающих общеукрепляющим, иммуностимулирующим, антистрессовым действием и способностью активизировать умственную и физическую работоспособность (патент РФ №2222997 A23L1 /30, A23L 1/305, A23L 1/333, опубл. 10.02.2004 г).

Недостатком является содержание в пищевой добавке нуклеопротеинового комплекса с молекулярной массой от 100 до 300 кДа, который обладает слабой растворимостью в водных растворах, а значит и низкой усваиваемостью. Кроме того, простое смешивание ингредиентов не всегда оправдывает использование такой БАД. Существует альтернатива использования отдельных компонентов в зависимости от необходимости применения.

Наиболее близким техническим решением заявленному является способ получения лечебно-профилактического продукта из гидробионтов, обогащенного свободными аминокислотами. Способ осуществляют следующим образом: сырье измельчают и заливают 5-20%-ным водно-спиртовым раствором из расчета 1:1-1:5, подщелачивают раствором NaOH до установления рН 8,0-8,5. Ферментативный гидролиз осуществляют с помощью протеолитических ферментных препаратов при температуре 35-40°С в течение 1,5-6 час, инактивацию ферментов осуществляют нагреванием до 70-80°С в течение 15-20 мин, последующее выделение целевого продукта проводят путем фильтрации, сушку проводят сублимационным или распылительным способом. Для ферментативного гидролиза используют протеолитический ферментный препарат, выделенный из пилорических придатков дальневосточных лососей (пилорин) с активностью 100-200 Е/г в количестве 0,1-1,0% от массы измельченного сырья, или протеолитический ферментный препарат, выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба с активностью 150-250 Е/г в количестве 0,1-1,0% от массы измельченного сырья, или используют мегатерии с активностью 200-500 Е/г в количестве 0,1-1,0% от массы измельченного сырья или панкреатин с активностью 150-300 Е/г в количестве 0,1-1,0% от массы измельченного сырья (патент РФ №2171066 A23L 1/325, A23L 1/33, A23L 1/333, опубл. 27.07.2001 г).

Недостаток - полученный продукт обладает недостаточно широким фармакологическим спектром воздействия на организм.

Задача изобретения - разработка способа получения биологически активной добавки минералъно-нуклеопротеинового состава, обладающей кардиотропным, иммуномодулирующим действием.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение биологически активной добавки к пище на основе ДНК из гидробионтов, обладающей кардиотропным, иммуномодулирующим, действием.

Это достигается тем, что способ получения биологически активной добавки из гидробионтов включает измельчение молок лососевых рыб или гонад приморского гребешка, добавление воды, подщелачивание раствором щелочи, добавление соли хлорида магния в количестве 130-170 г на 1000 г сырья, обработку полученного раствора ультразвуком мощностью 150-200 Вт/см³ в течение 5-15 мин, ферментативный гидролиз, инактивацию фермента, фильтрацию, отделение осадка, сушку фильтрата с получением порошка и смешивание полученного порошка с БАД Тинростим в соотношении 1000:2.

Существенными признаками предложения следует считать выбор минеральной добавки, ее концентрации и режимов введения в реакционную смесь, позволяющий получить препарат ДНК с заданными свойствами.

Существенными отличительными признаками заявленного способа является внесение на начальной стадии (измельчение и приготовление экстракта) хлорида магния и обработка экстракта ультразвуком, при котором происходит взаимодействие ионов магния с нуклеопротеиновым комплексом, что в конечном препарате представляет собой органическую форму магния, которая хорошо усваивается организмом.

Добавление в конечный продукт тинростима придает получаемому препарату иммуномодулирующие свойства.

Заявленный продукт получают следующим способом: сырье (например, молоки лососевых рыб или гонады приморского гребешка) измельчают и заливают водой из расчета 1:2-1:5, подщелачивают раствором NaOH и добавляют соль хлорид магния в соотношении 164-180 г на 1000 г сырья. Раствор обрабатывают ультразвуком мощностью 150-200 Вт/см3 в течение 5-15 мин., после чего проводят ферментативный гидролиз. Гидролиз осуществляют при температуре в течение 3-5 час с использованием протеолитических ферментных препаратов, выделенных из пилорических придатков дальневосточных лососей (пилорин) или из гепатопанкреаса камчатского краба. Инактивацию ферментов осуществляют нагреванием до 80°С в течение 15-20 мин. Выделение целевого продукта проводят путем фильтрации, сушку фильтрата проводят сублимационным или распылительным способом. Полученный сухой порошок смешивают с тинростимом.

Внесение хлорида магния в гидролизат позволяет получить БАД кардиотропного действия. Так как роль магния в профилактике и лечении заболеваний, таких как гипертония, сердечно-сосудистые заболевания, диабет очень важная. Магний является жизненно-важным элементом, который находится во всех тканях организма и необходим для нормального функционирования клеток и его введение в реакционную смесь способствует созданию БАД направленного действия.

