Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к глиальному фибриллярному кислому белку человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики опухолей централь-ной и периферической нервной системы человека.

Известны коммерческие моноклональные антитела (МКА) и ГФКБ производства фирмы Labsystems.

Недостатком известных МКА можно считать реакцию с эндотелием сосудов как проявление неспецифического взаимодействия и неравномерное окрашивание гли- альных клеток мозга и клеток глиом при работе на серийных срезах.

Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток мыши линии BALB/c, продуцирующих МКА повышенной специфичности по отношению к ГФКБ человека, которые могут быть использованы для иммуноморфологической диагностики опухолей центральной и периферической нервной системы глиаль- ного происхождения на криостатных срезах.

Штамм получают следующим образом.

Иммунизация. Для иммунизации отбирают группу из 6-8 здоровых мышей линии BALB/c и каждую мышь метят индивидуально. В качестве антигена используют очищенный ГФКБ (10 мкг/мл), разлитый алик- вотами по 50 мкл и хранившийся при (-20)°С. Все иммунизации проводят с интервалом в 13 дней. Через 10 дней после 2-ой иммунизации отбирают кровь из ретроор- битального синуса мыши с помощью сили- конированного капилляра. Полученную сыворотку исследуют на присутствие специфических антител иммуноферментным методом. На 13-й день после последней иммунизации мышей, в сыворотках которых обнаруживается наибольший титр антител к ГФКБ, готовят к гибридизации.

Гибридизация. Клетки селезенки иммунных мышей, полученные на 13-й день после завершающего введения антигена, сливают с клетками мышиной миеломы РЗ- Х63, Ад 8.653 с помощью 50%-ного полиэти- ленгликоля мол. мае.4000. Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы 5:1. После гибридизации клетки высевают в 24-лу- ночные панели (по 5х 105 клеток на каждую лунку), в которые предварительно высевают перитонеальные макрофаги мыши (по 5 х

10 клеток на лунку). Селекцию гибридом проводят в полной среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% оленьей сыворотки, 200 мМ L-глутамина, 5 х М 2-меркаптоэтанола, М гипоксантина. 4 х М аминоптери- на и 1,6 х М тимидина.

Скрининг гибридом, определение содержания МКА в культуральной жидкости гибридом методом иммуноферментного анализа (ИФА) и выявление ГФКБ на кри- остатных срезах тканей человека.

Для проведения ИФА в 96-луночных панелях для микротитрования из поливинил- хлорида (ПВХ) адсорбировали раствор ГФКБ в карбонатно-бикарбонатном буфере, 0,05 М, рН 9,6 (по 50 мкл на лунку) и инкубировали в течение ночи при 4°С. По истечении времени инкубирования лунки блокировали 0,5%-ным раствором желатины в ЗФР при 37°С 40 мин с последующим отмыванием раствором ЗФР/0,05% твин- 20. Культуральные жидкости гибридом вносили в лунки панелей, покрытых ГФКБ (каждое разведение в 2 лунки). В качестве положительного контроля использовали мышиную антисыворотку (разведение 1 :

110000), а в качестве отрицательного контроля - супернатант миеломы РЗ-Х63 Ад 8653. После инкубации 1 ч при 37°С пластины трижды отмывали ЗФР/твин-20 и добавляли высокоспецифичные антитела кролика к иммуноглобулинам мыши, коньюгирован- ные с пероксидазой хрена, и инкубировали пластины еще 40 мин при 37°С. После 3кратного отмывания пластин ЗФР/твин-20 в лунки добавляли 0,04%-ный раствор 0-фе- нилендиамина в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,0 с добавлением 0,012% перекиси водорода. После развития окраски реакцию останавливали раствором 2 н. серной кислоты. Спектрофотометрическое определение проводили при 492 нм.

