Способ прогнозирования рецидивов увеита Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено . для прогнозирования характера течения эндогенных увеитов и ретиноваскулитов.

Цель изобретения - прогнозирование рецидивов увеита у больного до развития симптомов основного заболевания.

Способ осуществляется следующим образом.

Периферическую кровь (15-20 мл) из локтевой вены забирают в пробирку с разведенным 1:100 гепарином, наслаивают на градиент плотности фиколлверографин 1077 (9 объемов крови на 3 объема градиента), центрифугируют в течение 30 мии.. при 1000 об/мин. Мононуклеары собирают пастеровской пипеткой из интерфазы. Клетки отмывают средой 199 (5-7 мл) трехкратным центрифугированием по 20 мин при 1000 об/мин.

Выделенную таким способом культуру лимфоцитов разводят средой 199 для получения концентрации не более 1,5-2 х 106 клеток в 1 мл.

Предметные стекла заготавливаются следующим образом.

На предварительно обезжиренные и слегка подогретые на пламени газовые горелки накладывают кусочек парафильма М с вырезанными отверстиями-лунками диаметром от 3 до 5 мм и плотно прижимают к стеклу с целью полного приклеивания. Подогрев следует проводить осторожно, чтобы парафильм не расплавился, иначе лунка будет мелкой и содержимое ее может соединяться с содержимым соседней лунки, но и

1

и

О

2

не слабым, иначе содержимое лунки будет затекать под парафильм. Такие стекла могут храниться длительное время,

В день исследования в лунки наносят поли-1 -лизин (20-50 мкг/мл) и для контакта помещают на 1 ч в термостат при 37°С. Далее отмывают в среде 199 от избытка поли-Ышзина и в такие подготовленные лунки помещают культуру клеток в количестве 20-50 мкл в зависимости от диаметра лунки с последующей инкубацией в термостате в течение 1 ч. Далее в эти лунки вносят моноклональные антитела (МКАТ) и вновь инкубируют в течение 1 ч в термостате. Промывают от излишка МКАТ 5 раз по 1 мин в среде 199. Для окрашивания клеток наносят 20-50 мкл F (ав)2-фрагмента кроличьей люминесцирующей сыворотки против глобулинов мыши. Контакте красящим фрагментом проводят в течение 1 ч при 4°С в холодильнике/Затем промывают пятикратно в стаканах со средой 199 (по 30-50 мл среды) в течение 1 мин в каждом. После этого в лунку вносят 50%-ный глицерин, закрывают лунки покровным стеклом. Препарат готов к микроскопическому исследованию,

В качестве МКАТ служила асцетическая жидкость от мышей-носителей гибридомы, линии ВА В/С в разведении 1:100. В работе использованы МКАТ серии ИКО:ИКО-1 против la-антигенов и.ИКО-11 против LFA-Г-ан- тигена,

Р(аЬ)2-фра.гменты приготовляли из кроличьей антисыворотки против иммуноглобулинов б.елой мыши, меченых ФИТЦ, причем приготовляли их по стандартной методике, адсорбировали печеночным порошком и лимфоцитами человека и в реакции использовали в разведении 1:10.

Микроскопия проводится в фазово- контрастном и люминесцентном режимах с исследованием нескольких полей зрения попеременно; то в одном, то в другом режиме с подсчетом 200 клеток специфического типа иммунофлюоресценции при увеличении объектива х90-100, окуляра 2,5-10 под масляной иммерсией.

Согласно литературным данным, la-антигены участвуют в презентации антигена, клеточном взаимодействии, определяют генетическую рестрикцию и силу иммунной реакции. LFA-I-лимфоцитарный функционально ассоциированный аьтиген участвует в начальной распознающеадгезионной фазе реакции цито оксических Т-лимфо- цитов и играет роль адгезионного клея. Недостаточность .и отсутствие Га- и LFA-1- антигенов обуславливают дефект гуморального и клеточного иммунитета и приводят к иммунодефициту.

В контрольной группе доноров - практически здоровых людей (75 чел) экспрессия

la-антигена составила диапазон от 11 % до 35% в среднем 29±2,3%. Экспрессия антигена в контроле (20 чел) колебалась в пределах 6-15% в среднем 12,4±1,4%. Эти данные позволили расценивать выражен0 ность экспрессии от 10% и ниже для а- йот 5% и ниже для LFA-T-антигенов как проявление дефицита la- и LFA-L-положительных клеток.

Сопоставление выраженности экспрес5 сии la- и LFA-1-антигенов на мононуклеарах крови у больных увеитами в зависимости от характера течения увеита показало достоверно выраженную связь между дефицитом la- и LFA-1-положительных клеток и часто

0 рецидивирующим характером течения увеита (р 0,01; ,01)..

Реакцию бластрансформации лимфоцитов с неспецифическим митогеном проводят по общепринятой методике и

5 используют либо фитогемагглютинин фирм Difko или Wellkome или отечественный лим- фоцитарный митоген в дозе 0,05 мл на 3 мл культуральной смеси. После трехдневной инкубации в термостате при микроскопиро0 вании мазка, приготовленного из инкубированной культуры клеток, определяют число бластных клеток на 500 лимфоцитов и выражают в процентах. Мазки окрашивались водным раствором азурэозина следу5 ющего состава: эозин 20 мл; азур 26 мл; дистиллированной воды до 100 мл. Краска наносилась на мазок в объеме 3-4 мл на 10-15 мин. Затем мазки промывались под струей проточной воды. Краска наносилась

0 на мазок в объеме 3-4 мл на 10-15 мин. Затем мазки промывались под струей проточной воды. Краска готовилась ех- temporae. При наличии менее 55% бластов пролиферативный ответ лимфоцитов счи5 тается сниженным и расценивается как угнетение функциональной активности Т- лимфоцитов.

