СПОСОБ ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ЖЕЛУДКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 G01N33/48 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно иммуноморфологической диагностике злокачественно измененных тканей, и может быть использовано для уточнения параметров морфо-функционального состояния эпителия желудка путем определения экспрессии трофобластического бета-1-глобулина (ТБГ) в отдельных нормальных и подвергшихся трансформации структурных и клеточных элементах слизистой оболочки, располагающихся вне очага рака. Детализация экспрессии ТБГ позволяет выделить в эпителии желудка вне очага рака "сигнальные точки", т.е. места, где ТБГ обнаруживается с высокой достоверностью, тогда как при различных доброкачественных заболеваниях подобные "сигнальные точки" отсутствуют. Эти "сигнальные точки" можно оценить согласно диагностическим параметрам по специфичности, точности, чувствительности.

Известно использование реакции на ТБГ (Skinner, Whitehead, 1982) в слизистой оболочке желудка в качестве отличительного критерия при оценке метаплазированного эпителия. Показано, что экспрессия ТБГ наблюдается в очагах кишечной метаплазии в слизистой оболочке вокруг очагов рака (реакция наблюдалась в 4 из 13 наблюдений), но подобная характеристика отсутствует в метаплазированном эпителии при атрофии слизистой оболочки желудка без наличия очага рака (реакция не найдена ни в одном из 17 наблюдений). При этом известно, что ТБГ в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта может быть найден в целом ряде (27%) доброкачественных опухолей (Sorensen, 1984), а также даже в отдельных клетках, относящихся к нормальному эпителию (Г.А.Франк, К. К.Пугачев, 1990).

Подобные ограничения оценка реакции только в кишечной метаплазии и присутствие ТБГ в элементах нормального эпителия и доброкачественных опухолях делало невозможным применение его в качестве универсального критерия (индикатора) при оценке опухолеассоциированных признаков.

Целью изобретения является повышение точности и чувствительности метода при сохранении высокой специфичности теста.

Поставленная цель достигается путем проведения иммуногистохимической реакции с использованием антител против ТБГ на срезах тканей с последующим раздельным учетом продукта реакции в элементах нормального эпителия - покровно-ямочном эпителии, перешейке, дне и теле желез, а также в очагах кишечной метаплазии и дисплазии. При этом в доброкачественных опухолях реакции не учитываются вне зависимости от того, сочеталась эта доброкачественная опухоль с раком или нет. В перешейке учитывается возможность детекции ТБГ при различных доброкачественных заболеваниях и норме, поэтому оценка ведется согласно законам статистики. В прочих элементах нормы (покровно-ямочном эпителии, дне и теле желез), а также метаплазии и дисплазии эпителия ТБГ обнаруживается только при наличии очага рака (100% специфичность, табл.1). Исходя из этих данных метод может быть оценен согласно тестовым критериям (табл.2).

Способ выполняется следующим образом.

1. Приготовление материала
Используется рутинный метод фиксации тканей в нейтральном парафине с последующим обезвоживанием и заливкой в парафин. Для проведения иммуногистологических исследований используются серийные срезы толщиной 5-7 мкм, полученные на микротоме МПС-2 с парафиновых блоков.

2. Подготовка срезов к исследованию
Для регидратации срезов их проводят через 3 порции о-ксилола, абсолютный этанол, 96^o этанол, 70^o этанол, 56^o этанол, забуференный физиологический раствор (ЗФР) по 3 мин в каждой порции жидкости. Блокирование эндогенной пероксидазы проводят путем нанесения на срез нескольких капель 3% перекиси водорода на 10 мин. Блокирование неспецифической сорбции иммуноглобулинов проводят путем нанесения на срез лошадиной сыворотки в разведении 1:20-1:10 на 30 мин.

3. Подготовка антител
Антитела к ТБГ, выделенные из моноспецифической кроличьей антисыворотки, применяют в концентрации от 4 до 8 мкг/мл. Для среза размером 10•10 мм хватает около 20 мкл жидкости. Инкубацию в течение 30 мин проводят во влажной камере. После инкубации с антителами срезу отмывают от несвязавшихся компонентов. После осушения срезов наносят вторичные иммуноглобулины, выпускаемые Институтом эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи. Конъюгат поставляется в лиофилизированном виде в ампулах. Содержимое ампулы разводят в ЗФР согласно объему, указанному на маркировке, вносят бычий сывороточный альбумин до концентрации 3-5% и равный объем глицерина (Серва, Германия). В таком виде конъюгат хранят при -20^oC до 1 года. Рабочие разведения (обычно 1:40) готовят на растворах, содержащих 3 5% человеческой плазмы; в противном случае конъюгат как правило дает обильное неспецифическое окрашивание. Конъюгат наносят на 30 мин на срез (объемы соответствуют объемам первичных иммуноглобулинов). Отмывку проводят идентично таковой при первичных антителах.

