СПОСОБ ИНДИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА В ВОЗДУШНОЙ СРЕДЕ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к медицине, в частности санитарии и гигиене.

Вопрос определения микобактерий туберкулеза в воздухе чрезвычайно актуален, поскольку туберкулез является воздушно-капельной инфекцией и заражение происходит через воздушную среду. В 1962 г. R.L.Riley et.al. изучая инфицированность воздуха МБТ, показали, что воздух палат, где находятся туберкулезные больные-бацилловыделители, вызывает генерализованный специфический процесс у морских свинок. Более поздние исследования (Н.В.Чугунихиной, 1971) также показали, что после выделения из макроорганизма микобактерии в течение нескольких часов могут находиться в воздухе в капельной фазе аэрозоля, а затем медленно оседают на поверхность различных предметов, где могут накапливаться в значительном количестве, превышающем минимальную дозу заражения. Особый интерес представляет загрязненность микобактериями помещений противотуберкулезного учреждения, где возможно выделение во внешнюю среду значительного количества туберкулезных микобактерий. Еще в конце прошлого столетия Корнет установил, что медицинские работники болеют туберкулезом чаще, чем остальное население, современные эпидемические данные это подтверждают (А.Е.Рабухин, 1957, М.Н.Зуева, 1996).

Однако этот вопрос определения наличия микобактерий в воздухе до сих пор не решен из-за следующих причин:
1. Бактериологический метод недостаточно чувствителен. Концентрация микобактерий в воздухе даже в непосредственном окружении больного-бактериовыделителя недостаточна для выявления его бактериологическими методами (бактериоскопия и культуральная диагностика).

2. Микобактерия туберкулеза на питательных средах растет очень медленно и результат становится известен через 2,5-3 месяца, что для санитарно-гигиенических целей неприемлемо, поскольку результат теряет смысл.

По данным М. Н.Лебедевой (1963), Г.М.Туркиной (1982), Л.А.Виноградовой (1988), E.A.Nardell et.al.(1991), санитарно-бактериологическое исследование воздуха можно проводить двумя методами: седиментационным и аспирационным. Из воздуха микобактерии выделяли седиментационным методом (путем их естественного осаждения на чашки с питательными средами), а в последнее время широко используется аспирационный метод, представляющий процесс прокачивания больших объемов воздуха через различные фильтры.

Седиментационный метод (по Коху) - оседание микробов под действием силы тяжести - является простым методом для изучения неспецифической микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определенное время (5-10 мин на общую обсемененность и не менее 40 мин на кокковую микрофлору).

Аспирационный метод с помощью аппарата Кротова. Он дает возможность исследовать определенный объем воздуха. Аппарат смонтирован в портативном ящике и состоит из узла для отбора проб воздуха, микроманометра и электромотора.

Н. В. Чугунихина (1973) провела сравнительную оценку 3 методов отбора проб воздуха для количественного определения возбудителя туберкулеза: метод мембранных фильтров, фильтров АФА-В-18 у, прибора ПОВ-1 (Прибор отбора воздуха - 1).

Механизм улавливания микроорганизмов прибором ПОВ - 1 основан на диспергировании жидкости током проходящего воздуха и задержке на каплях улавливающей жидкости бактерий, находящихся в пылевой и капельной фазах аэрозоля.

Капли улавливающей жидкости ударяются о вертикальную поверхность бактериоуловителя, стекают вниз и вновь диспергируются. В качестве улавливающей жидкости использовалась синтетическая среда Школьниковой в количестве 5 мл.

Поскольку существующие микробиологические методы выявления МБТ в воздухе помещений недостаточно чувствительны, а проведение исследования занимает продолжительное время, используются косвенные показатели (определение общего содержания микробов и содержание золотистого стафилококка в 1 куб. метре воздуха), которые не дают возможности объективно оценивать наличие или отсутствие в воздухе противотуберкулезных помещений МБТ. Следовательно, не представляется возможным целенаправленно проводить профилактические и противоэпидемические мероприятия в них.

