СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ НИТРОСОЕДИНЕНИЙ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения гетероциклических нитросоединений в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, обработке водным раствором гидроксида натрия, центрифугировании, обработке центрифугата вольфраматом натрия в кислой среде при кипячении на водяной бане, отделении осадка центрифугированием в течение получаса, экстракционном выделении анализируемых соединений из центрифугата эфиром с последующим подщелачиванием центрифугата и повторной экстракцией эфиром [1]
Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения гетероциклических нитросоединений.

Известен способ определения органических соединений в биологическом материале путем измельчения биологической ткани, 2 3-кратной обработки разбавленным раствором серной кислоты при pH 2,5 (каждый раз в течение 1 2 ч), объединения полученных извлечений, центрифугирования, насыщения центрифугата сульфатом аммония при pH 2,5, отделении выпавшего осадка, экстракции кислой вытяжки эфиром, отделении эфирного экстракта, прибавления к водному слою гидроксида натрия до pH 8,5 9 с последующей экстракцией анализируемых веществ хлороформом [2]
Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения гетероциклических нитросоединений.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с подкисленным этанолом (каждый раз в течение суток), объединении вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления его водой с последующей экстракцией анализируемых соединений органическим растворителем сначала из кислого, а затем из щелочного раствора [3]
Способ характеризуется длительностью выполнения, недостаточно высокой чувствительностью и низкой точностью.

Задачей изобретения является сокращение продолжительности определения, повышение чувствительности и точности способа.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, неоднократно обрабатывают диметилформамидом, полученные извлечения объединяют, разбавляют водным раствором в соотношении 1 3 (по объему), экстрагируют хлороформом, экстракт отделяют, обрабатывают водно-щелочным раствором с pH 10,5 11,0, щелочной раствор отделяют, подкисляют до pH 6 7, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, эфирное извлечение отделяют, экстрагент испаряют, сухой остаток растворяют в органическом растворителе, хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей ацетон-хлороформ (7 3).

Сопоставительный анализ предлагаемого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что биологическую ткань обрабатывают диметилформамидом, извлечение разбавляют водным раствором в соотношении 1 3 (по объему), экстрагируют хлороформом, экстракт обрабатывают водно-щелочным раствором с pH 10,5 11,0, щелочной раствор отделяют, подкисляют до pH 6 7, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, эфирное извлечение испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в органическом растворителе и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей ацетон-хлороформ (7 3). Таким образом, предлагаемое решение соответствует критерию "новизна".

Сравнение предлагаемого решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в данной области техники не позволяет выявить в них признаки, отличающие предлагаемое техническое решение от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемое решения критерию "существенные отличия".

Способ осуществляется следующим образом,
Биологическую ткань, содержащую нитропроизводные гетероциклического ряда, измельчают, трижды настаивают с диметилформамидом (каждый раз в течение получаса), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, разбавляют водным раствором в соотношении 1 3 (по объему), экстрагируют хлороформом, экстракт отделяют, частично упаривают, доводят до определенного объема хлороформом, обрабатывают водно-щелочным раствором с pH 10,5 11,0, щелочной раствор отделяют, подкисляют до pH 6 7, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей ацетон-хлороформ (7 3).

Пример 1. Определение 5-нитро-8-оксихинолина в ткани печени.

К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 5 мг 5-нитро-8-оксихинолина, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16 18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл диметилформамида и выдерживают полчаса, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют еще дважды. Вытяжки объединяют, к объединенному извлечению прибавляют 180 мл буферного раствора с pH и экстрагируют образующийся раствор двумя порциями хлороформа по 200 мл каждая. Хлороформные экстракты объединяют, испаряют до объема 5 8 мл и доводят до 10 мл хлороформом. Хлороформный раствор дважды экстрагируют щелочным буфером с pH 10,5 11,0 (порциями по 10 мл каждая). Щелочные извлечения объединяют, подкисляют до pH 6 7 8%-ным раствором хлороводородной кислоты и экстрагируют порциями диэтилового эфира, насыщенного водой, трижды по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, раствор переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки ацетоном. 0,2 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа "Силуфол" UV-254 и хроматографируют в системе растворителей ацетон-хлороформ (7 3). 5-Нитро-8-оксихинолин проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с Rf 0,38. Окраска пятна усиливается в парах аммиака.

