СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для постановки диагноза при инфекционном заболевании.

Известен люминесцентный метод экспресс-диагностики инфекционных заболеваний в ЛАГ-фазе, основанный на искусственном воспроизведении микроокружения клеток крови, характерного для организма в состоянии стресса при клинически выраженном инфекционном процессе. Для выявления реакции иммунокомпетентных клеток крови используется окраска фиксированных мазков крови акридиновым оранжевым (АО) с последующим изучением их с помощью микроспектрофлюориметра (Горчаков А.М. Микроспектрофлюоресцентный анализ лимфоцитов при иммунном ответе. Автореф.канд.дисс. Пущино, 1986, 24 стр.).

Наиболее близким техническим решением, избранным в качестве прототипа, является способ определения метаболических сдвигов, стимулированных специфическими антигенами лимфоцитов крови по соотношению РНК и ДНК отдельно взятой клетки (Косякова Н.И. Клинико- иммунологические и метаболические показатели активации лимфоцитов при сальмонеллезе и дизентерии. Автореф.канд.дисс. М. 1983, 22 стр.).

Сущность способа состоит в определении соотношения РНК и ДНК лимфоцитов крови, выделенных на градиенте плотности фиккол-верографин, после 8- часовой инкубации их в стерильных условиях в термостате при температуре 37^oC с О-антигенами Sh. Sonnae, Sаlm. enteritidis с последующей окраской фиксированных в мазке лимфоцитов, АО и изучением их с помощью микроспектрофлюориметра.

Недостатком этого способа является большая трудоемкость, связанная с длительностью времени общего исследования (10-12 ч), выделением лимфоцитов крови на градиенте плотности фиколл- верографин, необходимостью работы в стерильных условиях в связи с длительностью инкубации со специфическими антигенами (8 ч), большими объемами венозной крови, необходимыми для работы (6-8 мл).

Кроме того, сомнительна объективность в оценке результата при работе с толстым мазком лимфоцитов крови, т.к. возможна флюоресценция межклеточного вещества мазка с распространением этого свечения на лимфоциты.

Все вышеизложенное ограничивает возможность широкого применения данного способа в практическом здравоохранении, а также затрудняет интерпретацию результатов.

Целью изобретения является снижение трудоемкости, повышение объективности в оценке результатов исследования, расширении спектра применяемых специфических антигенов.

Указанная цель достигается тем, что продолжительность времени, необходимого для определения соотношения РНК и ДНК лимфоцитов, полученных из плазмы цельной крови и проинкубированных со специфическими антигенами, уменьшается в 2 раза за счет сокращения времени инкубации лимфоцитов (4 ч), что дает возможность избежать работу в стерильных условиях; существенно повышается объективность в оценке результатов исследования, используя тонкий фиксированный мазок лимфоцитов при микроспектрофлюориметрии. Спектр применяемых специфических антигенов расширен до четырех.

Отличительной особенностью способа от прототипа является то обстоятельство, что, не выделяя лимфоциты на градиенте плотности, а получая необходимое их количество микрометодом из плазмы цельной крови, минуя работу в стерильных условиях, т.к. время инкубации лимфоцитов со специфическими антигенами составляет не более 4 ч, существенно уменьшается время общего исследования (5-6 ч) и достигается максимальная объективность в определении соотношения РНК и ДНК лимфоцитов крови, т.к. толщина мазка, окрашенного АО, практически не дает свечения фона, а расположение лимфоцитов в мазке позволяет производить точную микроспектрофлюориметрию каждой отдельно взятой клетки.

Способ осуществляется следующим образом. Гепаринизированная кровь, взятая из пальца в объеме 0,5 мл, отстаивается в термостате при температуре 37^oC в течение 20-30 мин. Полученная плазма в объеме 50 мкл соединяется с 50 мкл специфического антигена в концентрации 1 мг/мл и со 100 мкл питательной среды Хенкса, в центрифужной пробирке с ватной пробкой. Концентрация лимфоцитов в культивируемой среде достигает 600-900 тыс/мл. Полученная культура клеток помещается в термостат при температуре 37^oC на 4 ч. Через 4 ч содержимое центрифужной пробирки переносится на предметное стекло в виде тонкого мазка. Высушенный мазок фиксируется последовательно: 20 мин смесь этиловый спирт 96^o + ацетон (1:1), 15 мин этиловый спирт 96^o, 10 мин этиловый спирт 60^oC, 5 мин этиловый спирт 30^o. Далее мазок промывается дистиллированной водой и погружается в цитратно-фосфатный буфер с pH 4,2 на 4-5 мин. Обработанный таким образом мазок окрашивается АО в концентрации 1:25000 в течение 10 мин. Интенсивность флюоресценции измеряется на микрофлюориметре "Люман И-3" при помощи цифрового счетчика в условных единицах. В каждом мазке оценивалось соотношение интенсивности свечения в красной (640 нм-РНК) и в зеленой (530 нм-ДНК) полосах спектра у 25 лимфоцитов. Это соотношение обозначалось как коэффициент α. Измерение коэффициента a у большого количества лимфоцитов в одной пробе было сочтено нецелесообразным, т.к. увеличение количества обсчитанных лимфоцитов не влияло на достоверность конечного результата. В качестве контроля производилась инкубация лимфоцитов в питательной среде Хенкса в течение 4 ч без специфического антигена. Были использованы следующие специфические (бактериальные) антигены:
1. О-антиген Sh. Flexneri
2. О-антиген Sh. Sonnae
3. О-антиген Salm. tipliy
4. О-антиген Salm. enteritidis (Sigma)
Примером, подтверждающим специфичность применяемого способа, может служить обследование группы больных с брюшным тифом и острой дизентерией Флекснера, диагноз у которых был подтвержден бактериологически. Контролем метода, подтверждающим специфичность способа, явилось определение коэффициента a при инкубации лимфоцитов в течение 4 ч при температуре 37^oC без антигенов. Коэффициент a у здоровых лиц, определяемый без инкубации лимфоцитов, составил 0,12±0,02, что было принято за норму. Специфические (бактериальные) антигены, добавляемые в культуру лимфоцитов, перечислены выше.