В.В.Дробеня (1980) показал, что прибор ПАБ-1 извлекает из воздуха на 40% больше микроорганизмов, чем аппарат Кротова.

Прибор ПАБ-1 (пробоотборник аэрозоля бактериологический) сконструирован Ленинградским филиалом Всесоюзного НИИ медицинского приборостроения. Прибор основан на принципе электропреципитации. ПАБ-1 состоит из 2-х переносных блоков: собственно прибора и укладки. Собственно прибор смонтирован в портативном ящике и состоит из узла для отбора проб воздуха (где вмонтирована металлическая нить для создания зоны отрицательного коронного разряда), микроманометра, микроамперметра и электромотора. В укладке имеется 40 металлических поддонов для питательных сред и 20 пробирок для транспортировки жидких питательных сред. В приборе ПАБ-1 частицы (бактерии) при просасывании проб воздуха заряжаются в зоне отрицательного коронного разряда, а затем попадают в электрическое поле и оседают на положительно заряженном электроде, изготовленном в виде сменного металлического поддона, который покрывается жидкостью или плотной питательной средой. С помощью прибора ПАБ-1 можно отбирать пробы воздуха со скоростью 150-250 литров в минуту.

Бактерии, находящиеся в некультивируемом состоянии, не выявляются традиционными методами микробиологического исследования. Использование молекулярно-генетической технологии (ПЦР) позволило выявить эти микобактерии. Феномен существования жизнеспособных бактерий в некультивируемом состоянии имеет серьезное значение в инфекционной патологии людей и животных, поскольку установлено, что некультивируемые формы бактерий сохраняют свой патогенный потенциал. Обнаружение некультивируемых форм дало новый импульс для исследования экологических и молекулярно-генетических механизмов существования возбудителей инфекций в природе (Романова Ю.М., 2000).

Большой интерес представляет как у исследователей, так и в практических лабораториях метод определения инфекционных агентов с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод умножения (амплификации) специфических последовательностей нуклеотидов (Mullis К.В., Faloona F.A, 1987), с помощью которого в течение нескольких часов можно размножить фрагмент ДНК с нужной последовательностью нуклеотидов в миллионы раз. Принцип метода был предложен и реализован в 1985 году американским ученым Кэри Мюллис (Mullis К. В. , Faloona F.A., 1987) и в настоящее время успешно используется при определении возбудителей многочисленных инфекционных заболеваний: туберкулез, лепра (Hartskeeri R. A. , De Wit M.Y.L., Klatser P.R., 1989), хламидиоз (Griffais R., Thibon M., 1989), микоплазмоз (Bemet C., Garrett M., de Barbeuras B. et al., 1989), вирусные заболевания (Saito l., Servenius B., Compton T. , Fox R.I., 1989; Shibata D., Martin W.J., Appieman M.D. et al., 1988); при определении устойчивости возбудителя к лекарственным препаратам (Muller L. P. , Grawford J.T., Shinnick T.M., 1994; Telenti A., Imboden P., Marchesi F. et al., 1993); для видовой идентификации возбудителя (Musial C.E., Tice L.S.Stockman L., Roberts G.D., 1988; Yamamoto Т., Shibagaki T., Yamori S. et al. , 1993); для оценки эффективности лечения (Kennedi N., Gellespie S.H., Saruni A.O. et al. 1994); для диагностики генетических расстройств (Boehm C. D., 1989). Метод полимеразной цепной реакции рассчитан на выявление ДНК возбудителя. Этим он выгодно отличается от других лабораторных методов, которые обеспечивают обнаружение косвенных признаков инфекции (обнаружение антител), имеют низкий уровень чувствительности (серологические методы) или дают замедленные результаты (для ряда инфекций - культуральный метод). Метод ПЦР имеет особенное преимущество при выявлении микроорганизмов, находящихся в латентной форме или присутствующих в столь малых количествах, что их не удается обнаружить традиционными методами, или тех микроорганизмов, которые плохо поддаются культивированию и требуют сложной питательной среды (Hartskeeri R.A., De Wit M.Y.L., Klatser P.R., 1989; Pao C.C., Lin S.S., Wu S. Y., Juang W.M., 1988), а также в случаях, когда бактериологический анализ оказывается безрезультатным.