Для достижения заявленного технического результата количество добавляемой соли хлорида магния в гидролизаты рассчитывается, исходя из суточного потребления магния, и подбирается опытным путем. В соответствии с приложением 11 TP ТС 021/2011 (Технический регламент Таможенного союза), адекватный уровень потребления магния для человека составляет 400 мг в сутки. Для БАД содержание активного вещества, декларируемого техническим регламентом, должно составлять не менее 15% от адекватного уровня потребления. Исходя из этого, подбор количества вносимой соли магния проводили из расчета содержания в конечном препарате не менее 60 мг на 1 г готового продукта.

Эксперименты проводили с гидролизатами из молок кеты и гидролизатами из гонад гребешка. В полученных образцах определяли содержание магния. По результатам определений рациональное количество вносимой соли составляет от 130 до 170 г на 1000 г для молок кеты/гонад гребешка.

Результаты экспериментов отражены в таблице 1.

Согласно данным таблицы 1 содержание активного вещества (магния) для адекватного уровня потребления (74-128) в препарате достигается при внесении в гидролизаты соли хлорида магния в количестве от 130 до 170 г/на 1000 г сырья. Внесение соли хлорида магния в количестве более 170 г/на 1000 г сырья нецелесообразно, т.к. очевидно наступает насыщение гидролизата магнием и связывание его с нуклеопротеиновым комплексом далее не происходит (остается в осадке).

При этом полученные гидролизаты характеризуются следующим составом (таблица 2).

На основании данных таблицы 2 очевидно, что экспериментальный расчет подтвердил в полученной биологически активной добавке жизненно необходимое содержание магния.

Для образования органической формы магния в препарате, что является лучшей формой усвоения живым организмом, используют обработку экстракта ультразвуком. Известно, что ультразвуковые волны способны усиливать межфазные процессы в 10-1000 раз, тем самым увеличивать выход необходимых продуктов. Обработка биогенной реакционной массы, содержащей ДНК, позволяет в мягких условиях разорвать гликозидные связи в нуклеотидах и получить композиционно однородные нативные полимеры со стабильными свойствами.

При обработке ультразвуком нуклеопротеидных комплексов наряду с фрагментацией уменьшается прочность связей между нуклеиновыми кислотами и белками в нуклеопротеидных комплексах. Освободившиеся при этом связи могут быть задействованы для образования комплексов с ионами магния, вносимыми в среду. Тем самым, применение ультразвука способствует образованию органической формы магния, что является лучшей формой усвоения живым организмом.

Для проверки образования комплексов под действием ультразвука опытным путем были получены препараты с обработкой ультразвуком и без обработки. Сухие продукты растворяли в воде в соотношении 1 г на 100 мл, проводили диализ в течение 24 ч при температуре 15°С. В процессе диализа через полупроницаемую мембрану из раствора удаляют ионы магния, не связавшиеся с ДНК. После проведения диализа образцы сушат на сублимационной сушке и определяют содержание магния в препаратах.

Результаты экспериментов отражены в таблице 3.

На основании данных таблицы, очевидно, что обработка ультразвуком перед проведением ферментативного гидролиза способствует образованию комплексов ионов магния с нуклеопротеидным комплексом и позволяет получить продукт с заданными свойствами, тем самым способствует достижению технического результата. Обработка ультразвуком мощностью 150-200 Вт/см³ очевидно достаточна для образования заданного комплекса.

Для придания функциональной и профилактической направленности предлагается использовать БАД к пище Тинростим, которая в составе пищевых продуктов позволяет обогатить конечный продукт биологически активными веществами, содержащимися в добавке.

Добавление в конечный продукт тинростима позволяет получить ценный препарат не только кардиопротекторного действия, но также придает полученному препарату иммуномодулирующие свойства.

Тинростим - комплекс низкомолекулярных пептидов, выделенный из нервной ткани кальмаров, с молекулярной массой от 1 до 15 кДа. При совместном применении Тинростима и нуклеопротеинового комплекса из молок лососевых рыб повышается биологическая эффективность воздействия получаемого препарата. В составе Тинростима присутствует 13 свободных аминокислот, роль которых огромна, так как они участвуют в синтезе различных белков организма. Исходя из суточной нормы потребления, которая составляет 0,2 г/сутки, что обусловлено влиянием БАД на физико-химические и структурно-механические свойства белков живого организма была установлена дозировка внесения Тинростима.

В конечный продукт Тинростим добавляют в соотношении 1000:2.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

1000 г молок лососевых измельчают на электрической мясорубке с диаметром отверстия 2-4 мм. Добавляют 3 л воды и 130 г соли хлорида магния. Экстракт подщелачивают раствором NaOH до установления рН 8,0. Далее смесь обрабатывают ультразвуком мощностью 150 Вт/см³ в течение 15 мин. Затем проводят ферментативный гидролиз для чего в смесь вносят препарат, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба, в количестве 3,5 г с протеолитической активностью 350 Е/г. Время гидролиза 3,5 ч при периодическом перемешивании. Далее инактивируют фермент, для чего раствор нагревают до 70°С и выдерживают в течение 20 мин. После чего раствор фильтруют через миткалевый фильтр, осадок отделяют, фильтрат высушивают сублимационным способом. Полученный порошок смешивают с тинростимом в соотношении 1000:2.

