ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS ZOOEPIDEMICUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА НУТРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A61K39/09 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к получению ветеринарных биологических препаратов и представляет новый штамм "К" Streptococcus группы С, используемый для приготовления лечебной сыворотки, диагностикума стрептококкоза группы С и изготовления вакцины против стрептококкоза нутрий.

Высокая вирулентность и иммуногенность штамма К-ДЕП является одним из условий, обеспечивающих получение эффективной лечебной сыворотки при стрептококкозе нутрий, достоверного диагностикума при стрептококкозе сельскохозяйственных животных группы С, а также получение активной вакцины для профилактики стрептококкоза нутрий.

В настоящее время не известны аналогичные штаммы в нашей стране и за рубежом, использование которых привело бы к получению высокоиммуногенной вакцины, обеспечивающей надежную профилактику данного заболевания, а также эффективной лечебной сыворотки и достоверного диагностикума. В силу этого ветеринарные мероприятия по борьбе со стрептококкозом нутрий сводятся к применению антибиотиков, дающих незначительный эффект.

Сведения о заболеваемости нутрий стрептококкозом с клиническими и патологоморфологическими характеристиками в отечественной литературе отсутствуют, отсутствуют также данные о распространении вышеуказанного заболевания в нутриеводческих хозяйствах, о причиняемом им ущербе, не разработаны меры борьбы и профилактики, серологическая диагностика.

Имеется краткое сообщение А.В.Абовяна (журнал Звероводство и кролиководство, 1979, N 4, c.34) о выделении стрептококков от павших нутрий. Выделенные бактериальные агенты не идентифицированы серологически, в работе не указано о их патогенности для нутрий, с какими антибиотиками проверяли на активность, нет данных об иммуногенности. При этом морфлогические, биохимические и биологические свойства отличаются от вновь выделенного штамма стрептококка.

Целью изобретения является получение штамма К-ДЕП бета-гемолитического факультативного анаэроба серогруппы С, обладающего высокоактивными в иммуногенном и антигенном отношении свойствами, которые можно использовать для приготовления вакцины против стрептококкоза нутрий, серологического диагностикума и лечебной сыворотки при стрептококкозе нутрий.

Штамм стрептококков "Кощаковский" выделен из павших нутрий (с поражением органов дыхания) зверосовхоза "Кощаковский" 12 февраля 1981 г. Штамм "К" отнесен к серологической группе С и хранится в коллекции живых культур стрептококковой лаборатории ВГНКИ ветеринарных препаратов под номером К-ДЕП.

Штамм стрептококка "Кощаковский" характеризуется следующими признаками.

Растет на МПБ и МППБ факультативный неподвижный анаэроб. В первые часы после инфицирования культур растет в виде мелких снеговидных взвесей, через 18-24 ч образуется придонный белый (ватный) осадок в прозрачном бульоне, который при тщательном встряхивании полностью разбивается.

На МПА растет в виде мелких, возвышающихся до 1 мм, очень нежных серовато-прозрачных колоний с ровными краями. На агаре с кровью вокруг колоний образуется большая зона полного просветления β-гемолиз.

При окраске по Граму в поле зрения микроскопа отмечается наличие грамположительных кокков (0,6 -1 мк), располагающихся в виде коротких и длинных цепочек (суточная культура). При окраске по Цилю- Нильсону отмечены кокки синего цвета, без капсул. При посеве на среды Гисса проявляют следующие биохимические свойства: + глюкоза; + мальтоза; + лактоза; + сахароза; манит; + сорбит; дульцит; индол; рамноза; инулин; ксилоза; арабиноза; + галактоза; инозит; молоко; лакмусовое молоко; H₂S; желатина
+ положительная реакция
отрицательная реакция.

Штамм стрептококка "К" чувствителен к пенициллину, стрептомицину, эритромицину, мономицину, неомицину, тетрациклину, ампициллину.

При заражении белых мышей и морских свинок в дозе по 0,2 мл (2 млрд. в 1 мл) подкожно, односуточной культурой, через 18 24 ч наступает сепсис, DLM - 10^-7.

При заражении кроликов в дозе 0,5 мл подкожно, внутримышечно, интранозально штамм "К" -апатогенен. При внутрикожном заражении кроликов вокруг места укола образуется зона покраснения (в диаметре 4 7 см) через 18 24 ч, а на месте инъекции на 2 3 дн зона некроза, которая проходит через 6 7 дн.

Штамм относится к серологической группе С.

Штамм сохраняется в лиофилизированном виде при температуре 4 6^oC в течение года.

Пример 1. Для изготовления вакцины против стрептококкоза нутрий штамм Str. zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП выращивали в мясо-пептонном бульоне с 1%-ным раствором глюкозы при температуре 37 38^oC в течение 18 24 ч до концентрации не ниже 4•10⁹ м.к. в 1 мл. Выращенную культуру инактивировали 0,3%-ным формалином. По истечении срока инактивации и получения требуемых результатов контроля чистоты (полноты инактивации) и концентрации микробных клеток в бактериальную массу вносили адъювант 3%-ный раствор гидроокиси алюминия из расчета 10% к объему культуры.

Полученную вакцину вводят внутримышечно в области бедра. Вакцина не вызывает осложнений у вакцинированных нутрий, обладает высокой активностью и профилактирует развитие клинических признаков стрептококкоза и гибель животных от болезни.