Технология ПЦР при определении возбудителя туберкулеза является перспективной для диагностики туберкулеза. За последние 6-7 лет в зарубежной печати появилось большое количество работ, в которых показано, что метод ПЦР обеспечивает значительное повышение чувствительности определения микобактерий на порядок, превышающей метод посева на питательные среды (Manjunath N. , Shankar P., Rajan L., 1991; Sjobring U., Mecklenburg M., Andersen A.B., 1990) при высокой специфичности анализа, т.е. позволяет выявлять возбудителя при малых его количествах (Andersen A.В., Thybo S., Godfi-ey-Faussett P., Stoker N.G. 1993).

Исходный материал для ПЦР может быть получен из плевральной жидкости (Yilmaz G., Utku В., Kucukusta A.R. et al, 1995), мокроты (Nolte F.S., Metchock В., McGowan J.E. et. al., 1993), спинно-мозговой жидкости (Folgueira L. , Delgado R., Palengue E., Noriega A.R., 1994; Kaneco K., Onodera О., Miyatake. T. et al., 1990), периферической крови (Schluger N.W., Condos R., Lewis S. , Rom W.N., 1994), а также из биопсийного материала, в том числе из образцов гистологических срезов тканей (Popper Н.Н., Winter Е., Hofler G., 1994).

Чувствительность ПЦР определяли при исследовании очищенной хромосомной ДНК микобактерий. В разных работах чувствительность составляет 10 до 100 фг ДНК, что соответствовало от 10 до 100 бактериальных клеток (Andersen А. В., Thybo S., Godfi-ey-Faussett P., Stoker N.G., 1993).

Как правило, чувствительность ПЦР сравнивалась с культуральным исследованием, при этом она варьировала от 70% до 95% (Forbes B.A., Hicks K.E., 1993; Kaltwasser G., Garsia S., Salinas A.M., 1993; Kocagoz Т., Yilmaz E., Ozkara S. et., 1993). Эти результаты находятся в прямой зависимости от качества используемых питательных сред и количества сделанных посевов.

Прототипом являются:
Прибор ПАБ-1 (пробоотборник аэрозоля бактериологический) сконструирован Ленинградским филиалом Всесоюзного НИИ медицинского приборостроения. Прибор основан на принципе электропреципитации. ПАБ-1 состоит из 2-х переносных блоков: собственно прибора и укладки. Собственно прибор смонтирован в портативном ящике и состоит из узла для отбора проб воздуха (где вмонтирована металлическая нить для создания зоны отрицательного коронного разряда), микроманометра, микроамперметра и электромотора. В укладке имеется 40 металлических поддонов для питальных сред и 20 пробирок для транспортировки жидких питательных сред. В приборе ПАБ-1 частицы (бактерии) при просасывании проб воздуха заряжаются в зоне отрицательного коронного разряда, а затем попадают в электрическое поле и оседают на положительно заряженном электроде, изготовленном в виде сменного металлического поддона, который покрывается жидкостью или плотной питательной средой. С помощью прибора ПАБ-1 можно отбирать пробы воздуха со скоростью 150-250 литров в минуту.

Отличием нашего метода является то, что данный прибор использован для извлечения не неспецифической микрофлоры, а микобактерий туберкулеза в воздухе.

Вторым прототипом является метод определения микобактерий туберкулеза в воздухе, использующий культуральные методы (Чугунихина Н.В., 1973). Недостатком этого метода является большая длительность исследования (2,5-3 месяца) и низкий порог чувствительности (десятки тысяч микобактерий в исследуемом материале).