По нашим данным у 42,7% больных часто рецидивирующими увеитами отмечался

0 сниженный пролиферативный ответ лимфоцитов на неспецифический митоген.

Определение групповой принадлежности крбви больного по системе АВО проводится по стандартной методике определения эритроцитарных антигенов с 5 помощью коммерческих гемагглютиниру- гащих сывороток 4-х групп крови:(О, #,/3), U(A, $, III (В, a), iV(A,B, 0),

Пример 1. Б-ной Б., 23 года, амбулаторная карта № 7870/88.

Диагноз: генерализованный увеит ОИ (обоих глаз), неактивный. Длительность заболевания 2.5 года. Заболевание левого глаза (OS) возникло без видимой причины в феврале 1987 года, правый глаз (ОД) заболел через год, в феврале 1987 г. До августа 1988 г рецидивы увеита ОД отмечались 3 раза, левого глаза - 10 раз.

При первичном иммунологическом обследовании обнаружены; низкое содержание la и LFA-Г1 кл.еток (10 и 5% соответственно); сниженный ответ лимфоцитов на лимфоцитарный митоген (42%); группа крови А(И).

Полученные данные позволили предположить неблагоприятный прогноз.

Клиническое течение: возникновение рецидива увеита левого глаза через 6 мес в виде субретинальных геморрагии и отека сетчатки.

П р и м е р 2. Б-ной А., 36 лет, амбулаторная карта № 6153/88. Диагноз; ангиит ОД. Процесс первичный, длительность за- болевания 2 мес. Прибыл в институт для уточнения диагноза и лечения. При иммунологическом обследований установлены низкие уровни la- и LFA-I содержащих клеток (10 и 3% соответственно}., группа крови А (II), снижение функциональной активности лимфоцитов (40% бластных форм). Прогноз неблагоприятный по иммунологическим показателям.

Клиническое течение: рецидив гемоф- тальма ОД через 2 мес после окончания курса лечения..

Примерз. Б-ой С., 38 лет, амбулаторная карта № 12388/88. Диагноз: генерализованный уверит ОИ неактивный. Длительность заболевания левого глаза 25 лет, правого глаза 1 год. До мая 1988 года обострения на левом глазу отмечались 12 раз, на правом - 2 раза. В момент обследования установлены: группа крови А(П), низкий уровень IA+-и LFA-1 клеток (8 и 1 % соответственно), сниженный пролифе - ративный ответ лимфоцитов в РБТ на неспецифический митоген (45%).

Прогноз неблагоприятный по иммуно- логическим данным. Клиническое течение; рецидива правого глаза - свежие полиморфные преципитаты через 8 мес.

Предложенный способ прост. Все исследования проводятся одномоментно,

окончательный результат может быть получен в достаточно короткий временной промежуток (4 дн).

Предложенный способ прогнозирования тяжести течения увеита основан на последних достижениях фундаментальной иммунологии с применением новейших методов исследования, в частности моно- клональных антител, позволяющих определять качественные и количественные дефекты в иммунной системе на молекулярном уровне.

Использование предлагаемого способа на основании оценки функции иммуноком- петентных клеток, групповой принадлежности крови больного по системе АВО дает возможность прогнозирования рецидива увеита, определения групп больных повышенного риска рецидива, нуждающихся в диспансерном наблюдении, и возможность предупредить развитие тяжёлых исходов путем своевременного профилактического патогенически обоснованного курса лечения с применением иммуномодуляторов направленного действия и, как следствие, сокращение и уменьшение трудопотерь, увеличение продолжительности трудоспособного периода больного.

Предлагаемый способ позволяет прогнозировать развитие рецидивов увеита без клинического проявления основного соматического заболевания, а по прототипу возможно прогнозировать увеит только в i. случае развития у больного симптомов общего заболевания.

Формула из об р е т е н и я

Способ прогнозирования рецидивов увеита, включающий забор крови, инкубацию ее с митогеном и определение уровня бласттрансформации, отличаю щи и с я тем, что, с целью раннего прогнозирования до развития симптомов основного заболевания, дополнительно выявляют в крови лимфоциты, содержащие la и LFA-I антигены, устанавливают групповую принадлежность крови и при снижении уровня бласттрансформации по сравнению со здоровыми при количестве la, содержащих лимфоцитов ниже 10%, и количестве LFA-I содержащих лимфоцитов ниже 5%, у больного с группой крови А(Ц), прогнозируют рецидив увеита.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования развития увеитов у больных соматическими заболеваниями. Цель изобретения - прогнозирование увеитов у больного без симптомов основного заболевания. У больного берут кровь, определяют в ней уровень бласттрансформации лимфоцитов на неспецифический митоген, выявляют лимфоциты, содержащие la- и LFA-t-антигены, устанавливают групповую принадлежность крови и при снижении уровня бласттрансформации по сравнению со здоровыми, количестве la, содержащих лимфоцитов ниже 10%, количестве LFA-t, содержащих лимфоцитов ниже 5%, у больного с группой крови А(И) прогнозируют развитие увеита. Способ по сравнению с прототипом позволяет прогнозировать развитие увеита у больных до развития симптомов основного соматического заболевания. СО