СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ИЗОНИАЗИДУ Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/68 C12R1/32 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности, к способу диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к препарату первого ряда - изониазиду по обнаружению мутаций в гене kasA, обуславливающему резистентность к этому препарату, путем анализа последовательностей ДНК МБТ с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов.

Рост заболеваемости туберкулезом остается одной из наиболее актуальных проблем практического здравоохранения. На фоне неблагоприятной эпидемиологической ситуации, все большее значение приобретает увеличение числа штаммов МБТ с лекарственной устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) - изониазиду и рифампицину, что определяет 95% случаев множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).

Основным методом определения чувствительности МБТ к химиопрепаратам остается посев бактериологического материала на среду Левейштейна-Йенсена (Л-Й), содержащую различные концентрации ПТП. Но он длителен и занимает 2-3 месяца, а полученные результаты становятся не актуальными для назначения пациенту адекватного лечения. Вошедшие в последние годы в практику автоматизированные системы, использующие жидкие среды, ВАСТЕС MGIT (Becton Dickinson) и MB/BacT (BioMerieux), сокращают сроки получения результата до 30-40 дней, но кардинально не решают данную проблему и своевременное определение чувствительности к ПТП, в частности, к изониазиду остается актуальной проблемой.

Одним из наиболее перспективных направлений, в настоящее время, стало использование молекулярно-биологических методов определения лекарственной чувствительности к ПТП. Благодаря расшифрованию генома МБТ, стали известны гены, продукты которых являются мишенями для действия различных противотуберкулезных препаратов, а возникновение мутаций в них приводят к резистентности к этим препаратам (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол, пиразинамид). В случае изониазида, в основном, это мутации в четырех генах: kat G, inh A, ahp C и kas A. Из литературы известно, что активность работы генов связана между собой: увеличивается резистентность по kat G, уменьшается по inh A, увеличивается активность негиминовой пероксидазы, за которую ответственен ahp C (Ortiz de Montellanop R., Hillas P., Zhang Z., Wilks A. Oxidative stress drag resistance in M.tuberculosis. Rev tarm e bioguim Univ. Sao Paulo. 1998. 34. № 1 р. 53). Поэтому анализ работы каждого из генов важен для понимания механизма резистентности МБТ к изониазиду. Известно, что около 10-15% штаммов МБТ имеют мутацию в гене kas A. Выявление мутаций в генах kat G, inh A и ahp C определяет чувствительность к изониазиду для 80% штаммов МБТ (предыдущее изобретение № 2200323), т.е определение чувствительности по kas A дает дополнительную информацию по исследуемому штамму.

Для детекции бактериальных мутаций разработан широкий спектр методов. Это: аллель-специфичная полимеразная цепная реакция (ПЦР), достройка цепи меченым дидезоксирибонуклеозидтрифосфатом, анализ полиморфизма рестрикционных фрагментов, секвенирование, дидезоксифингерпритинг, метод несовершенного дуплекса, метод структурно-специфичного расщепления нуклеазой, метод "обратной" гибридизации ДНК иммобилизовнным на твердой подложке зондами, гибридизация на микрочипах, метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов. Каждый из представленных методов имеет как свои достоинства, так и недостатки, но эти методы, главным образом, в настоящее время, применяются в научно-исследовательских лабораториях, для решения теоретических проблем (Delgado M.B., Telenti A. Detection of Fluoroquinolone Resistance Mutation in M.tuberculosis. In PCR Protocols for Emerging Infections Diseases. 1996, ASM press, Washington, p.138-143; Telenti A., Imboden P., Marchesi F.,et al. Detection of rifampin resistance mutation in M.tuberculosis. Lancet. 1993. 341, p. 647-650; Caugant D.A., Sandven P., Eng J., Jeque T. Detection of rifampin resistance among of Mycobacterium tuberculosis from Mozambigue. 1995, 4, p. 321-325).