Третьим прототипом является метод ПЦР-диагностики микобактерий туберкулеза в биологических жидкостях (кровь, мокрота, эксудат и др.)
Наш способ заключается в том, что при помощи прибора, основанного на принципе электропреципитации в приборе, частицы (бактерии) при просасывании проб воздуха заряжаются в зоне отрицательного разряда, а затем попадают в электрическое поле и оседают на положительно заряженном электроде, изготовленном в виде сменного металлического поддона, который покрывается жидкой питательной средой Школьниковой, содержащей 0,1% p-p V фракции бычьего альбумина для выращивания микобактерий. Отличием является то, что после "подращивания" на среде Школьниковой в течение 2-х дней с последующей концентрацией микобактерий с помощью центрифугирования 12000-16000g в течение 15 мин, с последующим удалением супернатанта и ресуспендирования полученного осадка в 100 мкл воды, проводится не посев на питательные среды, как в прототипе, а стандартная ПЦР, состоящая из 3-х этапов: выделение ДНК микобактерий из пробы, амплификация, детекция результатов.

Эксперимент
Работа по отбору проб воздуха проводилась в МНПЦ БТ г. Москвы.

В палатах, где находятся больные туберкулезом легких с БК+, за 12 часов до начала исследования не проводилась генеральная и текущая уборка с применением дезинфекционных средств, не осуществлялось проветривание помещений и больные в период забора воздуха были в палате. Время начала забора с 10 часов утра.

Забор воздуха в операционном блоке проводился после плановой генеральной уборки с применением дезинфекционных средств и ультрафиолетового облучения.

Забор воздуха в курительной проводился также в присутствии больных, без нарушения распорядка отделения по уборке этих помещений. Нами были установлены параметры на приборе ПАБ-1 для забора воздуха, идентичные для всех испытуемых помещений: воздух прокачивался в течение 20 мин, на металлическую нить подавалось напряжение 40 мВ, за 1 мин прокачивалось 200 литров воздуха, т.е. в течение 20 мин - 4 м³ воздуха.

В сменные металлические поддоны наливалась синтетическая среда Школьниковой в количестве 15 мл. После выключения прибора сменный поддон вынимался и жидкость подвергалась специальной обработке для уничтожения контаминирующей микрофлоры путем обработки 2% гидроокисью натрия с ацетилцистеином (Мусоргер) в количестве, равном объему жидкости, извлеченной из прибора в течение 15 мин. После этого следовала нейтрализация образца в фосфатном буфере (pH 6,8) в 5-кратном объеме последнего. Затем проводилось центрифугирование 3000 g в течение 15-20 минут. После центрифугирования осадок переливался в специально приготовленные для этих целей пластмассовые пробирки с плотно закрывающейся крышкой со средой Школьниковой, содержащей 0,1% p-p V фракции бычьего альбумина. После чего пробирки помещались в термостат при t^o 37^oC, после чего проводилась индикация микобактерий методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющийся цикл синтеза (амплификации) специфической области ДНК-микобактерий туберкулеза в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера, олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени микобактерий туберкулеза.

Реакция состоит из трех основных этапов:
1. Выделение ДНК микобактерий из пробы.

2. Проведение ПЦР (амплификация).

3. Детекция результатов.

4. В пробирки с ПЦР-смесью-1 на поверхность застывшего воска раскапать по 10 мкл ПЦР-смеси-2. При этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1.

5. Сверху раскапать по 1 капле масла для ПЦР.

Проведение амплификации
В готовые пробирки под масло или непосредственно на поверхность масла внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из исследуемого материала.

Контрольные реакции амплификации:
Отрицательный контроль (К-) - вместо ДНК-пробы используется ДНК-буфер. Положительный контроль (К+) - ПКО (положительный контрольный образец ДНК), разведенный ДНК-буфером в 10 раз.

Перенести пробирки в программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по программе, указанной в табл. 2 (см. в конце описания).

1. Выделение ДНК микобактерий из исследуемого образца проводят гуанидиновым методом (по Boom)
Рабочие растворы
1. Раствор I - 6М гуанидин. Навеску гуанидина тиоционата, равную 21,3 г, растворяют в дистиллированной воде, добавляют 0,6 мл 0,5 М раствора ЭДТА и доводят объем до 30 мл. К раствору гуанидина тиоционата добавляют сухой дитиотреитол (ДТТ) до конечной концентрации 20 мМ.

