ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ С ПОВЫШЕННЫМИ НАКОПИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ YERSINIA PESTIS EV Российский патент 2022 года по МПК A61K9/12 C12N1/38 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к микробиологическим питательным средам жидким для получения биомассы вакцинного штамма Yersinia (Y.) pestis EV и может быть использовано для увеличения объема получаемой биомассы Y. pestis EV с высоким содержанием живых микробных клеток.

Известна питательная среда жидкая, используемая для культивирования вакцинного штамма Y. pestis EV, включающая: ферментативный гидролизат говяжьего мяса (ФГГМ) 170,0-190,0 мл; натрий хлористый 3,0-5,0 г; натрий сернистокислый 3,0-5,0 мг; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 г; стимулятор Карпузиди 0,06-0,010 г; очищенную воду - до 1 литра. (Патент РФ №2433170. Опубликовано: 10.11.2011. Бюл. №31).

Недостатком данной среды является дороговизна мясного сырья.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для культивирования вакцинного штамма Y. pestis EV, содержащая в качестве питательной основы ферментативный гидролизат бобов сои 320-420 мл, а также включающая, г/л: натрий хлористый 4,0-6,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0; натрий сернистокислый 0,3-0,5; липоевую кислоту 0,4-0,6; 20% раствор гидроокиси натрия 2,5-3,5 мл; дистиллированную воду - до 1 литра, рН 7,0±0,2. Выращивание вакцинного штамма Y. pestis EV проводят при температуре (27±1)°С. (Патент РФ №2260620. Опубл.20.09.2005. Бюл. №26.)

Недостатком данной среды является невозможность приобретения нужной формы субстанции липоевой кислоты в связи с прекращением ее производства.

Целью изобретения является разработка питательной среды жидкой с повышенными накопительными свойствами для получения биомассы Y. pestis EV с высоким содержанием живых микробных клеток.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотного питания в среде используют сочетание кислотного гидролизата кукурузной патоки, получаемого из отхода (ретентанта) производства ферментативного гидролизата кукурузной патоки, и ферментативного гидролизата казеина сухого.

Достигаемый технический результат заключается в том, что питательная среда, кроме питательной основы, содержит: натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, дистиллированную воду и стимулирующие добавки: натрий сернистокислый, глюкозу, пептон ферментативный, аммоний молибденовокислый 4-водный, натрий лимоннокислый, соль Мора, железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый, которые в совокупности повышают накопительные свойства питательной среды, при следующем соотношении ингредиентов:

Кислотный гидролизат кукурузной патоки, разведенный до содержания аминного азота 120 мг% 89,0 мл Ферментативный гидролизат казеина сухой 20,0 г Натрий хлористый 3,0 г Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 2,0 г Натрий сернистокислый 0,35 г Пептон ферментативный 10,0 г Аммоний молибденовокислый 4-водный 0,5 г Натрий лимоннокислый 5,0 г Соль Мора 0,4 г Железо (II) сернокислое 7-водное 20,0 мг Магний сернокислый 20,0 мг Натрий углекислый 3,0 г Натрия гидроокись, раствор 20% 3,0 мл Глюкоза, раствор 40% 10,0 мл Уголь активный древесный 20,0 г Дистиллированная вода до 1 л.

Исходным сырьем является ретентант (осадок) после изготовления ферментативного гидролизата кукурузной патоки жидкой, содержащей 9,4±1,2% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%), как и экстракт, патока является хорошей питательной средой при производстве пенициллина, других антибиотиков, витаминов. Кроме того, она содержит микроэлементы, мг/кг: цинк - 22; марганец - 5; медь - 5; кобальт - 0,02; йод - 0,30; макроэлементы, в %: фосфор - 0,25; натрий - 0,04; кальций - 0,59; калий - 0,36; магний -0,12; серу - 0,11; хлор - 0,04; аминокислоты, в %: аргинин - 90,0; гистидин -72,0; лейцин - 72,0; изолейцин - 89,0; фенилаланин - 59,0; треонин - 95,0; валин - 12,7; лизин - 0,96; метионин - 0,56; триптофан - 0,22; метионин+цистин - 0,27; и витамины, мг/кг: каротин (витамин А) - 8,0; B₁ (тиамин) - 4,0; В₂ - 1,0; В₃ (пантотеновую кислоту) - 6,5; В₄ (холин) - 400; В₅ - 17; В₆ (пиридоксин) - 2,9. Как известно, кукурузные белки характеризуются повышенным содержанием треонина, гистидина, лейцина, валина, поставляющих макроэргические связи (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с. ). Поставщиком кукурузной патоки жидкой является крахмало-паточный завод (Ставропольский край, г. Изобильный).

