СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/50 C12N15/00 

Изобретение относится к медицине, в частности в клинической микробиологии.

Существует способ диагностики туберкулеза, в основу которого положен принцип полимеразной цепной реакции. В литературе имеются сведения о тест-системах, основанных на амплификации уникальных инсерционных элементов ДНК микобактерий и их фрагментов (A. H.Kolk et.al, 1990; O.Wit et al. 1992). Однако эти системы имеют ряд недостатков. Прежде всего при рекомендуемой температуре отжига праймеров (55^oC) наблюдается большое количество неспецифических реакций амплификации с ДНК различных видов микроорганизмов. Кроме того, тест-системы не обеспечивают дифференциацию M. tuberculosis и микобактерий группы M. bovis, в том числе M. bovis BCG.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: для выявления микобактерий в клиническом материале с помощью полимеразно-цепной реакции использовали две амплификационные тест-системы. Основу первой составляют праймеры
TUBA; 5' CGTCCTGACGGTAATGGGGT-3'
TUBO; 5' CGCCCATCCACATCCCGCCC-3'
Основу второй INS-I и INS-II.

INS-I 5'-GGTGGGAGGGAGGGCATCGAGGTGGC-3'
INS-II 5'-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3'
Праймеры синтезированы на генном синтезаторе "Gene Assembler" (Pharmacia-αKβ).

Для осуществления способа предлагаются оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси:
общий объем 25 мкл
67 мМ Трис HCI pH 8,6
16,6 мМ (NH₄)₂SO₄
10 мМ b-меркаптоэтанол
6,7 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)
5 мМ MgCl₂ (для TUBA и TUBO)
или 2,5 мМ MgCl₂ (для INSI и INSII),
0,17 мг бычьего сывороточного альбумина фракции У (ВСА) 125 мкл каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (альфа-ATP, альфа-CTP, альфа-TTP, альфа-GTP).

10 пмоль праймеров
2 ед. Tag полимеразу (Биотех, Россия).

Отжиг праймеров осуществляли при 65^oC. При этой температуре исчезают неспецифические реакции амплификации с ДНК наиболее распространенных возбудителей легочных заболеваний и ДНК человека. Наблюдается амплификация только с ДНК M. tuberculosis и M. bovis (при использовании системы с TUB-праймерами) и ДНК M. tuberculosis (при использовании системы с INS-праймерами).

Использование отжига праймеров при температуре 65^oC и предлагаемой концентрации компонентов реакционной смеси позволяет выявить в 98 случаев микобактерии группы туберкулеза.

Время проведения анализа с момента поступления диагностического материала составляет 48 ч.

Пример 1. Клинический материал мокроту, выделенную от больного К. с подозрением на туберкулез, исследовали с помощью метода полимеразной цепной реакции и методом микроскопии и посева. Для этого мокроту обработали 0,1 раствором NaPO₄ в течение 24 ч при 37^oC. После центрифугирования часть осадка использовали для приготовления мазков и посева на плотную питательную среду Финна-II, а 0,5 мл осадка использовали для постановки полимеразной цепной реакции.

Обработку диагностического материала для лизиса клеток и выделения ДНК производили по известной методике (см. кн. Маниатис и Фрич, М. 1986), после выделения ДНК к 10 мкл пробы добавляли компоненты реакционной смеси с праймерами TUBA и TUBD.

Предплавление проводили при 65^oC. Амплификацию осуществляли на амплификаторе Биоком-сервис по стандартной методике.

Выявление продуктов реакции проводили электрофорезом в 1,5 агарозном геле с трис-ацетатным буфером, в качестве красителя использовали бромфеноловый синий. При просмотре геля под ультрафиолетовой лампой отмечены четкие полосы амплифицируемой ДНК M. tuberculosis из пробы исследуемого больного. Результат о наличии микобактерий туберкулеза получен через 48 ч, а рост культуры микобактерий на плотной среде получен через 3 месяца.

Таким образом, у данного больного подтвержден клинический диагноз туберкулеза.

Пример 2. Пунктат холодного абсцесса плеча больного А. 7 лет с подозрением на поствакцинальное осложнение после БЦЖ-вакцинации исследовали методом ПЦР. Лизис клеток и выделения ДНК осуществляли по стандартным методикам.

В полимеразной цепной реакции использовали праймеры INSI и INSII; TUBA и TUBO.

К 5 мкл пробы после выделения ДНК добавляли ингредиенты реакционной смеси. Температура обжига праймеров была 65^oC. На электрофорезе продуктов ПЦР выявлена полоса амплифицируемого фрагмента ДНК при использовании TUB-праймеров и отсутствие ее при амплификации с INS-праймерами.

Таким образом, доказано поствакцинальное осложнение M. bars BCG.

Предлагаемый способ диагностики туберкулеза позволяет в короткие сроки (48 ч) произвести выявление и дифференциацию возбудителя туберкулеза в диагностическом материале и установить диагноз туберкулез.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической микробиологии. Изобретение позволяет выявить в 98 % случаев микробактерии группы туберкулеза. Способ заключается в следующем: для выявления микробактерий в клиническом материале с помощью полимеразноцепной реакции использовали две амплификационные тест-системы. Осуществляли способ с помощью оптимальных концентраций компонентов реакционной смеси. Отжиг праймеров осуществляли при температуре 65^oC.

Способ диагностики туберкулеза путем проведения полимеразно-цепной реакции на клиническом биологическом материале с последующим электрофоретическим выявлением инсерционных элементов ДНК микобактерий и их ферментов с помощью амплификационных тест-систем, отличающийся тем, что используют две амплификационные тест-системы на основе праймеров ТUВ А. ТUВ D и INS-I, INS-II, отжиг праймеров ведут при t 65^oС и при выявлении электрофоретической полосы амплифицируемого фрагмента ДНК только при исследовании ТUВ-праймера диагностируют туберкулез.