2. Раствор II - 4М гуанидин. Навеску гуанидина тиоционата, равную 7,08 г, растворяют в воде и доводят объем раствора до 15 мл. В 4М раствор гуанидина также рекомендуется добавить ДТТ до конечной концентрации 20 мМ.

3. Раствор III - 10 мМ Трис HCl, pH 7,3, 3,5 мМ NaCl, 50% этанол. К 1 мл 1 мМ Трис HCl добавить 1 мл 5М NaCl, довести объем до 50 мл дистиллированной водой и добавить равный объем перегнанного этилового спирта.

4. Сорбент. Используют суспензию предварительно отмытого сорбента (диатомовая земля) с равным по весу количеством дистиллированной воды.

Подготовка проб
В качестве материала используют смыв с объектов внешней среды. После центрифугирования при 12000 - 16000g в течение 15 мин супернатант осторожно удаляют, а полученный осадок ресуспендируют в 100 мкл воды.

1. К 100 мкл смыва в пробирке 1,5 мл (типа Eppendorf) добавляют 300 мкл раствора I и 10 мкл сорбента. Пробы инкубируют в течение 10 мин при +65^oC дважды перемешивая на вортексе.

2. Пробы центрифугируют 30 сек на микроцентрифуге при 14000 об/мин, супернатант отсасывают.

3. К осадку добавляют 100 мкл раствора II и встряхивают его на вортексе. Сорбент осаждают центрифугированием в течении 30 сек. Супернатант отсасывают.

4. Процедуру отмывки повторяют еще 2 раза с использованием 1000 мкл раствора III.

5. Дополнительным центрифугированием с последующим отбрасыванием супернатанта убирают остатки раствора III. Пробы подсушивают 5 мин при температуре 65^oC, оставляя пробирки открытыми.

6. В пробирки с сорбентом добавляют 50 мкл ТЕ буфера, закрывают их, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 5 мин при +65^oC.

7. Пробы центрифугируют 30 сек при 14000 об/мин, водную фазу отбирают и используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

2. Проведение полимеразно-цепной реакции
Обнаружение ДНК микобактерий туберкулеза проводится методом полимеразной цепной реакции с использованием Набора "АмплиСенс-" МТБ-СОМ (МТБ-КОМ) НИИ эпидемиологии МЗ РФ согласно инструкции производителя. В состав набора входят реагенты, указанные в табл. 1(см. в конце описания).

Во всех наборах для амплификации семейства АмплиСенс обязательно применяется "горячий старт", который обеспечивается разделением нуклеотидов и Tag-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при 95^oC, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.

Подготовка реактивов.

1. Пробирку с воском прогреть в термостате при+ 95^oC до полного расплавления.

2. Раскапать в микропробирки для ПЦР по 5 мкл ПЦР-смеси-1.

3. Наслоить сверху по 12-15 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость.

Через 30 секунд после запуска программы (когда температура в ячейке амплификатора достигнет 80 - 95^oC и программа начнет выполнять паузу) поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора, убрать паузу и ждать окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице). Результаты ПЦР учитывают исследованием продуктов амплификации методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Длина амплифицированных специфических фрагментов Mycobacterium tuberculosis/bovis - 390 нуклеотидных пар.

3. Регистрация результатов
Заливают в аппарат для электрофореза 1xTAE буфер, приготовленный на дистиллированной воде.

К 2,0 г агарозы добавляют 2 мл 50хТАЕ буфера и 100 мл дистиллированной воды.

Расплавляют агарозу на электрической плитке или в СВЧ-печи. Добавляют к 100 мл расплавленной агарозы 5 мкл раствора бромистого этидия. Перемешивают.

Заливают агарозный гель согласно инструкции к аппарату для горизонтального электрофореза. Для заливки агарозного геля удобно использовать крышки для иммунологических планшетов подходящих размеров. Для получения карманов в агарозном геле используют гребенку. Охлаждают агарозу до температуры 50^o - 60^oС. После застывания агарозы осторожно вынимают гребенку из геля.

Добавляют в каждую амплификационную пробирку по 5 мкл буфера для нанесения образца.

