СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕТА-2-ГЛОБУЛИНА МЕКОНИЯ ПЛОДОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1998 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к иммунологии, а именно к иммунохимии нормальных и злокачественных тканей, и может быть применено для разработки иммунохимических тест-систем для определения бета-2-глобулина мекония плодов человека (бета-2-МА) при гистологической дифференциальной диагностике новообразований.

Известен способ выделения бета-2-глобулина из ткани рака толстой кишки (Fritsche R. K. et al. Identification of a new oncofetal antigen assosiated with several types of human carcinomas. Nature, vol. 258, р.734-737, 1975), заключающийся в приготовлении экстракта из ткани раковой опухоли толстой кишки путем гомогенизации ее с фосфатным буфером pH 7,4, с последующим отбором надосадка, гель-хроматографии его на Сефадексе G-200 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе при pH 8,0. Однако указанный прототип - антиген BOFA обнаруживается, кроме фетального кишечного эпителия, в значительном количестве различных нормальных фетальных и дефинитивных тканей, а также в разнообразных опухолях различного генеза. Существенным недостатком указанного метода является многоэтапность выделения антигена с потерей более чем 50% общей активности.

Цель изобретения достигается тем, что при получении антигена, используемого для иммунизации животных, употребляют экстракт мекония плодов человека в смеси со специфической антисывороткой к бета-2-МА, в концентрациях, при которых образуется суспензионный преципитат, который отмывают от дополнительных компонентов, после чего выделяют бета-2-МА диссоциацией иммунного комплекса в кислой среде pH 2,2 -2,0.

Источником выделения бета-2-МА служит экстракт мекония плодов человека, приготовляемый путем смешивания его с равным объемом фосфатного буфера pH 7,6 по методике, отличающейся от известного способа (авт. св. N 1503101).

Осуществление предложенного способа проводят по этапам. Первым этапом является подбор оптимальных условий формирования комплекса антиген-антитело с помощью стандартной тест-системы к бета-2-МА. Для выведения стандартной тест-системы проводят иммунодиффузионный анализ, титруя экстракт мекония вокруг моноспецифической антисыворотки к бета-2-МА. Стандартная тест-система формируется при отношении 1-2, т.е. антисыворотка к бета-2-МА взаимодействует наиболее оптимально с цельным экстрактом мекония. Тест-система используется в способе для отработки условий приготовления преципитата. Чувствительность стандартной тест-ситемы к бета-2-МА (минимальное количество антигена, способное "подогнуть" преципитационную линию в стандартной тест- системе) соответствует 10 мкг/мл.

Для полноты связывания антител с антигеном определяют соотношение этих реагентов следующим образом: в пластине для микротитрования с цилиндрическими ячейками ТЮ 7.036.00 ЭТ делают серийные кратные разведения экстракта мекония, после чего в каждую ячейку добавляют равный объем неразведенной антисыворотки к бета-2-МА. Образцы инкубируют при 37^oC в течение часа, после чего проводят иммунодиффузионный анализ полученных проб на полноту комплексообразования. Связывающая способность антисыворотки соответствует 20 - 40 мкг, т. е. 1 мл антисыворотки способен полностью связать 20 - 40 мкг бета-2-МА. Оптимальным соотношением антиген - антитело для образования преципитата является то, при котором в образце смеси не определяются свободные антитела и антиген, т.е. все ингредиенты вступили в реакцию. Зная концентрацию бета-2-МА в экстракте мекония, определенную полуколичественным титрованием вокруг стандартной тест-системы (чувствительность 10 мкг антигена в 1 мл), легко рассчитать связывающую способность антисыворотки, т.е. количество бета-2-МА, которое связывает 1 мл антисыворотки.

Получение целевого продукта, предназначенного для иммунизации.

В центрифужную пробирку наливают антисыворотку к бета-2-МА и добавляют осветленный центрифугированием экстракт мекония в соотношении, обеспечивающем полное связывание ингредиентов. Смесь инкубируют в течение часа при 37^oC и 24 ч при 4^oC. Полученный преципитат отделяют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 30 мин, после чего надосадок удаляют. Осадок суспензируют, переносят в чистую пробирку и оставляют на ночь при 4^oC для формирования преципитата. Подобную процедуру отмывки повторяют в течение 5 дней. Через 5 дней осадок суспензируют в 2 мл физраствора и выделяют бета-2-МА диссоциацией комплекса в кислой среде (пример 1).

Проверку иммуногенности препарата бета-2-МА осуществляют посредством иммунизации животных. Для получения антисыворотки кроликов иммунизируют раствором антигена в смеси с полным адъювантом Фрейнда внутрикожно. Через 30 дней инъекцию антигеном, приготовленным как описано выше, повторяют, вводя раствор однократно внутривенно кролику. Забор крови производят через неделю после второй инъекции. От одного кролика в среднем получают около 250 мл антисыворотки (пример 2).