Изготовление кислотного гидролизата кукурузной патоки Получаемый после фильтрации ферментативного кукурузного гидролизата патоки жидкой отход (ретентант) в количестве 20,0 кг помещают в котел, затем добавляют соляную кислоту, разведенную водой дистиллированной 1:1 - 600 мл, до рН 4,5, кипятят в течение 15 минут, затем охлаждают до температуры 42°С и сливают в 10 л баллоны. В остуженный кислотный гидролизат добавляют хлороформ до 1,0%, смесь тщательно перемешивают, закрывают стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°С.

Казеин - белок из группы фосфопротеидов, составляет 85% от общего количества белка молока. Небелковым компонентом казеина является фосфорная кислота, связанная с серином. Молекула казеина разделена на 3 фракции: α, β и γ-казеины. Фракции и их разновидности отличаются аминокислотным составом. Элементарный состав казеина (в %): углерод - 53,1; водород - 7,1; кислород - 22,8; азот - 15,4; сера - 0,8; фосфор - 0,8. Казеин в молоке содержится в виде сложного комплекса казеината кальция с коллоидным фосфатом кальция, так называемого казеинаткальцийфосфатного комплекса (ККФК). В состав ККФК также входит небольшое количество лимонной кислоты, магния, калия и натрия. Изучена первичная структура всех казеинов и их физико-химических свойств. Эти белки имеют молекулярную массу около 20 тыс., изоэлектрическую точку (pI) около 4,7. Содержат повышенные количества пролина (полипептидная цепь имеет b-структуру), устойчивы к действию денатурантов. Остатки фосфорной кислоты (обычно в виде кислой фосфорно-кальциевой соли) образуют сложноэфирную связь главным образом с гидроксигруппой остатков серина. Высушенный казеин - белый порошок без вкуса и запаха, практически не растворим в воде и органических растворителях, растворяется в водных растворах солей и разбавленных щелочей, из которых выпадает в осадок при подкислении. Казеин в форме сухого порошка сохраняется годами в сухом прохладном месте (Ветеринарная энциклопедия [Текст]: [в 6 т.]. [Т.] 3: Зуд - Метрит / Науч. совет изд-ва "Сов. энцикл."; гл. ред. Скрябин К.И. - Москва: Советская энциклопедия, 1972. - 1128 стб., 5 л. ил. - (Энциклопедии. Словари. Справочники). С. 258). Казеин хорошо переваривается протеазами, содержит все необходимые аминокислоты, в том числе незаменимые (Химическая энциклопедия. Издательство "Советская энциклопедия". Москва. 1990. Т. 2. С. 284.).

Натрий хлористый. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке. Все питательные среды, как правило, содержат 0,5% натрия хлористого, что соответствует изоосмотическим условиям среды, оптимальным для жизнедеятельности микробов. Ионы натрия (Na⁺) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны, в регуляции синтеза белка. (Справочник по микробиологическим питательным средам, М.М. Меджидов. Москва. «Медицина». 2003. С. 18).

Натрий углекислый необходим для насыщения среды углекислотой.

Натрия гидроокись (раствор 20%) используется для получения значения рН 9,5 в ходе приготовления питательной среды перед кипячением.

Глюкоза кристаллическая является наилучшим источником углерода (энергии), она хорошо усваивается микроорганизмами. Внесение глюкозы в концентрации 1% улучшает ростовые свойства питательной среды. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Биргер М.О. Москва. «Медицина». 1982. С. 276-279).

Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный: его применение обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, при этом они малотоксичны.

Натрий сернистокислый является стимулятором роста для подавляющего числа микроорганизмов, в том числе патогенных. Благоприятной для роста и размножения является нейтральная реакция среды рН (7,0±0,5), поэтому уровень рН среды необходимо контролировать, его доводят до нужного использованием сернистых солей или кислот. Кроме того, добавление натрия сернистокислого способствует повышению прозрачности среды. Также сера, присутствующая в натрии сернистокислом, необходима для серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина, гомоцистеина, метионина), без которых невозможен синтез белков.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей, или панкреатический перевар, получают при помощи ферментов поджелудочной железы. Пептон характеризуется высокой питательной ценностью для микроорганизмов. (Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии М.С.Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. Санкт-Петербург. Элби-СПб. 2008. С. 27-31).

