СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА НУТРИЙ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/116 A61K39/09 A61K39/102 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно, к конструированию бактериальных вакцин для профилактики стрептококкоза и пастереллеза нутрий.

Стрептококкоз, пастереллез и сальмонеллез наносят огромный ущерб нутриеводческим хозяйствам, регистрируются как в отдельности так и в ассоциации: погибает молодняк после отсадки (до 80%), самки абортируют во второй половине беременности (до 80%). При этом большие затраты дополняются нарушением технологии выращивания животных, а также за счет проведения ветеринарно-санитарных мероприятий при ликвидации этих болезней.

Сальмонеллез, стрептококкоз и пастереллез нутрий являются факторными болезнями этих животных. В связи с этим специфическая профилактика выше названных болезней необходима.

С целью профилактики сальмонеллеза применяется поливалентная вакцина против сальмонеллеза и колибактериоза пушных зверей. Биопрепарат вводят подкожно в области внутренней поверхности бедра щенкам нутрий с 30-45 дневного возраста 3-кратно в дозах 0,5, 1.0 и 1,5 см³ с интервалом в 8-10 дней.

Через 14 дней после курса профилактики сальмонеллеза, нутрий вакцинирую против стрептококкоза. Вводят внутримышечно формолгидрооксильалюминиевую вакцину против стрептококкоза нутрий двухкратно в области бедра в дозах 1,0 и 1,5 см³ с интервалом 6 дней не зависимо от возраста.

Через 14 дней после последнего введения биопрепарата против стрептококкоза нутрий, вакцинируют против пастереллеза. С этой целью применяют сапонин-формолвакцину строго внутримышечно, с внутренней поверхности бедра, двукратно в дозах 0,5 см³ и 1,0 см³ с интервалом 10-12 дней.

Курс специфической профилактики особоопасных инфекционных болезней для нутрий при применении моновакцин длительный (более 3-х месяцев) и поэтому, несмотря на их высокую специфическую активность, падеж зверей отмечается от заболеваний, которые профилактируют в последнюю очередь.

Поэтому целью настоящего изобретения является конструирование иммуногенной ассоциированной вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий, чтобы существующую систему профилактических и оздоровительных мероприятий дополнить вакцинацией поголовья и добиться более эффективного эпизоотологического контроля стрептококкоза и пастереллеза нутрий.

Вакцину для профилактики стрептококкоза и пастереллеза нутрий готовили на основе штаммов стрептококков серогруппы C К-ДЕП и пастерелл N 6011, 2394, 1015, которые выделены нами от павших нутрий и депонированы в коллекции штаммов микроорганизмов Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Пример. Для изготовления второй серии вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий использовали отдельные ампулы с лиофилизированной культурой стрептококка серологической группы C штамма N "К"-ДЕП и пастерелл N 6011, 2394, 1015.

Содержимое ампул в отдельности высевали на МПА с 1% глюкозы в 3-4 чашки Петри по следующей методике: 0,1-0,2 мл суспензии культуры штамма вносят на поверхность агара и стеклянным стерильным шпателем распределяли ее по поверхности агара. Этим же шпателем проводят по поверхности агара последовательно еще трех чашек. Посевы на МПА инкубируют 48 часов при +37-37,5^oC. Одновременно делают высевы на МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро по две пробирки с каждой средой и инкубируют при тех же температурных режимах (на среде Сабуро при +20-24^oC) посевы на МППБ и на среде Сабуро 10 суток, а на МПБ 3 суток.

По истечении срока инкубации культуры в каждой питательной среде в отдельности проверяют на чистоту и характер роста визуальным просмотром, а также просмотром мазков, окрашенных по Граму. Рост культур на питательных средах должен быть характерным для возбудителя стрептококкоза и пастереллеза в отдельности.

Из культур, выросших на чашках Петри, отбирают 2-3 колонии стрептококков и пастерелл в отдельности и высевают в МПБ с добавлением 1% глюкозы и инкубируют при температуре +37-37,5^oC 18-22 часа. Проверяют чистоту роста просмотром мазков, окрашенных по Граму и высевают на МПБ с глюкозой (1%) во флаконы в соотношении 1:100.

Для приготовления маточной раскладки из флаконов или колб суточные бульонные культуры стрептококков и пастерелл в отдельности пересевают в подогретый до температуры +37-37,5^oC МПБ с глюкозой (1%) в 2,5-литровых баллонах из расчета 80-100 мл на 10 литров. Посевы культивируют при температуре +37-37,5^oC в течение 18-24 часов.

При удовлетворительных показателях чистоты, pH и оптической концентрации, производственную культуру в баллонах замораживают при температуре минус 20^oC в течение двух суток. Затем культуру оттаивают при комнатной температуре (+16-18^oC). При расслоении твердой и жидкой фазы в отношении 1:1 ледяную массу удаляют. К жидкому концентрату разрушенных бактерий вносят 0,3% коммерческого формалина. Инактивацию культур проводят в течение 48-ми часов при температуре +16-18^oC, подвергая взбалтыванию каждый баллон до 3-4 раз в течение 2 минут.

После инактивации отбирают пробы культур из каждого баллона в отдельности для контроля полноты инактивации и определения концентрации микробных клеток. Для этого проводят посевы в пробирки на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. Посевы не должны иметь роста в течение 10 дней наблюдения. Концентрацию микробных клеток определяют по оптическому стандарту мутности, и которая должна быть 3±0,1 млрд микробных клеток в 1 мл, а несвязанного формалина должно быть не более 0,095%
По истечении срока инактивации и получения требуемых результатов контроля чистоты (полноты инактивации) биомассы стрептококков и пастерелл сливали в 20 литровые бутыли в соотношении 1:1 и в общую бактериальную массу вносили стерильный адъювант 3% -ный раствор гидроокиси алюминия (ГОСТ 1828-81) из расчета 15% к объему культуры. Второй адъювант сапанин добавляли из расчета 100 мг на 1 литр. Адъюванты вносят при непрерывном помешивании культуры.