Полученную антисыворотку тестируют иммунодиффузионным методом со стандартной тест-системой и в перекрестном иммуноэлектрофорезе и используют для уточняющей иммунологической диагностики опухолей желудочно-кишечного тракта.

Антисыворотка обладает высокой иммунохимической активностью и образует с экстрактом мекония одну преципитационную полосу в зоне бета-глобулинов. Таким образом, механическая примесь гетерогенных антител кролика не влияет на выработку антител к бета-2-МА. Аутоиммунизация животных не наблюдается в связи с толерантностью к видовым иммуноглобулинам.

Положительный эффект предложенного способа заключается в следующем:
способ позволяет получить препарат бета-2-МА практически без потерь, т. к. осаждение белка проводится при полном истощении под контролем иммунодиффузионного анализа;
простота способа, обусловленная только требованиями иммунодиффузионного анализа, исключает дорогостоящие многоэтапные способы фракционирования экстракта мекония с целью получения бета-2-МА, предназначенного для получения антисывороток;
способ рентабелен как в условиях лабораторного производства, так и при промышленном выпуске иммунодиагностических тест-систем, прибыль антисыворотки составляет не менее 90%;
на основе разработанного способа возможен замкнутый промышленный выпуск иммунодиагностических тест-систем, не требующий получения традиционных препаратов, очищенных белков, в частности бета-2-МА.

На чертеже представлена схема промышленного выпуска иммунодиагностической тест-системы на бета-2-МА.

Пример 1. В центрифужную пробирку наливают 8 мл антисыворотки (связывающая способность 20-40 мкг/мл) и добавляют 2 мл экстракта мекония плодов человека, содержащего 320 мкг/мл бета-2-МА. Смесь инкубируют в течение часа при 37^oC и 24 ч при 4^oC. Полученный преципитат отделяют центрифугированием при 3000 об. /мин в течение 30 мин. Надосадок удаляют, а осадок суспензируют в 1 мл физраствора, переносят в чистую пробирку, добавляют 10 мл физраствора и оставляют на ночь при 4^oC для формирования осадка преципитата. Процедуру отмывки повторяют в течение 5 дней. После последней отмывки осадок суспензируют в 2 мл физраствора и выделяют бета-2-МА диссоциацией комплекса, добавляя 20 мкл 1 н. HCl. В случае бета-2-МА интервал pH для выделения антигена 2,2 - 2,0, что зависит от следующего: при pH выше 2,2 не происходит полной диссоциации комплекса, в то же время при pH ниже 2,0 нарушаются иммунные свойства бета-2-МА. Полученный раствор бета-2-МА сохраняет нативные иммуногенные свойства. Потеря на всех этапах выделения не превышает 10%.

Результаты выделения бета-2-МА представлены в таблице.

Пример 2. Серию кроликов Шиншилла в количестве 5 штук, весом 3-4 кг иммунизируют 320 мкг препарата бета-2-МА в смеси с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда внутрикожно в 10-12 точек спины. Через 30 дней повторяют инъекцию антигеном в том же количестве, вводя раствор однократно внутривенно. Антисыворотку начинают забирать через неделю после второй инъекции и продолжают в течение месяца с частотой взятия крови 2 раза в неделю.

Предложенный способ получения бета-2-МА позволяет увеличить выход целевого продукта до 90%, создав замкнутый цикл выпуска иммунодиагностических тест-систем, пригодных для дополнительной диагностики в онкологии.

Использование: в иммунологии, иммунохимии нормальных и злокачественных тканей, может быть> применено для разработки промышленной технологии выпуска иммунохимических тест-систем для определения бета-2-МА в гистологических средах тканей при дифференциальной уточняющей диагностике первичных и метастатических новообразований. Сущность изобретения: при получении антигена, используемого для иммунизации животных, употребляют экстракт мекония плодов человека в смеси со специфической антисывороткой к бета-2-МА в концентрациях, при которых образуется суспензионный преципитат, который отмывают от дополнительных компонентов, после чего выделяют бета-2-МА диссоциацией иммунного комплекса в кислой среде рН 2,2-2,0. Способ позволяет повысить выход целевого продукта. 1 ил., 1 табл.

Способ получения бета-2-глобулина мекония плодов человека, включающий обработку биологического материала фосфатным буфером, центрифугирование с последующим отбором супернатанта с последующим выделением из него целевого продукта, отличающийся тем, что целевой продукт выделяют из супернатанта путем обработки его специфической антисывороткой к выделяемому веществу, отмывания полученного преципитата физиологическим раствором, отделения осадка центрифугированием и диссоциации его при pH 2,0 - 2,2.