Аммоний молибденовокислый 4-водный обеспечивает раскрытие пептидных связей белковых молекул, тем самым повышая их доступность для ассимиляции микроорганизмами.

Лимоннокислый натрий или цитрат натрия вводится для подавления возможной контаминации. Цитрат-ион является одним из метаболитов цикла трикарбоновых кислот, образуется соединением оксалацетата и ацил-Коа под действием фермента цитратсинтазы в матриксе митохондрий. Именно этот процесс позволяет вступать ацетил-Коа в цитратный цикл, где он используется для получения энергии.

Соль Мора представляет собой соль закиси железа и аммония двойную сернокислую. Двойную сернокислую соль железа микроорганизмы получают в виде катионов неорганических кислот. Соль Мора обладает выраженным стимулирующим действием на рост возбудителя чумы.

Железо (II) сернокислое 7-водное, FeSO₄⋅7H₂O, массовая доля 99-101% (х.ч.). В своем составе содержит: медь - 0,001%, хлориды - 0,0005%, сумма кальция и магния - 0,02 (ГОСТ 4148-78). Железо как макроэлемент микроорганизмы получают в виде катионов неорганических веществ.

Магний сернокислый способствует быстрому осаждению биомассы.

Уголь марки ОУ-А активный древесный (ГОСТ 4453-74) используется для очистки и осветления питательных сред.

Дистиллированная вода - важнейший компонент всех питательных сред. Она входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях и реакциях гидролиза. Вода является хорошим растворителем, обеспечивая транспорт питательных веществ в микробную клетку.

Приготовление питательной среды жидкой с повышенными накопительными свойствами для получения биомассы Yersinia pestis EV

Питательную среду готовили следующим способом: кислотный гидролизат кукурузной патоки, разведенный дистиллированной водой до содержания аминного азота 120 мг% - 89,0 мл; ферментативный гидролизат казеина - 20,0 г; натрий хлористый - 3,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 2,0 г; пептон ферментативный - 10,0 г; уголь активный древесный - 20,0 г; железо (II) сернокислое 7-водное - 20,0 мг; магний сернокислый - 20,0 мг; натрий углекислый - 3,0 г; смешивали и доводили объем до 1 литра дистиллированной водой, устанавливали рН 9,5±0,2 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси - 3,0 мл, затем кипятили до полного растворения солей, фильтровали через фильтровальное полотно Бельтинг и 16 слоев фильтровальной бумаги, после чего добавляли: аммоний молибденовокислый 4-водный - 0,5 г; натрий сернистокислый - 0,35 г; натрий лимоннокислый - 5,0 г; соль Мора - 0,4 г; интенсивно перемешивали, устанавливали рН 7,4 с помощью раствора соляной кислоты в разведении 1:1, затем разливали в градуированные флаконы объемом 200,0 мл по 150,0 мл, накрывали ватно-марлевыми пробками и колпачками из бумаги «крафт», закрепляли резиновыми кольцами, стерилизовали при 0,5 атм в течение 20 мин. После стерилизации охлаждали до температуры 56°С и выдерживали в условиях термостата в течение 48 ч (контроль стерильности). По истечении 20 ч от начала культивирования вакцинного штамма Y. pestis EV в каждый флакон вводили 40% раствор глюкозы - по 10 мл.

В качестве контроля использовали питательную среду жидкую бульон Хоттингера, рН 7,2±0,1, приготовленную в соответствии с промышленным регламентом на производство препарата «Вакцина чумная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций» ПР 01897080-09-16.

В качестве примера испытывали культуру вакцинного штамма Y. pestis EV, выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, рН 7,2±0,1, при температуре (27±1)°С. Готовили взвесь 1-суточной культуры тест-штамма по оптическому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ОСО 42-28-85 (10МЕ) 2021 года выпуска производства ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, эквивалентную 1,0×10⁹ м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида. Из данной взвеси высевали по 2 мл (20 млн м.к./мл) в 2 флакона с питательной средой, а через 20 ч от начала культивирования в каждый флакон стерильно над факелом вводили по 10,0 мл 40% раствора глюкозы, и снова помещали в термостат. Всего выращивание вели в течение (48±2) ч при температуре (27±1)°С. Учет результатов проводили через 24 и 48 ч.

