Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунологического подтверждения диагнозов раков молочной железы и яичника.
Цель изобретения - получение штамма гибридомы мыши, продуцирующей моно- клональные антитела (монАТ), специфичные к антигену мембран жировых глобул (МЖГ) женского молока.
Штамм гибридомы ИКО-25 № ВСКК(П) 456 Д получают следующим способом.
Проводят соматическую гибридизацию клеток мышиной миеломы РЗХбЗАд 8.653 и клеток селезенки игмунизированной мыши линии BAL8/C. Иммунизацию мышей проводят высокоочищенным антигеном выделенным изоэлектрофокусированием мз солюбилизата мембранного матрикса МЖГ
1%-ным тритоном Х-100 в 0,01 М трис-НС|- буфере с 200 ИЕ/мл котринала, полученным после последовательной обработки МЖГ 0,01 М трис-НОбуфером с 200 ИЕ/мл котринала и тем же буфером с 1 М MgCl2 для удаления сывороточных белков молока и периферических макромолекул.
Выделение антигена осуществляют следующим образом. Женское молоко центрифугируют, отделяют МЖГ от молочной плазмы, МЖГ промывают буфером с 1 М MgCl2 для удаления сывороточных белков. Отмытые МЖГ инкубируют с 0,01 М трис- HCi-буфером, рН 7,2, содержащим 1%-ный тритон Х-100. С.месь центрифугируют при ЮБОООд 1 ч, надосадочную жидкость собирают и далее выделяют антиген при помощи изозлектрофокусирования в градиенте рН 3,5-10 и градиенте плотности сахарозы 5-50%. Фракции, содержащие специфиче- скую активность (рН 5,3-4,3). тестируемую методом двойной радиальной иммунодиф- фузии в агаре с применением выведенной стандартной тест-системы, объединяют, ди- ализуют против рабочего буфера с 1 %-ным тритоном Х-100 и используют для иммунизации мышей.
В результате проведенных этапов очистки удается получить фракцию, содержащую 2 мажорные белковые полосы в электрофорезе в SDS, соответствующие компоненту с мол. массой 85,200 Д (гликоп- ротеидной природы), составляющему 90% по интенсивности, и мол. массой 250.000 Д (гликолипопротеидной природы).
Для иммунизации используют 20-40 мкг полученной антигенной фракции на мышь. 1-ю иммунизацию проводят внутрибрю- шинным введением антигена в адъюванте Фрейндз. Последующие три иммунизации проводят внутривенным введением антигена.
На 7-й день после последней иммунизации мышь забивают и в стерильных условиях извлекают селезенку. Селезенку измельчают в гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли и трижды отмывают средой 199. Клетки селезенки и клетки миеломы РЗХбЗАд 8.653 сливают в соотношении 10:1 (9х107 клеток селезенки: 9x10 клеток миеломы). Смесь клеток отмывают 1 раз средой 199 и помещают в объеме 20 мл среды 199 во флакон объемом 100 мл. В этом флаконе клетки центрифугируют при 800 об/мин в тече- ниеЗ мин и инкубируют при 37°С в течение 20 мин. Среду осторожно насухо отсасывают и добавляют 3 мл 50%-ного полиэтилен- гликоля с мол. массой 1500. Через 75 с во флакон вносят 20 мл среды 199 Клетки 3
раза отмывают центрифугированием не встряхивая, и инкубируют 2 ч при 37°С в 20 мл среды роста (среда RPM1 1640, содержащая 15% телячьей эмбриональной сыворотки, 2мМ/мл глютамина, 0,1 мг/мл гентамици- на). Затем клетки разливают по 0,2 мл в лунки плоскодонного 96-луночного плато На следующий день среду роста заменяют на селективную среду (среда ростз, содержащая 0,1 мМ гипоксантина, 5,8 М аззсе- рина). Видимые колонии появляются на 20-й день в 9 лунках.
Отбор гибридом - продуцентов специфических антител, осуществляют при помощи иммуноферментного анализа: каждый раз используют две модификации:
1)МЖГ женского молока фиксируют на стекле 2,5%-ным глутаровым альдегидом и высушивают на воздухе, затем после 40-минутной промывки в 0,02 М Na-фосфатном буфере с 0,15 М NaCI наносят среду, содержащую монАТ, на 1 ч при 37°С, затем среду отмывают 2 раза по 10 мин в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) (0,01 М Na-фосфатный буфер, рН 7,6-7,8, с 0,15 М NaCI), наносят антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пе- роксидазой, на 1 ч при 37°С и после промывки 2 раза по 10 мин в ЗФР реакцию выявляют 0,08%-ным раствором 5-амино- салициловой кислоты. Контрольные пробы содержат ЗФР вместо культуральной среды. В качестве положительного контроля используют сыворотку крови мыши, а также поликлональные антитела кролика к МАМЖ-1.
