СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/38 

Изобретение относится к прикладной биотехнологии, а именно к способам получения биопрепаратов с использованием добавок, стимулирующих продуцирующую способность микроорганизмов.

Известно получение биопрепаратов таких, как антибиотики, аминокислоты, витамины, органические кислоты и т.п. с использованием таких добавок, как сульфит калия, тиогликолевая кислота и т.д. [1]
Недостатком их является недостаточная эффективность, необходимость последующего отделения стимуляторов от конечного продукта.

Известен способ получения биопрепаратов с использованием в качестве стимулятора веществ, являющихся естественными компонентами микробиологических процессов, например, гидролизатов или экстрактов культуральной жидкости [2, 3]
Недостатком способа является недостаточная эффективность, видостпецифичность добавки.

Прототипом данного изобретения является способ культивирования микроорганизмов-продуцентов нейтральной протеазы, в котором в качестве стимулятора в среду вводят 0.01-0.2% полимера полиоксипропиленгликолевого эфира [4]
Недостатком стимулятора является ограниченная применимость, малая эффективность, необходимость введения в КЖ посторонних веществ.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание способа получения биопрепаратов путем введения природного компонента, обладающего повышенной эффективностью.

Задача решается введением в КЖ после начала культивирования, но до начала лог-фазы роста, циклического аденозин-3,5-монофосфата (ЦАМФ) в концентрации 1•10^-12-1•10^-6 моль/л.

Для большинства испытанных микроорганизмов оптимальным временем введения является 4-8 ч после начала культивирования, что позволяет удвоить продуцирующую способность микроорганизмов.

Так как ЦАМФ содержится в клетках микроорганизмов в естественном состоянии, введение его микроколичеств в систему не требует дополнительной очистки конечного продукта.

В настоящее время влияние ЦАМФ на продуцирующую способность микроорганизмов, применяемого в основном в молекулярно-биологических исследованиях [5] для повышения продуцирующей способности микроорганизмов, неизвестно. По-видимому, на стадии логарифмического роста клеток экзогенное введение ЦАМФ оказывает регуляторное воздействие на протекающие в ней ферментные процессы, способствуя выведению целевого продукта и сдвигая тем самым равновесие в сторону дополнительного оборудования указанного продукта.

Сущность и практическая применимость иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Исследование влияния ЦАМФ на процесс получения витамина B₂ осуществлялось культивированием Eremothecium Ashbyi штамм ВНИИгенетика 1906, на среде, содержащей 3% соевой муки, 8% мелассы, 1% белково-витаминного концентрата (БВК), 0.5% мела, 0.1% NaCl.

ЦАМФ вводился в среду из расчета дозы 10^-9-10^-12 моль/л на четвертом часу культивирования (общее время культивирования 72-96 ч).

В результате введения добавки концентрация витамина B₂ в КЖ возросла соответственно при введении дозы 10^-12 до 2400 (125%), 10^-11 2025 (106%), 10^-10 до 2350 (122.5%); контроль 1917 мг/мл.

Введение ЦАМФ в дозе 10^-10 на двенадцатом часу культивирования дало концентрацию 2025 мг/мл (106%).

Пример 2. Исследование влияния ЦАМФ на процесс получения тилозина осуществлялось культивированием Streptomyces fr. штамм 3830, на ферментационной среде, содержащей 2.2% рыбной муки, 3.5% мелассы, 0.25% CaCO₃, 0.2% MgSO₄, 0.2% NaCl, 0.35% (NH₄)₂HPO₄, масло соевое 3% Время ферментации 210 ч. Стимулятор вводился в дозе 10^-9-10^-13 моль/л в ферментационную среду через 6 ч после начала культивирования.

Концентрация тилозина в КЖ составила (мг/мл) при введении 10^-9 ЦАМФ 3700 (112% ), 10^-10 3600 (109%), 10^-11 4000 (121%), 10^-12 3650 (110.6%). Без добавок концентрация тилозина 3300 мг/мл.

Пример 3. Влияние ЦАМФ на продуцирующую способность Bac. subtilis r.15 проводилась в колбах объемом 750 мл, содержащих 30 мл среды, содержащей (% мас.):
Крахмал картофельный 10,
Дрожжи кормовые 0,2
Соевая мука 0,2
Кукурузный экстракт 1,0
KCl 0,15
CaCl₂ 0,01
NaCl 0,0001
Li₂SO₄ 0,003
ZnSO₄ 0,003
CuCl₂ 0,00033
(NH₄)₂HPO₄ 1,2
Амилосубтилин ГЗх 0,15
Вода Остальное
Введение ЦАМФ перед посевом в дозе 10^-5-10^-13 моль/л позволило получить концентрацию нейтральной протеазы (ПА) в ед/мл при дозе 10^-10 28.8 (83.7%), 10^-11 27.3 (79.4%), 10^-12 32.9 (101.9%). Контроль 32.3-34.4 ед/мл.

При введении ЦАМФ на шестом часу культивирования ПА составила при дозе 10^-5 29.0 (80%), 10^-6 38.2 (116%), 10^-7 42.2 (126%), 10^-10 39.4 (114.5%), 10^-11 37.4 (115.8%), 10^-12 32.7 (95.1%).

При введении ЦАМФ в дозе 10^-7 моль/л на втором часу культивирования концентрация составила 37.6 (116.1%), на двенадцатом часу 32 (94%).

Литература:
1. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий в жизнедеятельности микроорганизмов. М. 1957.

2. Yoshikawa H. Biochem. Biophys. Acta, 1960, v. 45, p. 270-276.

3. Павлович Н. М. в сб. "Получение и применение регуляторов роста". Л. ЛТН, 1986, с. 59.

4. А. с. СССР 502023, кл. C 12 N 1/38, 1976. (прототип).

5. Botsford T. Microbiol. Rev. 1981, v. 45, 4, p. 620.

Использование: биотехнология, микробиология. Сущность изобретения: способ включает в себя культивирование микроорганизмов в присутствии стимулятора - циклического аденозин-3,5-монофосфата в концентрации 1•10^-12-1•10^-6 моль/л, который вводят в культуральную жидкость на 4-5 ч ферментации, на стадии, предшествующей лаг-фазе. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ культивирования микроорганизмов путем выращивания их в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в присутствии стимулятора роста, отличающийся тем, что в качестве стимулятора на стадии, предшествующей лагфазе, вводят циклический 3,5-монофосфат в концентрации 1•10^-12 1•10^-6 моль/л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что циклический аденозин-3,5-монофосфат вводят на 4 6-м часу культивирования.