Аналогом данного изобретения является способ определения мутаций в генах ДНК МБТ, ответственных за резистентность к изониазиду у больных туберкулезом (Victor T.C., Jordaan A.M. Detection of mutation in drug resistance genes of M.tuberculosis by a dot-blot hybridization strategy. 1999. Int. J.Tuberc and Lung Disease. 79 (6), p. 343-348. Bahrmand A., Bakaev V. Rapid detection of multidrug-resistant tuberculosis using molecular genetic metods. 1998. Int. J.Tuberc and Lung Disease.2, 11, p.346; Gonzales N., Torres J., Aznar J., Polomares J.C. Molecular analysis of rifampin and isoniazid resistance of M.tuberculosis clinical isolates in Seville. 1999. Tubercle and Lung Disease. 79, 3, p. 187-190.; Pretorius G.S., van Helden P.D., Sirgel F., Eisenach K.D. Mutation in katG Gene Seguences in Isoniazid-Resistant Clinical Isolates of M.tuberculosis are Rare. Antimicrob. Agents Chemother. 1995, 39, 10, p.2276-2281).

Названные авторы изучали устойчивость к изониазиду, связанную с мутациями в генах katG, inhA и ahpC. Каждый автор использовал свои условия амплификации для каждого исследуемого гена, что значительно увеличивало объем работы.

Прототипом данного изобретения является ранее предложенный нами комплекс, объединяющий в себе полимеразную цепную реакцию с дальнейшим анализом ампликонов методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (PCR-SSCP) для определения мутаций в 3-х основных генах M.tuberculosis: katG, ahpC, inhA, ответственных за резистентность к изониазиду (предыдущее изобретение № 220032).

Данный комплекс методов состоит из нескольких этапов:

Исследуемая последовательность ДНК изучаемого объекта клонируется методом ПЦР.

ПЦР-продукт подвергается термической денатурации в присутствии дестабилизирующих двойную спираль агентов, например формамидом, переносится на лед.

Смесь наносят на полиакриламидный гель и разделяют с помощью высоковольтного электофореза.

Окрашивание геля производят с помощью красителя азотно-кислого серебра или Sybr Green 2.

Исходные последовательности имеют различную электрофоретическую подвижность, связанную с геометрическими характеристиками надмолекулярных структур, образуемых данной последовательностью. Получаемая картина специфична для исследуемой последовательности, причем в случае замены одного нуклеотида в цепи происходит изменение картины, получаемой с помощью электофореза, т.е нити амплификационных денатурированных последовательностей с исследуемых участков ДНК расходятся на разное расстояние друг от друга. Степень расхождения денатурированных нитей выявляется с помощью окрашивания геля.

Таким образом, данный метод является достаточно доступным (метод полимеразной цепной реакции, методика электрофореза применяются сейчас во всех биохимических лабораториях), специфичным (работа проводится непосредственно с ДНК бактерий) и достаточно чувствительным (поскольку методом полимеразной цепной реакции выявляется ДНК единичных клеток).

Отличия предлагаемого нами способа от предыдущего состоит в следующем. Исследование чувствительности к изониазиду проводится еще по одному гену kasA, также участвующему в резистентности к этому препарату. Для этого гена подобраны пары праймеров, а также программа амплификации. После проведенного электрофореза на электрофореграмме можно выявить мутации в гене kasA. Таким образом, в течение двух дней можно определить чувствительность к изониазиду по четвертому основному гену и тем самым обеспечить вероятность выявления мутаций, ответственных за резистентность к изониазиду, дополнительно еще в 10 - 15% случаях.

Для решения проблемы впервые были разработаны условия для каждого из этапов метода:

- для синтеза ДНК МБТ гена kasA из нескольких пар праймеров были отобраны следующие:

Ген kasA: 1-й - 5GGC GAC GCG GAT GGC GTT 3

2-й - 5TCG AGA CGG AGG AGC ACG CCA A 3

- был подобран состав амплификационного буфера, где важными составляющими являются тип буфера, концентрация трифосфатов, концентрация ионов магния, таким образом, что в составе реакционной среды для гена kasA была изменена концентрация ионов магния. В 30 мкл среды содержалось: 10 мМ Трис-HCl рН 8,8; 50 мМ KCl; 0,5% Твин 20; 5% - формамида, 2,0 мМ MgCl₂, 1,5 U Taq полимеразы, по 200 мкМ каждого нуклеозидтрифосфата, по 0,1 - 0,15 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера и 3 мкл образца;

- был подобран режим амплификации, варьируя температурами отжига для пары праймеров, временем каждого цикла и количеством циклов. Режим амплификации был подобран таким образом, что условия для достаточного синтеза нужных фрагментов ДНК МБТ гена kasA совпадал и с программой амплификации для генов katG, ahpC и inhA (предыдущее изобретение № 2200323), что значительно упрощало работу по выявлению мутаций во всех четырех генах. Выбранные условия представляют собой следующее: 1-й этап: 95° - 5 мин, 60°- 2 мин; 2-й этап: 72° - 1 мин, 95° - 40 сек, 60° - 1 мин (35 циклов); 3-й этап: 72° - 10 мин;