Пример 2. Для изготовления диагностической сыворотки для диагностики стрептококкоза нутрий в реакции диффузной преципитации штамм Str. zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП выращивали в мясо-пептонном бульоне с 1%-ным раствором глюкозы при температуре 37 38^oC в течение 18 24 ч. Чистоту роста контролировали путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму. Чистую суточную культуру центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин, после чего надосадочную жидкость сливали, осадок трижды отмывали 10-и кратным объемом физиологического раствора и готовили взвесь, содержащую около 10¹² микробный клеток в 1 мл. Полученную взвесь прогревали в водяной бане при температуре 56 58^oC в течение 45 мин и после охлаждения центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин.

К осадку микробных клеток добавляли 0,25%-ный раствор пепсина (10 мл раствора пепсина на 10¹² м.к.). Микробную массу с раствором пепсина оставляли на 4 ч при температуре 37^oC и периодически встряхивали, после чего pH взвести доводили до 7,0 путем добавления 1N раствора NaOH и трижды отмывали 10-и кратным объемом физиологического раствора с pH 7,0. Из отмытой микробной массы готовили 2•10⁹ м.к./мл взвесь стрептококков в 0,85% NaCl. В качестве консерванта добавляли мертиолят.

Приготовленный антиген проверяли на чистоту путем посева на мясо-пептонный бульон и агар среды Китта-Тароцци и Сабуро.

Полученным антигеном проводили иммунизацию 6-и кроликов. Схема иммунизации состояла из двух циклов с интервалом 1 мес. В I и II циклах антиген кроликам вводили параллельно подкожно и внутривенно (вена уха) в течение 4 нед (4 дн подряд с трехдневным перерывом), увеличивая дозу от 0,25 до 0,5; 0,75; 1,0 мл и количество м.т. соответственно 500 млн; 1,0; 1,5 и 2 млрд.

Спустя 8 10 дн после окончания 1 цикла иммунизации у кроликов из ушной вены брали пробы крови, получали сыворотку и определяли активность в РДП. Затем на 10-й день после последнего введения антигена II цикла - обескровливали. Из взятой крови получали сыворотку, активность и специфичность которой определяли в реакции диффузионной преципитации и при этом титры в среднем составляли 1 1024 1 2048.

Иммуногенные свойства изучали на кроликах.

Пример 1. Штамм N К-ДЕП серогруппы С выращивали на МПБ с добавлением 1% глюкозы в течение 18 24 ч. К суточной культуре с содержанием 4 млрд. микробных клеток в 1 см³ добавляли 0,4% формалина и оставляли на 3-е сут, после чего добавляли 3% гидратокиси алюминия в количестве 15% к общему объему и перемешивали в течение 3 сут до полного просветления надосадочной жидкости. При постоянном перемешивании антиген расфасовывали с последующей проверкой на стерильность и безвредность.

Пример 2. Штамм N К-ДЕП серогруппы С выращивали на МПБ с добавлением 1% глюкозы в течение 18 24 ч. Проверенную на чистоту суточную культуру с содержанием 4 млрд. м.к. в 1 мл³ замораживали при -20^oC и оттаивали при комнатной температуре. Затем добавляли 0,4% формалина и оставляли для инактивации на 3-е суток, после чего добавляли 3% гидратокиси алюминия в количестве 15% к общему объему и перемешивали в течение суток. Сорбцию вели до полного просветления надосадочной жидкости. При постоянном перемешивании антиген расфасовывали с последующей проверкой на стерильность и безвредность.

Приготовленные антигены вводили в отдельности каждому кролику (в группе по 4 животных), внутримышечно по 2 мл с интервалом в 7 дн 4 раза. На седьмой день после последнего введения антигена у животных брали пробы крови и сыворотки исследовали в реакции диффузионной преципитации. В опытной группе кроликов N 1, которым вводили антиген, приготовленный по методике примера 1, титры в среднем были 1 64 1 128, а в опытной группе N 2, которым вводили антиген, приготовленный по методике примера 2 1 256 -1 512. В контрольной группе (4 кролика) при исследовании проб крови в РДП титры отсутствовали.

Лечебные свойства полученных сывороток исследовали на белых мышах, морских свинках и нутриях по 6 животных в опытных и контрольных группах. Гипериммунную сыворотку вводили внутримышечно нутриям по 1,5 мл, морским свинкам 0,5 мл, белым мышам 0,3 мл. На 5-й день всех животных опытных и контрольных групп заражали 10-и кратной смертельной дозой стрептококка группы С штамм К-ДЕП. На 1-5-й день животные контрольной групп погибли, а опытные - были предохранены от заражения.

Внедрение предлагаемого штамма "К" b -гемолитического стрептококка группы С дает возможность приготовить диагностикум для подтверждения диагноза на стрептококкоз в реакции диффузионной преципитации, получить эффективную гиперимунную сыворотку для лечения нутрий, больных стрептококкозом, а также приготовить иммуногенную вакцину и вести специфическую профилактику стрептококкоза нутрий.

Использование: ветеринарная микробиология, биотехнология, лечебная сыворотка, диагностикум, вакцина, стрептококкоз нутрий. Сущность изобретения: предложен штамм бактерий Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП. Штамм отнесен к серологической группе С, гемолитический факультативный анаэроб. Штамм обладает высокоактивными в иммуногенном и антигенном отношении свойствами, что позволяет использовать его для изготовления вакцины против стрептококкоза нутрий, серологического диагностикума и лечебной сыворотки.

Штамм бактерий Streptococcus Zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП, используемый для изготовления диагностических и профилактических биопрепаратов против стрептококкоза нутрий.