Определение количества жизнеспособных клеток микроорганизмов осуществляли методом посева на питательные среды (чашечный метод) в соответствии с Фармакопеей. РФ ОФС.1.7.2.0008.15, п.п. 1.3.2.

Из 10^-5 и 10^-6 разведений производили параллельный высев, из каждого разведения по 2 чашки Петри с плотной питательной средой агаром Хоттингера, рН 7,2±0,1. При учете результатов для определения концентрации микробных клеток считали количество колоний, выросших на всех чашках.

Среднее количество КОЕ (N) в 1 мл рассчитывали по формуле:

N=C/(n₁+0,l×n₂)×d

где: С - сумма подсчитанных колоний на всех чашках;

n₁ - количество чашек первого разведения;

n₂ - количество чашек второго разведения;

d - коэффициент первого разведения;

0,1 - коэффициент, учитывающий кратность первого и второго разведения.

Методика подсчета процента живых микробных клеток

Подсчет количества (%) живых микробных клеток в суспензии выросшей биомассы вакцинного штамма Y. pestis EV производили в соответствии с ПР 01897080-09-16.

Готовили основное разведение путем добавления 0,1 мл микробной взвеси, собранной из флаконов с питательной средой жидкой с повышенными накопительными свойствами для получения биомассы Yersinia pestis EV, приготовленной на основе кислотного гидролизата кукурузной патоки, в 0,9% раствор натрия хлорида и последовательным добавлением 0,9% раствора натрия хлорида получали взвесь концентрацией 1 млрд м.к./мл. Далее пипеткой делали последовательные десятикратные разведения полученной взвеси в 0,9% растворе натрия хлорида, начиная с 10^-1 по 0,5±0,01 мл взвеси с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида, заканчивая 10^-5 и 10^-6 разведениями. Разведенную биомассу из двух последних пробирок засевали пипеткой по 0,1±0,01 мл на 2 чашки Петри с питательным агаром (рН 7,2±0,1) из каждого флакона и выдерживали при температуре (27±1)°С 48±2 ч.

Учет производили путем подсчета количества выросших колоний, визуально оценивая характер роста культуры на плотной среде. Вырастать должно не менее 25% от посеянного количества. За 100% принимали число засеянных клеток, рассчитанное по стандарту мутности.

На бульоне Хоттингера, рН 7,2±0,1, используемом в качестве контроля, из 10^-5 и 10^-6 разведений выросло 276, 252 и 29, 23 колонии, соответственно, в сумме это составило 580 колоний. Среднее количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в исходной суспензии составило 2,63×10⁷ КОЕ/мл, живых микробных клеток - 35,6%. Полученные на контрольной среде данные соответствовали нормативным требованиям промышленного регламента ПР 01897080-09-16.

Пример 1. Культуру вакцинного штамма Y.pestis EV выращивали на питательной среде жидкой, содержащей следующие ингредиенты: кислотный гидролизат кукурузной патоки, разведенный до содержания аминного азота 120 мг% - 79,0 мл; ферментативный гидролизат казеина - 18,0 г; натрий хлористый - 1,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 1,8 г; натрий сернистокислый - 0,2 г; пептон ферментативный - 8,0 г; аммоний молибденовокислый 4-водный - 0,3 г; лимоннокислый натрий - 4,0 г; соль Мора - 0,3 г; железо (II) сернокислое 7-водное - 18,0 мг; натрий углекислый - 2,0 г; натрия гидроокись раствор 20% - 1,0 мл; уголь активный древесный -18,0; магний сернокислый - 18,0 мг; раствор 40% глюкозы - 8,0 мл; дистиллированную воду - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов колоний, выросших из 10^-5 и 10^-6 разведений, было 200, 218 и 17, 20, соответственно, что в сумме составило 455 колоний. Среднее количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в исходной суспензии составило 2,06×10⁷ КОЕ/мл, живых микробных клеток -34,0%.

