СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИИ-СИМБИОНТА BACILLUS PULVIFACIENS ИЛИ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТА ПРОБИОТИКА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способам получения пробиотиков, например, эндобактерина и споробактерина. Последние представляют собой живую культуру микробов-антагонистов Bac. pulifaciers штамм 535 (ВКПМ В-4348) и Bac. Subtilis штамм 534 (ВКМП В-1666Д). Изобретение служит охране окружающей среды.

Известен аналог, согласно которому для выращивания штаммов Bac. pulvifaciens ВКПИ 4348 или Bac. subtilis ВКПМ В-1666Д, используют мясо-пептонный агар (МПА) и хлорид натрия, привносимый взвесью культуры для ее культивирования, а также содержанием соли в мясопептонном бульоне, из которого готовят МПА, (Заявка РСТ 89/09607, кл. A 61 K 35/74, 89.).

Недостатком данной среды является ограничение ресурсов некоторых компонентов, которые готовят из пищевых продуктов.

Цель изобретения привлечение дополнительных ресурсов при промышленной наработке пробиотиков для нужд животноводства и ветеринарии.

Цель достигается тем, что среда в качестве питательной основы содержит подсырную сыворотку и дополнительно натрий углекислый, калий фосфорнокислый двузамещенный, аммоний молибденовокислый, железо сернокислое закисное при следующем соотношении компонентов, г/л:
Натрий хлорид 0,4 0,6
Натрий углекислый 0,4 0,6
Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,4 0,6
Аммоний молибденовокислой 0,04 0,06
Железо сернокислое закисное 0,04 0,06
Подсырная сыворотка Остальное.

Подсырная сыворотка содержит около 6,5% сухих веществ или 48 57% от их наличия в цельном молоке. Наряду с белками в ней содержатся пептиды, протеазопептоны, свободные аминокислоты, причем их концентрация в 4-20 раз выше, чем в молоке. Углеводная часть представлена лактозой и продуктами ее гидролиза: глюкозой и галактозой. В ее состав входят минеральные вещества, органические кислоты (молочная, лимонная, нуклеиновая). В сыворотку почти полностью переходят водорастворимые витамины (Храмцов А.Г. Заец Н.Е. Доценко Г.Н. Производство сухой подсырной сыворотки. М. 1979, с.1-40). Большинство перечисленных компонентов вполне допустимы для бактерий.

В Российской Федерации для производства долгохранящихся продуктов (сухая сыворотка, лактоза и др.) используется всего лишь около 10% подсырной сыворотки Храмцов А.Г. Молочная сыворотка (перератботка и использование). М. Пищевая промышленность, 1979, с.3-272). Часть подсырной сыворотки в натуральном виде поступает для кормовых целей, а остальное молзаводы вынуждены сливать в водоемы, загрязняя их. Следовательно, подсырная сыворотка по существу является бросовым вторичным продуктом сыроделия.

Для приготовления культуральной среды отмеривают в колбу 1 л свежей подсырной сыворотки и вносят при непрерывном перемешивании навески солевых компонентов, г/л подсырной сыворотки
Натрия хлорид 0,4 -0,6
Натрий углекислый 0,4 0,6
Калий фосфорнокислый двухзамещенный 0,4 0,6
Аммоний молибденовокислый 0,04 0,06
Железо сернокислое закисное 0,04 0,06
После полного растворения солевых компонентов содержимое колбы разливают в чисто вымытые сухие стеклянные флаконы емкостью 250 мл, заполняя их на 3/4 объема, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,4 атм в течение 25-30 мин.

Готовая среда представляет собой мутную жидкость светло-серого или кремового цвета; допускается наличие на дне флакона небольшого количества хлопьев, легко разбивающихся при встряхивании. После охлаждения до +37^oC флаконы со средой переносят в настольную бактерицидную камеру и засевают свежепреготовленной маточной культурой Bac. pulvifaciens или Bac. subtilis из расчета 1,0 мл суспензии маточной культуры на флакон среды.