Продукт содержит 24% ДНК, 74 мг/г магния, 0,2% тинростима.

Пример 2.

1000 г молок лососевых измельчают на электрической мясорубке с диаметром отверстия 2-4 мм. Добавляют 5 л воды и 170 г соли хлорида магния. Экстракт подщелачивают раствором NaOH до установления рН 8,2. Далее смесь обрабатывают ультразвуком мощностью 170 Вт/см³ в течение 10 мин. После чего проводят ферментативный гидролиз с помощью препарата, полученного из пилорических придатков лососевых рыб (пилорина), в количестве 5 г с протеолитической активностью 220 Е/г. Время гидролиза 4 ч при периодическом перемешивании. Для инактивации фермента раствор нагревают до 80°С и выдерживают в течение 15 мин. Раствор фильтруют, осадок отделяют, фильтрат высушивают сублимационным способом. Полученный порошок смешивают с тинростимом в соотношении 1000:2.

Продукт содержит 23% ДНК, 128 мг/г магния, 0,2% тинростима.

Пример 3

1000 г гонад гребешка измельчают в куттере, в смесь добавляют 2 л воды и 130 г соли хлорида магния. Экстракт подщелачивают раствором NaOH до установления рН 8,3. Далее смесь обрабатывают ультразвуком мощностью 200 Вт/см³ в течение 5 мин. Ферментативный гидролиз проводят с помощью препарата, полученного из гепатопанкреаса камчатского краба, в количестве 3,5 г с протеолитической активностью 350 Е/г. Время гидролиза 3,5 ч при периодическом перемешивании. Для инактивации фермента раствор нагревают до 70°С и выдерживают в течение 20 мин. Раствор фильтруют через миткалевый фильтр, осадок отделяют, фильтрат высушивают сублимационным способом. Полученный порошок смешивают с тинростимом в соотношении 1000:2.

Продукт содержит 12,5% ДНК, 60 мг/г магния, 0,2% тинростима.

Пример 4

1000 г гонад гребешка измельчают на электрической мясорубке с диаметром отверстия 2-4 мм. Добавляют 3 л воды и 170 г соли хлорида магния. Экстракт подщелачивают раствором NaOH до установления рН 8,1. Далее смесь обрабатывают ультразвуком мощностью 180 Вт/см³ в течение 8 мин. Ферментативный гидролиз проводят с помощью препарата, полученного из пилорических придатков лососевых рыб (пилорина), в количестве 5 г с протеолитической активностью 220 Е/г. Время гидролиза 3,5 ч при периодическом перемешивании. Для инактивации фермента раствор нагревают до 80°С и выдерживают в течение 15 мин. Раствор фильтруют через миткалевый фильтр, осадок отделяют, фильтрат высушивают сублимационным способом. Полученный порошок смешивают с тинростимом в соотношении 1000:2.

Продукт содержит 12% ДНК, 115 мг/г магния, 0,2% тинростима.

Изобретение относится к пищевой промышленности и биотехнологии, касается способа получения биологически активной добавки к пище. Способ получения биологически активной добавки из гидробионтов включает измельчение молок лососевых рыб или гонад приморского гребешка, добавление воды, подщелачивание раствором щелочи, добавление соли хлорида магния в количестве 130-170 г на 1000 г сырья. Далее осуществляют обработку полученного раствора ультразвуком мощностью 150-200 Вт/см³ в течение 5-15 мин. Затем проводят ферментативный гидролиз, инактивацию фермента, фильтрацию, отделение осадка, сушку фильтрата с получением порошка. Далее осуществляют смешивание полученного порошка с БАД Тинростим в соотношении 1000:2. Изобретение позволяет получить биологически активную добавку к пище, являющуюся дополнительным источником нуклеиновых кислот и магния, и обладающую иммуномодулирующим и кардиопротекторным действием. 3 табл., 4 пр.

Способ получения биологически активной добавки из гидробионтов, характеризующийся тем, что включает измельчение молок лососевых рыб или гонад приморского гребешка, добавление воды, подщелачивание раствором щелочи, добавление соли хлорида магния в количестве 130-170 г на 1000 г сырья, обработку полученного раствора ультразвуком мощностью 150-200 Вт/см³ в течение 5-15 мин, ферментативный гидролиз, инактивацию фермента, фильтрацию, отделение осадка, сушку фильтрата с получением порошка и смешивание полученного порошка с БАД Тинростим в соотношении 1000:2.