Для проведения иммуноморфологической реакции готовят криостатные срезы ткани головного мозга человека (мост, мозжечок, кора и белое вещество больших полушарий), взятого при аутопсии через 6 ч после смерти больного от острого кровотечения, а также срезы молочной железы, кожи и желудка (используют материал, удаленный хирургическим путем). Кусочки тканей замораживали в жидком азоте. Криостатные срезы толщиной 5-6 мкм высушивали 3 мин на воздухе, либо фиксировали в 4%-ном забуференном растворе формалина, рН 7,3, Культуральные среду из ИФА-по- ложительных лунок наносили на тканевые срезы и инкубировали 2 ч при комнатной

температуре или при (-4)°С 16ч; затем срезы промывали (по 5 мин) в 3 сменах забуферен- ного физиологического раствора, рН 7,3, а затем инкубировали с антисывороткой к иммуноглобулинам мыши, меченным ФИТЦ

или пероксидазой. Результаты реакции учитывали в люминесцентном или световом микроскопе в зависимости от природы используемой метки. Для клонирования отбирали гибридомы, которые продуцируют

МКА, взаимодействующие с глиальными клетками в виде четкого фибриллярного свечения и не дающие реакций с другими кле- точно-тканевыми структурами.

Клонирование отобранных гибридом.

Культуры гибридом, в супернатантах которых обнаруживаются антитела к ГФКБ, не дающие перекрестных реакций с другими тканевыми антигенами человека, клонировали методом предельных разведений из

расчета 0,3 клетки на лунку в среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 200 мМ глутамина, 5 х М 2-меркаптоэтанола в присутствии гипоксантина (10 М) и тимидина (1,5 х М). В результате клонирования позитивных первичных гибридом культуры сохранили способность стабильно продуцировать антитела заданной специфичности.

Изотипспецифический анализ надосадочных жидкостей клонированных гибридом показал, что все 20 полученных гибридом продуцируют IgGI.

Получение МКА in vivo. Для получения асцита мыши линии BALB/c (самки 12 14-недельного возраста) были примированы

пристанем по 0,5 мл внутрибрюшинно за 10 дней до прививки гибридных клеток. Клетки гибридом, отмытые средой RPMI 1640, вводили внутрибрюшинно по 2 х 10 клеток на мышь. Время образования асцита 14 - 20 дней; МКА в асцитной жидкости 2-10 мг/мл.

Полученный штамм гибридных культивируемых клеток хранится в Специализиро- ванной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК (II) 421Д и характеризуется следующими признаками.

Культура л ыные свойства. Клетки культивируют в монослое в концентрации 5 х 10 - 10 кл/мл, время субкультивирования около 48 ч. Среда для культивирования RPM1 1640 содержит 10% ЭТО и 5 х М 2-мер- каптоэтанола. Число пассажей к моменту депонирования 25;

Характеристика моноклональных антител. МКА относятся к ig 61 н. Они высокоспецифичны по отношению к кислому глиальному фибриллярному белку человека.

Для оценки специфичности МКА используют непрямой вариант иммуноморфо- логического метода с исследованием нормальных (кожа, молочная железа, щитовидная железа, матка, яичник, печень, надпочечник, легкое, желудок, головной мозг) и опухолевых тканей, различного гистогенеза и локализации (рак молочной железы, яичников, эндометрия, желудка и легкого, синовиальная саркома, рабдомиосаркома, эпителиоидная саркома, нейрофиброма, фибриллярная астроцитома.глиобластома, аденома гипофиза, менингиома).

Продуктивность штамма. Концентрация МКА в культуральной жидкости 70 мкг/мл, а в асцитной 5-7 мг/мл. Стабильность продукции МКА сохраняется на протяжении 25 пассажей in vitro и 5 пассажей in vivo.

Криоконсервирование. Криоконсерви- рование гибридомы проводят в ЭТС, содержащей 15% ДМСО. Первые 3 сут ампулы с клетками хранят при (-70)°С. затем переносят в жидкий азот. Жизнеспособность гибридом оценивают путем подсчета клеток при окрашивании 0,5%-ным раствором три- панового синего. Жизнеспособность около 80%.