4. Проявление пероксидазной активности
Для этих целей используется 3,3'-диаминобензидина гидрохлорид ДАБ (Сигма, США). Субстрат готовят перед употреблением, растворяя ДАБ в ЗФР (500 мкг на 1 мл) с добавлением 0,03% перекиси водорода. Срезы инкубируют с субстратом в течение 5 мин. Для усиления окрашивания вносят в раствор субстрата 0,05 М имидазола. Реакцию останавливают погружением срезов в дистиллированную воду.

5. Докрашивание срезов и заключение в канадский бальзам
Срезы окрашивают гематоксилином и проводят по батарее, состоящей из спиртов возрастающей концентрации и трех порций ксилола.

6. Учет результатов
Проводится под микроскопом с раздельным выделением следующих элементов: элементы нормальной слизистой оболочки (покровно-ямочный эпителий, перешеек, дно и тело желез), элементы кишечной метаплазии, дисплазии.

Результаты сравнительного анализа групп пациентов с диагнозом рак желудка и доброкачественными заболеваниями представлены в табл. 3 6.

Пример 1. Пациент А изучен гастробиоптат, полученный при эндоскопическом исследовании. Позитивная реакция на ТБГ найдена в элементах кишечной метаплазии и дисплазии. При повторном взятии биоптата обнаружены раковые структуры.

Пример 2. Пациент Б изучен гастробиоптат, полученный при эндоскопическом исследовании. Реакция на ТБГ не обнаружена, что послужило дополнительным фактором для постановки диагноза: язва желудка без наличия малигнизации.

Предлагаемый способ применим как метод уточняющей диагностики на основе определения опухолеассоциированного антигена в тканях, используя иммуноморфологический анализ материала, полученного при оперативном и эндоскопическом вмешательстве. Применение способа путем учета реакции раздельно по гистологическим структурным элементам слизистой оболочки желудка позволило при исследовании 274 наблюдений пациентов с патологией желудка уточнить диагноз рака желудка в 49,5% при точности метода 73,8% и специфичности 97,3% (табл. 2,6). Следует напомнить, что способ, используемый в прототипе (Skinner, Whitehead, 1982), позволяет достичь лишь 30,8% чувствительности при 70% точности (табл. 1,2), что существенно ниже предлагаемого в данной заявке метода уточняющей диагностики.

Таким образом, предложенный метод имеет при высокой специфичности высокую чувствительность и точность, что позволяет использовать реакции на ТБГ, определяемые раздельно в элементах слизистой оболочки, как индикатор, указывающий на наличие очага малигнизации в желудке.

Литература
1. Skinner J.M. Whitehead R.

Tumor markers in carcinoma and in premalignant status of the stomach in humans. Eur. J. Cancer clin. Oncol. 1982, V.18, N 3, p.227-235.

2. Sorensen S.

Pregnancy-"specific" beta-1-glycoprotein (SP-1): purification, characterization, quantification and clinical application in malignancies. - Tumor Biol. 1984, V.5, N 6, p.275-302.

3. Франк Г.А. Пугачев К.К. Антигенные маркеры предрака и рака желудка. Архив патологии, 1990, т.52, вып.3, с.72-76.

Использование: в медицинской иммунологии, а именно иммуноморфологической диагностике злокачественно измененных тканей, и может быть использовано для уточнения параметров морфофункционального состояния эпителия желудка путем определения экспрессии трофобластического бета-1-глобулина (ТБГ) в отдельных нормальных и подвергшихся трансформации структурных и клеточных элементах слизистой оболочки, располагающихся вне очага рака. Сущность изобретения: проводят иммуногистохимическую реакцию с использованием антител против ТБГ на срезах тканей с последующим раздельным учетом продукта реакции в элементах нормального эпителия - покровно-ямочном эпителии, перешейке, дне и теле желез, а также в очагах кишечной метаплазии и дисплазии. При этом в доброкачественных опухолях реакции не учитываются вне зависимости от того, сочеталась эта опухоль с раком или нет. В перешейке учитывается возможность детекции ТБГ при различных доброкачественных заболеваниях и норме. В прочих элементах нормы (покровно-ямочный эпителий, дно и тело желез), а также метаплазии и дисплазии эпителия ТБГ обнаруживаются только при наличии очага рака. Исходя из этих данных метод может быть оценен согласно тестовым критериям, при этом чувствительность метода достигает 49,5%, точность 73,8%, специфичность 97,3%. 6 табл.

Способ иммуноморфологической диагностики рака желудка, включающий иммуногистохимическое определение трофобластического бета-1-глобулина в слизистой оболочке желудка, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности метода, выявление ассоциированных с раком признаков по наличию в клеточных элементах слизистой оболочки желудка трофобластического бета-1-глобулина проводят раздельно в элементах нормального покровно-ямочного эпителия, перешейка, дна и тела желез, а также в очагах кишечной метаплазии и дисплазии.