Примечание: 3% раствор гидроокиси алюминия на физиологическом растворе стерилизуют в автоклаве при температуре 120^oC в течение 30 минут.

Через трое суток после внесения адъюванта формируют серию вакцины, pH готовой вакцины должен быть в пределах 7,0-7,2.

Расфасовку вакцины производят по 20, 100, 200 мл в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивая герметичность упаковки содержимого флаконов.

Полученная вакцина имеет следующий состав (об.).

а) свободный антиген стрептококков и пастерелл, выращенных в течение 18-22 часов, в концентрации (5-6)•10⁹ микробных клеток/см³ 83,7
б) глюкоза 1,0
в) формалин 0,3
г) гидроокисьалюминия до 100
Для определения качества сапонин-формолгидроокисьалюминиевой вакцины государственный контролер делает выборку из разных мест серии в количестве 10 флаконов, из которых 5 используют для проведения испытаний, а 5 флаконов хранят в архиве государственного контролера в течение 18 месяцев.

Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонней примеси, хлопьев, плесени, неразбивающегося осадка, флаконы с вакциной тщательно встряхивают и просматривают визуально в проходящем свете. Одновременно флаконы проверяют на герметичность укупорки и правильность этикетирования.

Концентрацию водородных ионов определяют электрометрическим методом, используя потенциометр марки ЛПУ-01 или другой прибор того же класса точности. Для испытания используют 3 флакона с вакциной. Содержимое каждого флакона испытывают отдельно. Определение pH вакцины проводят по инструкции, приложенной к потенциометру. Вакцина должна иметь pH в пределах 7,0-7,2.

Для проведения испытания на стерильность используют 5 флаконов с вакциной. Посевы проводят из каждого флакона в две пробирки с МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. Посевы проводят в объеме 0,2-0,3 мл вакцины. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 дней, роста микрофлоры быть не должно.

Безвредность вакцины проверяют на морских свинках массой 300-350 г и на белых мышах 16-18 г. Три флакона с вакциной встряхивают и из каждого флакона с вакциной с соблюдением стерильности отбирают 20-30 мл препарата, переносят в стерильный флакон, общую пробу используют для определения безвредности и иммуногенности.

Для определения безвредности содержимое флакона тщательно встряхивают и вводят пяти морским свинкам подкожно в области спины в объеме 2 мл и 10-ти белым мышам подкожно в области спины в объеме 0,5 мл. Вакцина не должна вызывать заболевания и гибели морских свинок и белых мышей в течение 10-ти дневного срока наблюдения.

Для определения иммуногенной активности общую пробу вакцины во флаконе встряхивают и вводят 40-ти белым мышам массой 16-18 г подкожно с наружной стороны бедра в дозе 0,2 мл. Через 14 дней после иммунизации 40 вакцинированных и 40 контрольных белых мышей аналогичной массы заражают подкожно в области бедра подтитрованной десятикратной смертельной дозой вакцинных штаммов стрептококков и пастерелл в отдельности /по 20 мышей/. Срок наблюдения 10 дней.

Вакцину считают иммуногенной, если она предохраняет от заболевания и гибели не менее 18 иммунизированных мышей в каждой опытной группе, при заболевании всех и гибели не менее 38 белых мышей в контрольных группах в течение 10 дней.

Полученные нами две серии вакцин против стрептококкоза нутрий и известную вакцину против диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят мы испытали в производственных условиях (см. таблица N 1). Анализ полученных данных, представленных в таблице N 1, достоверно доказывает эффективность вакцины серии N 2, по сравнению с известной вакциной и вакциной серии N 1. Вакцины вводили внутримышечно в области бедра с внутренней стороны 1,0 и 1,5 см³ с интервалом 7-10 дней. Вакцина серии N 2 безвредна, не вызывает осложнений у вакцинированных нутрий, обладает высокой активностью и профилактирует развитие клинических признаков стрептококкоза и гибель животных от болезни до 98,4%

Использование: ветеринарная микробиология, биотехнология, вакцина, профилактика стрептококкоза и пастереллеза нутрий. Сущность изобретения: для изготовления вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий раздельно выращивают штаммы Str. Zeoepiolemicus ВГНКИ N К-ДЕП, P. multociola ВГНКИ N 6011, 2394, 1015. Выращенные культуры стрептококков и пастерелл объединяют в соотношении 1:1 и подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3 - 0,4%-ным раствором формалина. По истечении срока инактивации и получения требуемых результатов контроля чистоты роста в бактериальную массу вносят адьювант 3%-ный раствор гидроокиси алюминия из расчета 15% к объему культуры. Второй адъювант сапонин добавляют из расчета 100 мг на 1 л биомассы. Адъюванты вносят при непрерывном взбалтывании. Получаемая сапонин-формолгидроокисьалюминиевая вакцина обеспечивает формирование иммунитета через 3 - 5 дней после вакцинации, который сохраняется не менее 12 месяцев. Эпизоотологическая эффективность составляет 95% и более от всех вакцинированных животных. 1 табл.

Способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий, отличающийся тем, что раздельно выращивают в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммы Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП, Pasteurella multocida ВГНКИ N 6011, Pasteurella multocida ВГНКИ N 2394 и Posteurella multocida ВГНКИ N 1015 в течение 18 24 ч, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3 0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия и сапонин.