Моноклональные антитела выделяют из

асцитной жидкости с помощью сульфата аммония и последующей хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Гомогенность выделенных МКА проверяют путем электрофореза в

полиакриламидном геле в присутствии до- децилсульфата натрия.

П р и м е р 1. Кусочки ткани головного мозга, полученные через 6 ч после смерти больного от острого кровотечения, и кусочки опухоли головного мозга (фибриллярная астроцитома, глиобластома), а также нейро- фибромы и хемодектомы, полученные при операции, замораживают в жидком азоте. Срезы толщиной 5 мкм готовят на криостате, фиксируют 3 мин в 4%-ном формалине на забуференном фосфатным буфером физиологическом растворе, рН 7,3. отмывают в 3 сменах ЗФР по 20 мин каждая. На срезы наносят МКА к ГФКБ, инкубируют 1 ч, затем

срезы отмывают в ЗФР и наносят антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные пе- роксидазой. Инкубируют 1 ч, затем срезы отмывают в ЗФР и добавляют субстрат ди- аминобензидин (ДАВ) совместно с перекисью водорода на 15 мин. Контроль реакции - 1-ая инкубация с культуральной средой вместо МКА. Препараты исследуют в световом микроскопе. Положительная реакция развивается вастроглии и ее отростках.

Эндотелий сосудов и межклеточный мат- рикс с МКА не взаимодействует. Результаты исследований представлены в табл.1 и 2. Данные табл.1 и 2 свидетельствуют о том, что полученные МКА специфически взаимодействуют с ГФКБ человека, не реагируя с антигенами нейронов и эндотелием сосудов головного мозга.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus BCKK (II) 421Д. используемый для получения моноклональных антител к глиальному фибриллярному кислому белку человека.

Та блица 1

Область применения: иммуноморфоло- гическая диагностика опухолей центральной и периферической нервной системы человека. Сущность изобретения: получение МКА, обладающих повышенной специфичностью к ГФКБ. Штамм получают в результате гибридизации спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы РЗ- Х63. Ад8.653. Среда для культивирования: RPM1 1640, содержащая 10% ЭТС и 5 меркаптоэтанола. Клетки культивируют в монослое (5 10 - 5 10 кл/мл), время субкультивирования 48 ч. Штамм стабильно продуцирует МКА в течение 25 пассажей in vitro и 5 пассажей in vivo. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 70 мкг/мл, в асцитной 5-7 мг/мл. МКА специфически взаимодействуют с ГФКБ человека, не реагируя с антигенами нейронов и эндотелием сосудов головного мозга. ГФКБ - глиаль- ный фибриллярный кислый белок человека, МКА - моноклональные антитела, ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка. 2 табл. со с

Специфичность МКАк глиальному фибриллярному кислому белку человека, определенных методом непрямой иммуноморфологии на криостатных срезах различных органов и тканей

человека

Органы и ткани человека

Мозг: астроглия нейроны сосуды

Щитовидная железа Поджелудочная железа Печень

Слюнные железы Легкое Почки Яичник

Матка : миометрий эндометрий Желудок Надпочечники Селезенка Кожа : эпидермис

потовые и сальн Молочная железа Поперечно-полосатые м

Таблица2

Специфичность МКА к глиальному фибриллярному кислому белку, определенных методом непрямой иммуноморфологии на криостатных срезах опухолей человека различного гистогинеза

Опухоли

Опухоли центральной нервной системы ( головного мозга ):

глиома глиобластома медуллобластома менингиома аденома гипофиза

пухоли периферической нервной системы (опухоли мягких тканей нейроэктодермального генеза): нейрофиброма нейробластома хемодектома

Опухоли мягких тканей другого гистогенеза : синовиальная саркома меланома кожи меланома глаза круглоклеточная саркома рабдоисаркома

Взаимодействие МКА

Взаимодействие МКА

+ + +

+ + +

Примечание: + - положительная реакция - отсутствие реакции

Продолжение табл. 2