Штамм бактерий JeRSINIa реSтIS - продуцент цАМФ-связываюшего белка Советский патент 1991 года по МПК C12N1/21 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, необходимо для разработки методов тестирования представителей рода Jersinla, конструирования бесклеточной системы, в опытах по посадке РНК- полимеразы на матрицу ДНК с целью отбора высокоэффективных промоторов, в экспериментах генной инженерии и биохимии.

Цель изобретения - получение штамма Jerslnla pestls, способного образовывать повышенное количество белка, связывающего циклический аденозин-3,5 -монофос- фат (цАМФ).

Штамм чумного микроба является производным Jerslnla pestls EV76 линии НИИЭГ и получен при помощи химического мутагенеза под действием Ы-метил-М -нит- po-N-нитрозогуанидина и последующей селекции на индикаторных средах как Мэ варианта с плейотропным характером мутационного повреждения.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические свойства. Клетки штамма, окрашенные по Граму, имеют вид полиморфных грамотрицатель- ных неподвижных палочек овоидной формы размером 0,5x1,0 мкм. В мазках из бульонных культур встречаются биполярно окрашенные клетки, расположенные короткими цепочками. На поверхности агара Хоттингера (рН 7,1) при 28°С через 48 ч инкубации культура штамма формирует колонии в Р-форме с шероховатым центром и кружевной зоной, типичные для морфологии чумного микроба. В бульоне Хоттингера ( рН 7.1) при 28°С через 24 ч культивирования штамм дает придонный агО

о

00

со

00

о

мютинзтивный рост в виде хлопьев, среда при этом остается прозрачной.

Штамм Jersinla pestls KM 223 суа не патогенен.

Физиолого-биохимические свойства. Штамм ауксотрофен и нуждается для размножения в L-фенилаланинеи L-метионине. Оптимальными условиями культивирования клеток штамма КМ 223 суа являются значения рН 7,1, t - 26-30°С. Клетки КМ 223 суа способны утилизировать в качестве источника неорганического азота NH-ионы, а также аминный азот в составе аминокислот. Штамм не способен ферментировать глюкозу, маннозу, фруктозу, манит, мальтозу, галактозу в индикаторных средах Гисса и утилизировать эти углероды в качестве единственного источника углерода на поверхности минимальных питательных сред на основе среды М 9. Клетки штамма способны размножаться в интервале значений рН 6,6-8,5.

Особенностью штамма является способность продуцировать повышенное количество белка, связывающего циклический аденозин-3 ,5 -монофосфат, и искусственно введенная в геном мутация, повреждающая активность фермента - аденилатциклазы (КФ 4.6.1.1).

Биотехнологические характеристики. Оптимальными условиями выращивания штамма для получения продукта цАМФ-свя- зывающего белка является агар Хоттингерэ с рН среды 7,1, температура 28°С, продолжительность культивирования бактериальной массы 48 ч. При этом выход продукта составляет около 4-5% от тотального белка бактериальной массы.

Активность аденилатциклазы определяют по способности синтезировать циклический аденозин-31 ,5 -монофосфат. Детектирование цАМФ проводят по методу, основанному на конкуренции между намеченным цАМФ и неизменным количеством 3-Н-меченного нуклеотида за связывание белка протеинкиназы.

Штамм чумного микроба КМ 223 суа хранится в музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института Микроб под номером КМ 223 суа.

Пример 1. Бактериальную массу клеток выращивают на агаре Хоттингера при рН 7,1 в течение 48 ч при 28°С. Клетки суспендируют в 300 мкл 50 мМ трис-HCI (рН 7,5) с 4 мМ ЭДТА (буфер А) до концентрации кл/мл, добавляют 100 мкл хлороформа и встряхивают в течение 15-20 мин. Полученный гомогенат центрифугируют при 10000 g и надосадочную жидкость исследуют на содержание циклического АМФ- и цАМФ-связывающего белка. Количество белка в надосадочной жидкости определяют методом, основанным на спектрофотометрировании растворов при двух длинах волн, где мерой концентрации белка служит разность в величине оптической плотности (ОП) при 228,5 и 234,5 нм. Концентрация белка в надосадочной жидкости, вносимой

0 в пробу для определения цАМФ, составляет 40-60 мкг.

При определении цАМФ инкубацию образцов проводят на ледяной бане в течение 2 ч. Отделение белок-связанного цАМФ от

5 несвязанного нуклеотида осуществляют адсорбцией свободного нуклеотида на угле марки НоритА, для чего в каждую пробу добавляют 100 мкл угольной суспензии (2,6% раствор угля, 2% раствор БСА в буфе0 ре А) с последующим центрифугированием при 10000 g в течение 1 мин. Равные количества суспернатанта (200 мил)из алик- вот помещают во флаконы и просчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчи5 ке. С помощью слепой пробы определяют уровень неспецифически сорбирующейся радиоактивности. Этот фон вычитают из значения радиоактивности в каждой пробе. Кроме того, в каждом опыте всю процедуру

0 инкубации и последующие операции проводят с пробами, в которые вносят немеченный цАМФ (нулевые). Радиоактивность нулевых проб (Со) делят на радиоактивность в каждой пробе (Сх). Таким образом, для

5 каждой пробы получают значение С0/Сх. По этим значениям строят стандартную калибровочную кривую и определяют количество цАМФ в исследуемом образце. Концентрацию нуклеотида выражают в пикомолях на 1

0 мг белка.