Пример 2. Культуру вакцинного штамма чумного микроба Y.pestis EV выращивали на питательной среде жидкой, содержащей следующие ингредиенты: кислотный гидролизат кукурузной патоки, разведенный до содержания аминного азота 120 мг% - 89,0 мл; ферментативный гидролизат казеина - 20,0 г; натрий хлористый - 3,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 2,0 г; натрий сернистокислый - 0,35 г; пептон ферментативный - 10,0 г; аммоний молибденовокислый 4-водный - 0,5 г; лимоннокислый натрий - 5,0 г; соль Мора - 0,4 г; железо (II) сернокислое 7-водное - 20,0 мг; натрий углекислый - 3,0 г; натрия гидроокись раствор 20% - 3,0 мл; уголь активный древесный - 20,0 г; магний сернокислый - 20,0 мг; глюкоза раствор 40% - 10,0 мл; дистиллированную воду - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов колоний, выросших из 10^-5 и 10^-6 разведений, было 312; 343 и 37; 61, соответственно, что в сумме составило 753 колонии. Среднее количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в исходной суспензии составило 3,42×10⁷ КОЕ/мл, живых микробных клеток - 49,9%.

Пример 3. Культуру вакцинного штамма чумного микроба Y.pestis EV выращивали на питательной среде жидкой, содержащей следующие ингредиенты: кислотный гидролизат кукурузной патоки, разведенный дистиллированной водой до содержания аминного азота 120 мг% - 99,0 мл; ферментативный гидролизат казеина - 22,0 г; натрий хлористый - 4,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 2,2 г; натрий сернистокислый - 0,5 г; пептон ферментативный - 12,0 г; аммоний молибденовокислый 4-водный - 0,7 г; лимоннокислый натрий - 6,0 г; соль Мора - 0,5 г; железо (II) сернокислое 7-водное - 22,0 мг; натрий углекислый - 4,0 г; натрия гидроокись раствор 20% - 5,0 мл; уголь активный древесный - 22,0 г; магний сернокислый - 22,0 мг; глюкоза раствор 40% - 12,0 мл; дистиллированную воду - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов колоний, выросших из 10^-5 и 10^-6 разведений, было 272, 229 и 49, 16, соответственно, что в сумме составило 566 колоний. Среднее количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в исходной суспензии составило 2,57×10⁷ КОЕ/мл, живых микробных клеток - 39,4%.

Таким образом, по количеству подобранных ингредиентов оптимальным является состав питательной среды, приведенный в примере 2.

Заявленная питательная среда жидкая с повышенными накопительными свойствами для получения биомассы Yersinia pestis EV (пример 2) позволяет получить в среднем 3,42×10⁷ КОЕ/мл в выращенной биомассе, обеспечивая при этом высокий процент живых микробных клеток, равный 49,9.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к микробиологическим питательным средам жидким для получения биомассы вакцинного штамма Yersinia (Y.) pestis EV. Описана питательная среда жидкая с повышенными накопительными свойствами для получения биомассы Yersinia pestis EV, содержащая: кислотный гидролизат кукурузной патоки, разведенный до содержания аминного азота 120 мг% 89,0 мл; ферментативный гидролизат казеина сухой 20,0 г; натрий хлористый 3,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 2,0 г; натрий сернистокислый 0,35 г; пептон ферментативный 10,0 г; аммоний молибденовокислый 4-водный 0,5 г; лимоннокислый натрий 5,0 г; соль Мора 0,4 г; железо (II) сернокислое 7-водное 20,0 мг; магний сернокислый 20,0 мг; натрий углекислый 3,0 г; натрия гидроокись, раствор 20% 3,0 мл; глюкоза, раствор 40% 10,0 мл; уголь активный древесный 20,0 г; дистиллированная вода до 1 л. Питательная среда жидкая с повышенными накопительными свойствами для получения биомассы Yersinia pestis EV позволяет увеличить концентрацию клеток вакцинного штамма и процент живых микробных клеток в выращенной биомассе. 3 пр.

Питательная среда жидкая с повышенными накопительными свойствами для получения биомассы Yersinia pestis EV, содержащая:

Кислотный гидролизат кукурузной патоки, разведенный до содержания аминного азота 120 мг% 89,0 мл Ферментативный гидролизат казеина сухой 20,0 г Натрий хлористый 3,0 г Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 2,0 г Натрий сернистокислый 0,35 г Пептон ферментативный 10,0 г Аммоний молибденовокислый 4-водный 0,5 г Лимоннокислый натрий 5,0 г Соль Мора 0,4 г Железо (II) сернокислое 7-водное 20,0 мг Магний сернокислый 20,0 мг Натрий углекислый 3,0 г Натрия гидроокись, раствор 20% 3,0 мл Глюкоза, раствор 40% 10,0 мл Уголь активный древесный 20,0 г Дистиллированная вода до 1 л