У каждого больного было поставлено 6 проб:
I Исследование коэффициента a в культуре лимфоцитов без инкубации.

II, III, IV, V Исследование коэффициентов a после 4-часовой инкубации в присутствии бактериальных антигенов (соответственно Sh. Flexneri, Sh. Sonnae, Salm. enteritidis, Salm. tipliy), один из которых был для данной патологии специфическим.

VI исследование коэффициента a после инкубации в течение 4 ч без антигена.

Результаты исследования представлены в табл. 1, 2, 3.

Как видно из приведенных данных, выявлено значительное увеличение коэффициента a у больных брюшным тифом в присутствии О-антигена Salm. tipliy. В присутствии других бактериальных антигенов данная закономерность не наблюдалась. Аналогичная картина отмечена у больных острой дизентерией Флекснера. В группе здоровых доноров, лимфоциты которых были проинкубированы со всеми вышеперечисленными бактериальными антигенами, повышение коэффициента a практически не наблюдалось.

Приведенные примеры иллюстрируют диагностическое значение предлагаемого способа определения специфики инфекционного процесса, который позволяет с высокой степенью достоверности установить диагноз, обычно подтверждаемый бактериологически не более чем в 30% случаев. Таким образом, способ является естественным дополнением к традиционным методам постановки диагноза при остром инфекционном заболевании.

Использование предлагаемого способа обеспечит снижение трудоемкости и повышение точности и надежности в процессе постановки диагноза в короткие сроки (5-6 ч), что соответствующим образом отразится на лечебном процессе и сроках пребывания в стационаре. Простота, надежность и отсутствие необходимости в сложных и дорогостоящих приборах и реактивах позволяет широко внедрить предлагаемый способ в практическое здравоохранение.

Анализ аналогов в исследуемой области, т.е. в медицине и в смежных областях (биология, биохимия) позволяет сделать вывод об отсутствии в них признаков, сходных с существующими отличительными признаками в предлагаемом способе определения специфики инфекционного процесса, и признать заявляемое решение соответствующим критерию "существенные отличия".

Использование: в области медицины, а именно в клинической иммунологии, и может применяться для постановки диагноза при инфекционных заболеваниях. Сущность изобретения: проводят забор крови больного, выделяют из нее лимфоциты, инкубируют их в термостате при 37^oC со специфическими антигенами с последующей окраской фиксированных в мазке лимфоцитов, их микрофлюориметрическим исследованием и расчетом показателя соотношений их РНК и ДНК, по увеличению которого относительно нормы определяют ту или иную кишечную инфекцию. При этом выделение лимфоцитов осуществляют микрометодом из плазмы цельной крови, а инкубацию со специфическими агентами проводят в течение 4 ч и из полученного содержимого готовят тонкий мазок для окраски и микрофлюориметрического исследования. Способ прост в исполнении и позволяет повысить объективность в оценке результатов исследования. 3 табл.

Способ определения кишечных инфекций путем забора крови больного, выделения из нее лимфоцитов, их инкубации в термостате при 37^oС со специфическими антигенами с последующей окраской фиксированных в мазке лимфоцитов, их микрофлюориметрическим исследованием и расчетом показателя соотношений их РНК и ДНК, по увеличению которого относительно нормы определяют ту или иную кишечную инфекцию, отличающийся тем, что выделение лимфоцитов осуществляют микрометодом из плазмы цельной крови, а инкубацию со специфическими антигенами проводят в течение четырех часов и из полученного содержимого готовят тонкий мазок для окраски и микрофлюориметрического исследования.