КОМБИНИРОВАННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И MYCOBACTERIUM BOVIS Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Может быть использовано в лабораториях противотуберкулезных учреждений, а также ветеринарии.

Для отличия M.tuberculosis от M.bovis и от других микобактерий применяют ниациновый тест с цианистыми солями, требующий специального оснащения для работы с ядовитыми соединениями. Кроме того, ниациновую пробу проводят с культурой, выращенной на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена без малахитовой зелени, т. е. требуется приготовление дополнительно модифицированной среды Левенштейна-Йенсена.

Селективно-ингибирующая M. bovis среда с 2-тиофен-карбоксил-гидразидом (ТСХ) дифференцирует этот вид от других видов микобактерий.

Для дифференциации M. tuberculosis и M.bovis пользуются также реакцией восстановления нитратов в нитриты. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего вида и от некоторых атипичных, у которых этот фермент отсутствует.

В научной и информационно-патентной литературе, а также в практике фтизиобактериологии не известен способ одновременного идентифицирования M.tuberculosis, M.bovis, а также группы атипичных микобактерий по росту на среде с ТСХ и нитратредуктазной активности.

Определение микобактерий туберкулеза с использованием ниацинового теста является небезопасным методом и требует работы микробиологической лаборатории в определенном режиме.

Постановка нитратредуктазной реакции в большинстве рекомендаций включает выращивание исследуемой культуры до массивного накопления, однако чтение результатов проводится через 15 16 ч.

Сущность настоящего изобретения:
а) создание комбинированной среды с импортным ТСХ и NaNO на основе доступных отечественных препаратов,
б) исключение дополнительного этапа в определении нитратредуктазной реакции, возможность ее определения в течение 5 10 мин,
в) одномоментность дифференциации М.tuberculosis и М.bovis и атипичных микобактерий,
г) безопасность анализа.

Решение поставленных задач обеспечивается введением в плотные среды Попеску или Левенштейна-Йенсена азотнокислого натрия и ТСХ (2-тиофен-карбоксил-гидразид) при следующем количественном соотношении компонентов, мас.

железоаммиачные квасцы 0,045 0,055
магний сернокислый 0,47 0,53
натрий лимоннокислый однозамещенный или натрий гидрат 1,5-водный 0,950 1,050
калий фосфорнокислый однозамещенный 14,5 15,5
глутаминовая кислота 9,5 10,5
глицерин 19,0 21,0
азотнокислый натрий 0,9 1,1
ТСХ (2-тиофен-карбоксил-гидразид) 0,1 0,5
дистиллированная вода остальное
ТСХ (2-тиофен-карбоксил-гидразид) и азотнокислый натрий добавляют перед свертыванием.

Выявление нитратредуктазной активности выполняется следующим образом: 2
3 капли стандартного реактива Грисса (7,0 7,5% раствор на дистиллированной воде) закапываются на косяки с постоянной культурой. Красно-ржавое окрашивание поверхности среды и культуры считают положительной нитрат-редуктазной реакцией. При отрицательной реакции среда синеет.

Как видно из компонентного состава среды Попеску и Левенштейна-Йенсена, предлагаемый субстрат состоит из доступных отечественных препаратов, среды могут быть приготовлены в любой микробиологической лаборатории. Указанная среда в лаборатории микробиологии ЦНИИТ РАМН входит в комплект сред по определению лекарственной устойчивости и для быстрой идентификации M.tuberculosis и M.bovis.

Дифференцирующая способность комбинированной среды с NaNO и ТСХ отражена в таблице.

Как видно из таблицы, отсутствие роста или слабый рост на комбинированной среде и отрицательная нитратредуктивная реакция характеризуют штаммы М. bovis. Рост на комбинированной среде и положительная нитратредуктазная реакция характеризуют штаммы М.tuberculosis. Отсутствие нитратредуктазной активности и рост на среде с ТСХ и с пиразинамидом характеризуют штаммы группы M.avium-intracellulare.

Отмеченные различия двух видов истинных микобактерий подтверждены ростом штаммов на среде с пиразинамидом. Дифференциация проведена одновременно на одной пробирке с комбинированной средой.

Использование: медицинская микробиология, питательная среда для дифференциации микобактерий. Сущность изобретения: для дифференциации микобактерий комбинированная питательная среда содержит железоаммиачные квасцы, магний сернокислый, натрий лимоннокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, глутаминовую кислоту, глицерин, азотнокислый натрий, ТСХ (2-тиофен-карбоксил-гидразид) и дистиллированнную воду. Причем ТСХ (2-тиофен-карбоксил-гидразид) и азотнокислый натрий добавляют перед свертыванием. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Комбинированная питательная среда для дифференциации Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis, содержащая железоаммиачные квасцы, магний сернокислый, натрий лимоннокислый однозамещенный или натрий гидрат 1,5-водный, калий фосфорнокислый однозамещенный, глутаминовую кислоту, глицерин, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит азотнокислый натрий, ТСХ (2-тиофен-карбоксил-гидразид) при следующем соотношении компонентов, мас.

Железоаммиачные квасцы 0,045 0,055
Магний сернокислый 0,47 0,53
Натрий лимоннокислый однозамещенный или натрий гидрат 1,5-водный 0,950 1,050
Калий фосфорнокислый однозамещенный 14,5 15,5
Глутаминовая кислота 9,5 10,5
Глицерин 19,0 21,0
Азотнокислый натрий 0,9 1,1
ТСХ (2-тиофен-карбоксил-гидразид) 0,1 0,5
Дистиллированная вода Остальное
2. Комбинированная питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что ТСХ (2 тиофен-карбоксил-гидразид) и азотно-кислый натрий добавляют перед свертыванием.