- были подобраны условия для изучения конформационного полиморфизма одноцепочечных ампликонов, полученных на предыдущем этапе, а именно условия денатурации полученных ампликонов (соотношение ампликонов и денатурирующего раствора, время денатурации), состав полиакриламидного геля (процентное содержание полиакриламида с глицерином и состав буфера), условия разделения (напряжение, время электрофореза, температура), позволяющие повысить эффективность разделения одноцепочечных фрагментов исследуемых амликонов. Подобранные условия следующие: денатурация проводится при 95°С - 10 мин, для денатурации смешивали 3 мкл образца и 3 мкл денатурирующего раствора, разделение денатурированных ампликонов проводят в 8% полиакриламидном геле с 5% глицерином при температуре 8°С, напряжение 450 В, 5 часов, в ТВЕ буфере.

Окраску электрофореграмм проводили красителем Sybr Green 2, согласно рекомендациям фирмы производителя данного реагента.

Детекция результатов. После окраски, электрофореграмму помещают под УФ (трансиллюминатор), длина волны - 254 нм. Окрашенные денатурированные ампликоны представляют собой по две белые светящиеся полоски, для каждого образца. Для определения мутаций в гене, наряду с ампликонами исследуемого образца исследуют и ампликоны ДНК МБТ чувствительного штамма. Если штамм МБТ резистентен к изониазиду, расстояние между денатурированными нитями амплифицированных фрагментов ДНК резистентных штаммов отличается от расстояния между нитями амплифицированных фрагментов ДНК чувствительного штамма, т.е праймеры, условия амплификации и детекции были подобраны согласно ранее предлагаемому изобретению по выявлению мутаций в генах katG, ahpC, inhA для того, чтобы при одних и тех же условиях амплификации и детекции, из одного образца, используя только разные праймеры, можно было определить чувствительность к изониазиду по выявлению мутаций в четырех генах, наличие которых характерно для 90% штаммов МБТ.

Предлагаемый способ по выявлению минимального количества ДНК МБТ в пробе показал, что с помощью отработанного метода удается выявить ДНК, эквивалентное ДНК единичных клеток МБТ. Исследования по выявлению резистентности к изониазиду проводили на ДНК МБТ, полученной из клинических образцов и клинических изолятов от этих образцов, выращенных на жидких средах и среде Л-Й. Образцы получали от больных с разными формами туберкулеза, находящихся на лечении в МНПЦ БТ.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при отборе терапевтических средств для лечения туберкулеза. Диагностику проводят путем определения чувствительности микобактерий туберкулеза (МБТ) к изониазиду по выявлению мутаций в генах katG, inhA, oxyR/ahpC с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов и по обнаружению мутаций в гене kasA, обуславливающему резистентность к этому препарату дополнительно для 10% случаев. Для ДНК исследуемого гена kasA были подобраны праймеры, условия амплификации и отработаны условия электрофореза. Нуклеотидные последовательности пары праймеров приведены в формуле. Для амплификации используют буфер, содержащий в 30 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 0,5% Твин 20, 5% формамида, 2,0 мМ MgCl₂, 1,5 U Tag полимеразы, по 200 мкМ каждого нуклеозидтрифосфата, по 0,1-0,15 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера и 3 мкл образца.

Способ диагностики чувствительности Mycobacterium tuberculosis к изониазиду, включающий постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров и амплификационного буфера, денатурацию полученных ампликонов, выявление в них мутаций в трех основных генах katG, ahpC, inhA методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов и диагностированием чувствительности по разнице их электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что дополнительно выявляют мутации в гене kasA с использованием для ПЦР пары праймеров 5' GGC GAC GCG GAT GGC GTT 3' и 5' TCG AGA CGG AGG AGC ACG CCA A 3' и амплификационного буфера, содержащего в 30 мкл: 10 мМ Трис-HCl рН 8,8; 50 мМ KCl; 0,5% Твин 20; 5%- формамида, 2,0 мМ MgCl₂, 1,5 U Tag полимеразы, по 200 мкМ каждого нуклеозидтрифосфата, по 0,1-0,15 мкМ каждого олигонуклеотидного праймера и 3 мкл образца.