Наносят в карманы геля по 10-15 мкл амплификата, предварительно смешанного с буфером для образца (6хТАЕ с 40% сахарозой и 0,25% бромфеноловым синим).

Подключают электрофоретическую камеру к источнику питания и задают напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/см. Проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин.

Вынимают гель из формы и переносят на стекло трансиллюминатора.

Фрагменты амплифицированной ДНК проявляются как светящиеся оранжево-красные полосы.

Анализ результатов.

Отрицательный контроль - полоса должна отсутствовать.

Положительный контроль - выявляется полоса.

Анализируемая проба - отсутствие полосы на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отрицательном ответе. Наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, подтверждает наличие ДНК микобактерий в пробе.

Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов набора. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтров.

Всего было сделано 30 исследований воздуха в 4-х видах помещений:
1. Местах постоянного нахождения бациллярных больных (больничные палаты).

2. Помещениях, где бациллярные больные бывают эпизодически (коридоры, курительные комнаты, столовая).

3. Помещения, где исключается пребывание бациллярных больных (аптека, административные помещения).

4. Помещения строгого дезинфекционного режима (операционная) после обработки ультрафиолетовой лампой и дезинфицирующими средствами
Были получены следующие результаты:
1. В местах постоянного нахождения бациллярных больных (больничные палаты) - 9 проб - 9 положительных результатов ПЦР (методом посева - обнаружить МБТ не удалось).

2. В помещениях, где бациллярные больные бывают эпизодически (коридоры, курительные комнаты, столовая) - 5 проб - 5 положительных результатов ПЦР (методом посева - обнаружить МБТ не удалось).

3. В помещения, где исключается пребывание бациллярных больных (аптека, административные помещения), 12 проб - 12 отрицательных результатов ПЦР (методом посева - обнаружить МБТ не удалось).

4. В помещения строгого дезинфекционного режима (операционная) после обработки ультрафиолетовой лампой и дезинфицирующими средствами, 4 пробы - 4 отрицательных результата (методом посева - обнаружить МБТ не удалось).

Метод позволяет определить микобактерии туберкулеза (МБТ) в воздухе в короткие сроки (3-5 дней) в отличие от выявления с использованием культурального метода (2,5-3 месяца). При этом метод высокочувствителен и позволяет выявить минимальные концентрации МБТ в воздухе, которые не определяются при помощи бактериоскопии и культуральном методе. Использование этого метода позволит решить вопрос санитарно-гигиенической оценки воздуха в помещениях, где находятся больные туберкулезом.

Изобретение относится к области медицины. Способ индикации микобактерий туберкулеза в воздушной среде характеризуется тем, что пробу воздуха пропускают через электрическое поле, при этом бактерии заряжаются в зоне отрицательного разряда и оседают на положительно заряженном электроде, изготовленном в виде сменного металлического поддона, покрытого жидкой питательной средой для выращивания микобактерий туберкулеза, последние культивируют в течение 2 дней, концентрируют, супернатант удаляют, а полученный осадок ресуспендируют, далее микобактерии туберкулеза определяют молекулярно-генетическим методом (ПЦР). Способ позволяет определить микобактерии туберкулеза (МБТ) в воздухе в короткие сроки (3-5 дней). При этом метод высоко чувствителен и позволяет выявить минимальные концентрации МБТ в воздухе, которые не определяются при помощи бактериоскопии и культуральной диагностики. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ индикации микобактерий туберкулеза в воздушной среде, характеризующийся тем, что пробу воздуха пропускают через электрическое поле, при этом бактерии заряжаются в зоне отрицательного разряда и оседают на положительно заряженном электроде, изготовленном в виде сменного металлического поддона, покрытого жидкой питательной средой для выращивания микобактерий туберкулеза, последние культивируют в течение 2 дней, концентрируют, супернатант удаляют, а полученный осадок ресуспендируют, далее микобактерии туберкулеза определяют молекулярно-генетическим методом (ПЦР). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микобактерии туберкулеза концентрируют центрифугированием 120 000 - 16 000 g в течение 15 мин. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что осадок ресуспендируют в 100 мкл воды.