Для определения количества извлеченного 5-нитро-8-оксихинолина и степени извлечения участок хроматографической пластины с пятном вещества вырезают и элюируют вещество 5 мл диметилформамида. Оптическую плотность элюата измеряют на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 440 нм (светофильтр N 4). Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 5-нитро-8-оксихинолина определяют по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика На линию старта хроматографической пластины типа "Силуфол" UV-254 наносят 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,20, 0,24 мл 0,01% раствора 5-нитро-8-оксихинолина в этаноле и осуществляют хроматографирование в системе растворителей ацетон-хлороформ (7 3). 5-нитро-8-оксихинолин обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с Rf 0,38. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин. Элюаты фотометрируют при 440 нм на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Раствор сравнения элюат, полученный при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
D 0,39457•C + 0,05634,
где
D оптическая плотность; C концентрация определяемого вещества в окрашенном растворе, мкг/мл.

Результаты определения 5-нитро-8-оксихинолина в ткани печени представлены в табл. 1.

Пример 2. Определение 2-ацетиламино-5-нитротиазола
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 5 мг 2-ацетиламино-5-нитротиазола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16 18^oC. По истечении этого времени смесь заливают 20 мл диметилформамида и выдерживают полчаса, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды. Вытяжки объединяют, к объединенному извлечению прибавляют 180 мл буферного раствора с pH 2 3 и экстрагируют образующийся раствор двумя порциями хлороформа по 200 мл каждая. Хлороформные экстракты объединяют, испаряют до объема 5 8 мл и доводят до 10 мл хлороформом. Хлороформный раствор дважды экстрагируют щелочным буфером с pH 10,5 11,0 (порциями по 10 мл каждая). Щелочные извлечения объединяют, подкисляют 8%-ным раствором хлороводородной кислоты до pH 6 7 и экстрагируют порциями диэтилового эфира, насыщенного водой, трижды по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, раствор переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки ацетоном. 0,2 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа "Силуфол" UV-254 и хроматографируют в системе растворителей ацетон-хлороформ (7 3). 2-Ацетиламино-5-нитротиазол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с Rf 0,62. Окраска пятна усиливается в парах аммиака.

Для определения количества извлеченного 2-ацетиламино-5-нитротиазола и степени извлечения участок хроматографической пластины с пятном вещества вырезают и элюируют вещество 5 мл диметилформамида. Оптическую плотность элюата измеряют на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 400 нм (светофильтр N 3). Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 2-ацетиламино-5-нитротиазола определяют по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика
На линию старта хроматографической пластины типа "Силуфол" UV-254 наносят 0,01, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,20, 0,24 мл 0,01% раствора 2-ацетиламино-5-нитротиазола в этаноле и осуществляют хроматографирование в системе растворителей ацетон-хлороформ (7:3). 2-Ацетиламино-5-нитротиазол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с Rf 0,62. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин. Элюаты фотометрируют при 400 нм на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Раствор сравнения элюат, полученный при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
D 0,29750•C + 0,07699,
где
D оптическая плотность; C концентарция определяемого вещества в окрашенном растворе, мкг/мл.

Результаты определения 2-ацетиламино-5-нитротиазола представлены в табл. 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипов в 6 раз повышает чувствительность определения, в 2,5 раза увеличивает степень извлечения гетероциклических нитросоединений из ткани печени (с 18% до 47,33%), характеризуется более высокой точностью (относительная ошибка определения уменьшается с ± 10% до 3,22%), позволяет более чем в 20 раз сократить продолжительность анализа (с 3-4 сут до 3-3,5 ч).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в табл. 3.

Использование: биология и токсикологическая химия, изобретение может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Сущность изобретения: анализируемую пробу измельчают, неоднократно обрабатывают диметилформамидом, полученные извлечения объединяют, разбавляют водным раствором в соотношении 1:3 (по объему), экстрагируют хлороформом, экстракт отделяют, обрабатывают воднощелочным раствором с pH 10,5 - 11,0, щелочной раствор отделяют, подкисляют до pH 6 - 7, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, эфирное извлечение отделяют, экстрагент испаряют, сухой остаток растворяют в органическом растворителе и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей ацетон-хлороформ (7: 3). 3 табл.

Способ определения гетероциклических нитросоединений в биологическом материале путем измельчения пробы, обработки органическим растоврителем, отделения извлечения и экстракционной очистки, отличающийся тем, что обработку пробы ведут диметилформамидом, извлечение разбавляют водным раствором в соотношении 1 3 (по объему), экстрагируют водно-щелочным раствором с pН 10,5 11,0, экстракт отделяют, подкисляют до pН 6 7, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, извлечение отделяют, экстрагент испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей ацетон хлороформ при их объемном соотношении 7 3.