При выявлении цАМФ-связывающей активности инкубационная смесь объемом 200 мкл содержит 50 мкл буфера А, 50 мкл 3-Н-цАМФ (20000 импУмин) и 100 мкл ис5 следуемого экстракта (100-200 мкг по белку). После 2-часовой экспозиции в ледяной бане к пробе добавляют 100 мкл угольной суспензии, центрифугируют при 10000 g 1 мин и аликвоту в 200 мкл переносят во

0 флакон для счета на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Активность выражают в пикомолях цАМФ, связываемого 1 мг белка за 2 ч инкубации. Активность цАМФ- связывающего белка штамма чумного мик5 роба КМ 223 суа составляет 1,35 пмоль/мг белка, что в 2 раза превышает активность цАМФ-связывающего белка исходного штамма Jersinla pestis EV 76 линии НИИ- ЭГ, составляющую 0,6 пмоль цАМФ/мг белка.

Клетки штамма КМ 223 суа выращивают на агаре Хоттингера при рН 7,1 и 28°С в течение 48 ч. Бактериальную массу разрушают и экстрагируют 0,02 М калийфосфат- ным буфером рН 7,0 с 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 2% глицерина (буфер А). Экстракт осветляют центрифугированием при 18000 g 30 мин и для освобождения от нуклеиновых кислот фильтруют на приборе Amicon через мембрану ХМ 300. К фильтрату добавляют фенил метилсуль- фонилфлюорид до конечной концентрации 1 мМ с последующей инкубацией в течение 4 ч при 37°С. Для частичного удаления балластных белков 740 мг белка наносят на колонку (25 х 300 мм) с ДЕ-52, уравновешенную буфером А, со скоростью 50 мл/ч, АМФ-связывающая активность на ионооб- менник не сорбируется, полученный элюат, содержащий около 200 мг белка, для полно- го освобождения от сопутствующих белков наносят на колонку ( мм) с биогелем НТР, предварительно уравновешенную 10 мМ калийфосфатным буфером с рН 6,6, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 2% глицерина (буфер Б). Активные фракции элюируют линейным градиентом 10-500 мМ буфера Б со скоростью элюции 20 мл/ч 24 ч. цАМФ-связывающий белок элюируют при ионной силе буфера Б около 400 мМ. Выход продукта (цАМФ-связыбающего белка) составляет 2,4% от общего белка бактериальной массы родительского штамма и 5,0% от общего белка бактериальной массы штамма КМ 223 суа. Гомо- генность препаратов подтверждают электрофорезом в полиакриламидном геле и преципитацией в агарозном геле с коммерческой чумной агглютинирующей сывороткой.

Пример 3. Для получения антисыворотки к гомогенному цАМФ-связывающему белку проводят иммунизацию кроликов породы Шиншилла весом 2,5 кг. Для одной инъекции используют40-60 мкг белка, растворенного в физиологическом растворе. Непосредственно перед иммунизацией

белковый препарат тщательно перемешивают с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 2:1 в обьеме 0,2-0,3 мл. Животных иммунизируют подкожно через каждые 7 дн в течение 2 мес. Сообразовавшегося сгустка сыворотку отделяют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 15 мин. Сыворотку хранят при -20°С.

Моноспецифическую сыворотку к Сгр- белку чумного микроба используют для об- наружения сходного белка у других микроорганизмов. Для определения антигенного родства в реакции преципитации берут очищенный препарат Crp-белка чумного микроба (продукт), грубый экстракт микроба чумы и экстракты клеток E.coll, J.emerocolitica, J. pseudotuberculosis, Mlcrococcus lysodeictlcus, Vibrio NAG, Vibrio eltor, Bacillus anthracls и BordeteJIa pertussis.

Нагрузка гомогенного Crp-белка составляет 6 мкг в лунку, а экстрактов 0,5 мг. Образование линий преципитации наблюдают только в случае очищенного цАМФ- Связывающего белка, экстрактов чумного микроба и J.pseudotuberculosis. У остальных микроорганизмов, включая и таксономически близкую J.enterocolltlca, данным методом сходного белка не обнаруживают.

Штамм Jerslnla pestls KM 223 суа отвечает всем требованиям культуры-продуцента - безопасный для окружающих при работе, обладает повышенным уровнем продукции цАМФ-связывающего белка и несет мутационное повреждение гена аде- нилатциклазы.

Таким образом, изобретение позволяет получить гомогенный цАМФ-связывающий белок с активностью до 1,35 пмоль/мг белка при выходе целевого продукта 4-5% от общего белка биомассы штамма.

Формула изобретения Штамм бактерий Jersinla pestls KM

223 суа - продуцент цАМФ-связывэющего

белка.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и необходимо для разработки методов тестирования представителей рода YERSINIA, конструирования бесклеточной системы, в опытах по "посадке" РНК-полимеразы на матрицу ДНК. Целью изобретения является создание штамма YERSINIA PESTIS, способного образовывать повышенное количество белка, связывающего циклический аденозин-3¹, 5¹-монофосфат. Штамм чумного микроба КМ 223 суа является производным вакционного штамма YERSINIA PESTISEV 76 линии НИИЭГ. ПОЛУЧЕН ПРИ ПОМОЩИ ХИМИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА N-МЕТИЛ-N-НИТРО-N-НИТРОЗОГУАНИДИНОМ КАК МАЛЬТОЗОНЕГАТИВНЫЙ МУТАНТ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ТЕСТИРОВАНИЕМ АКТИВНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ И ЦАМФ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА ПО КИНЕТИКЕ НАКОПЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДА. ВЫХОД ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА СОСТАВЛЯЕТ 4 - 5% ОТ ОБЩЕГО БЕЛКА БИОМАССЫ, ПРИ АКТИВНОСТИ 1,35 МОЛЕЙ/МГ БЕЛКА. ШТАММ ДЕПОНИРОВАН ВО ВСЕСОЮЗНОМ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ПРОТИВОЧУМНОМ ИНСТИТУТЕ "МИКРОБ".