Маточную культуру поддерживают высевом в чашки Петри на МПА с последующим инкубированием посевов в термостате на протяжении 24 48 ч. Выросшие колонии идентифицируют по определителю Берги и делают смыв их стерильным физиологическим раствором натрия хлорида.

Флаконы снова закрывают ватно-марлевыми пробками и ставят в термостат с постоянной температурой 37,5 ± 0,5^oC на 36-48 ч. По истечении этого срока полученную партию жидкого пробиотика извлекают из термостата, проверяют на чистоту и определяют концентрацию микробных клеток высевом в три бактериологические чашки со стерильным МПА с последующим инкубированием в термостате и подсчетом числа выросших колоний.

Прошедшие биоконтроль флаконы с готовым пробиотиком герметически закрывают и перенося в холодильный шкаф для хранения.

Пример 1. Для культивирования Bac. subtilis штамм 534 использовали нативную подсырную сыворотку, а также обогащенную солевыми компонентами, взятыми в тех или иных количествах. Результаты определения микробного числа после 36-часового инкубирования посевов помещены в табл. 1.

Наибольшее накопление бактериальной массы (60 млрд/мл) происходило в среде, приготовленной по третьему варианту.

Пример 2. Провели сравнительную оценку предлагаемой среды, приготовленной на основе подсырной сыворотки (по третьему варианту), мясо-пептонного бульона (МПБ) и молочной среды (табл. 2).

Из материалов данного опыта следует, что подсырная сыворотка, обогащенная минеральными компонентами при оптимальном их соотношении, значительно превосходит как эталонную среду (МПБ), так и молочную среду по накоплению бактериальной массы и стабильности результатов.

Пример 3. Провели поиск оптимальных условий култивирования Bac. pulvifciens в подсырной сыворотке (с внесением солевых компонентов), включая pH, температуру и срок инкубирования посевов. Результаты трех опытов помещены в табл. 1-3.

Результаты трех опытов позволяют констатировать следующее. Для роста культивируемых бактерий-симбионтов оптимальными являются температура в диапазоне 37,0 ± 0,5^oC, pH 7,0 7,5. Накопление бактериальной массы завешается по истечении 36 42 ч. (результаты приведены в табл. 4). и вслед за этим начинается переход вегетативной формы в споровую (табл. 5).

Применение описанной культурной среды открывает перспективу создания биоцехов при предприятиях молочной промышленности по наработке жидких пробиотиков. При этом обеспечивается более полная утилизация вторичного сырья (подсырной сыворотки), что будет способствовать повышению рентабельности предприятий молочной промышленности и улучшению экологической обстановки в зоне их деятельности.

Использование: ветеринария, может быть использовано при производстве пробиотиков. Сущность изобретения: среда для культивирования бактерии-симбионта включает подсырьную сыворотку, натрий хлорид, натрий углекислый, калий фосфорнокислый двузамещенный, аммоний малибденовокислый, железо сернокислое закисное при следующем соотношении компонентов (г/л подсырной сыворотки): натрий хлорид - 0,4 - 0,6; натрий углекислый - 0,4 - 0,6; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 - 0,6; аммоний молибденовокислый - 0,04 - 0,06, железо сернокислое закисное - 0,04 - 0,06. 5 табл.

Среда для культивирования бактерии-симбионта Bacillus pulvifaciens ВКПМ-В4348 или Bacillus subtilis ВКПМ В-1666D продуцента пробиотика, содержащая питательную основу и натрия хлорид, отличающаяся тем, что она в качестве питательной основы содержит подсырную сыворотку и дополнительно натрий углекислый, калий фосфорнокислый двузамещенный, аммоний молибденовокислый, железо сернокислое закисное при следующем соотношении компонентов, г/л:
Натрий хлорид 0,4 0,6
Натрий углекислый 0,4 0,6
Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,4 0,6
Аммоний молибденовокислый 0,04 0,06
Железо сернокислое закисное 0,04 0,06
Подсырная сыворотка Остальноее