2)В лунки полистироловых плашек наносят по 100 мкл раствора антигена МАМЖ1в 0,02 М Na-карбонатном буфере, рН 9,5, в присутствии 1 %-ного тритона Х-100 в концентрации 20 мкг/мл и инкубируют в течение 2 сут при 4°С; затем избыток антигена отмывают 0,02 М Na-фосфатным буфером, рН 7,6, с 0,15 М NaCI и наносят монАТ на
2ч при37°С, затем проводят отмывку 3 раза по 3 мин тем же буфером и наносят антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой, на 1 ч при 37°С после промывки 3 раза по 3 мин реакцию проявляют 0,08%-ным раствором 5-амино- салициловой кислоты. Гибридому, продуцирующую антитела необходимой специфич- йости, клонируют методом предельных разведений на фидере из клеток селезенки и тимуса мышей BALB/C.
Для приготовления фидера кусочки тимуса и селезенки разрушают в стеклянном гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли, Суспензию клеток разливают по 0,1 мл в лунки 96-луночного плато. Через 1-7 дн плато с клетками используют как фидер. При клонировании клетки из продуцирующей лунки снимают нежным пипетированием. Клетки разводят в среде роста до конечной конц«н- трации 50 клеток в 10 мл среды и разливают по 0,1 мл в лунки на фидер, при этом на 2 лунки приходится 1 клетка.
После первого клонирования колонии появляются в 14 из 72 лунок на 16-й день. В 7 лунках из 14 наблюдается положительная реакция на монАТ.
После второго клонирования процент позитивных клонов равен 100%.
В последующем отбор гибридом - про- дуцентов специфических монАТ, осуществляют иммунофлюоресцентным методом. Продуктивность гибридомы оценивают по титру монАТ в иммунофлюоресцентном методе. На депарафинированные толуолом и гидратированные этанолом понижающейся концентрации срезы наносят супернатант, полученный декантацией культуральной среды с гибридных клеток и инкубируют 16-18 ч при 4°С. Затем срезы отмывают в ЗФР 3 раза по 20 мин при перемешивании ЗФР на магнитной мешалке и инкубируют с раствором иммуноглобулинов кролика против глобулинов белой мыши, меченных флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) в разведении 1:32, в течение 2 ч при 37°С. Предварительно раствор иммуноглобулинов, меченных ФИТЦ, был обработан печеночным порошком. После инкубации с мечеными антителами срезы отмывают 3 раза по 20 мин в ЗФР при перемешивании на магнитной мешалке. Затем срезы заключают в смесь глицерин-ЗФР в соотношении 1:1 и анализируют на флюоресцентном микроскопе. В качестве отрицательного контроля исполь- зуют культуральную среду, не содержащую монАТ.
Полученный штамм обозначен ИКО-25. Штамм гибридных культивируемых клеток мыши хранится в лаборатории эксперимен- тальных моделей ВОНЦ АМН СССР, Москва, под номером 3-34.
Культуральные свойства.
Для выращивания штамма можно ис- пользовать стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон объемом 45 см засевают по 5 -105 клеток штамма в 10 мл среды. Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой, без подсчета клеток - 1:3 - 1:4, Штамм выращивают при 37°С в атмосфере 5% С02 на среде RPM 1 1640 или среде MEM в IX модифи- кации Дульбекко, содержащей 15% телячьей эмбриональной сыворотки, 1 мМ/мл глютамина, 0,1 мг/мл гентамицина.
Титр антител в культуральной жидкости определяют в иммунофлюоресцентном тесте. Титр антител в культуральной жидкости равен 500.
Для выращивания асциткой опухоли из штамма гибридных клеток пригодны мыши самки BALB/C. Интактным мышам за 1-7 дн до прививки опухоли вводят внугрибрю- . шинно по 0,5 мл 3%-ного пептона на вазелиновом мзсле. Клетки гибридомы инъецируют внутрибрюшинно по 10 клеток на 1 мышь в 5 мл среды. Через 7-10 дн. у мышей возникают зсцитные опухоли. Культуру клеток гибридом поддерживают серийными пассажами асцитной опухоли. Титр антител в асцитической жидкости 10.000.000- 1.000.000.
Кармологическая характеристика. Модальное число хромосом 82. Маркерных хромосом не выявлено. Продуктивность.
Стабильность продуцирования антител сохраняется в течение 25 пассажей in vitro и 15 пассажей in vivo. Титр антител в культуральной жидкости на протяжении 25 пассажей составляет 500-100; в асцитической жидкости титр антител на протяжении 15 пассажей 10.000..000.000. Контаминация.
Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном культивировании и посевах на питательные среды. Заражение микэплазмой не выявлено. Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде RPM1 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки. К суспензии клеток добавляют диметилсульфохсид до конечной концентрации 10%. Количество клеток на 1- ампулу объемом 1 мп составляет 5-10х106. Замораживание проводят при -70°С в течение 2 ч, затем ампулы с клетками помещают в жидкий азот. Размораживание клеток проводят при 40°С в течение 70 с. Жизнеспособность клеток после размораживания пс включении трипанового синего составляет 75-80%.
Характеристика целевого продукта. Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирует МКА igG1-класса. Класс иммуноглобулинов определяют по методу Оухтерлони в реакции преципитации. С этой целью используют моноспецифические сыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши. Культуральную жидкость гибридомы концентрируют в 10 раз раствором сульфата аммония, диализу- ют и помещают в центральную лунку 1%- ный агар. В периферические лунки вносят моноспецифические сыворотки. Через 1 сут
образуется четкая полоса преципитации с сывороткой против иммуноглобулинов igGI- класса.
Специфичность полученных монАТ ИКО-25 изучают непрямым иммунофлюо- ресцентным методом на депарафинизиро- ванных срезах.
ИКО-25 в норме реагируют преимущественно с эпителием молочной жепезы; более слабыми реакциями этот антиген выявляет- ся в подчелюстной и околоушной слюнных железах, бронхах, фундальных железах желудка, а также потовых железах взрослого человека; на грани выявления наблюдается реакция с клетками яичника.
При злокачественных заболеваниях происходит перераспределение специфичности антигена. Он интенсивно экспресси- руется в 100% случаев в опухолевых клетках карцином молочной железы и яичника, s также в метастазах; существенно менее интенсивно антиген выражен в опухолях головы и шеи (20% случаев), легкого (20% случаев), желудка (30%). Полученные AT не реагируют с клетками рака других локализа- цмй, а также с опухолями неэпителиального происхождения.
Поскольку ИКО-25 интенсивно реагируют с первичными и метастатическими опухолевыми клетками рака молочной железы и яичника, данные антитела перспективны для разработки метода уточнения диагноза в иммуноморфологическом и иммуноцито- химическс. методах, а также при иммуно- детекции рака молочной железы и яичника.
П ример 1. Больной А. Удалена опухоль желудка. При плановом гистологическом обследовании установлена лимфосаркома желудка. Непрямым иммунифлюоресцент- ным методом с применением монАТ ИКО- 25 реакции на получено.
П р и м е р 2. Больная Б. Удален яичник, пораженный опухолью. При плановом гистологическом обследовании установлена серозная сосочковая аденокарцинома яичника. Непрямым иммунофлюоресцентным методом с применением ИКО-25 получена интенсивнейшая реакция с опухолевыми клетками.
П р и м е р 3. Больная В, Удалена опухоль молочной железы и лимфатические узлы. При плановом гистологическом обследовании установлен анугрипротоковый рак с метастазами в подмышечные лимфатические узлы. Непрямым иммунофлюоресцент- ным методом с применением ИКО-25 получена интенсивная реакция с опухолевыми клетками как в первичном, так и в метастатических очагах.
Полученные монАТ ИКО-25 могут быть использованы для уточнения диагноза в им-, муноморфологическом и иммунохимиче- ском методах.
Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Li № ВСКК(П) 456Д - продуцент моноклонального антитела к антигену мембран жировых глобул женского молока.
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в лабораторной иммуногистохимической диагностике ряда опухолей, экспрессирующих антиген мембран жировых глобул женского молока (АМЖГМ). Цель изобретения - получение штамма гибридомы мыши, продуцирующей моноклональные антитела (мо- нАТ), специфичные к АМЖГМ, Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗХ63 Ад 8.653 с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных очищенным АМЖГМ. МонАТ отбирают. МонАТ относятся к классу lgG1. В иммуногистохи- мическом методе монАТ ИКО-25 реагирует из нормальных тканей преимущественно с эпителием молочной железы, более слабыми реакциями этот антиген выявляется в подчелюстной и околоушной слюнных железах, бронхах, фундальных железах желудка, а также в потовых железах взрослого человека, на грани выявпения наблюдается реакция с клетками яичника. Пр ч злокаче- ственных заболеваниях происходит перераспределение интенсивности экспрессии АМЖГМ. Он инте:-.сивно экс дрессируется в 100% случаев в опухолевых клетках карци- 3 ном молочной железы и яичника, а также в метастазах. Кроме того, данный антиген определяется на клетках аденокарцином легкого, матки, желудка, толстой кишки, почек I мочевого пузыря. Штамм депонирован под №ВСКК/П/456Д ЕМССЧ
| Taylor I., et | |||
| al Monoclonal antibodies to epithelium specific components of the human millifat globule membrane | |||
| - Int I | |||
| Cancer | |||
| Приспособление для изготовления в грунте бетонных свай с употреблением обсадных труб | 1915 |
|
SU1981A1 |
