Способ определения алкил-динитрофенолов в биологическом материале Советский патент 1993 года по МПК G01N31/00 G01N30/90 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения алкилдинитрофенолов в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение 1 сут), объединения вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата анализируемых соединений органическим растворителем сначала из кислого, а затем из щелочного раствора.

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения алкилдинитрофенолов и малой селек-. тивностью.

Известен способ определения органических веществ кислого характера (к которым относятся и алкилдинитрофенолы) в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, обработке водным раствором гидроксида натрия, центрифугировании, обработке центрифугата вольфраматом натрия в кислой среде при кипячении на зодяной бане, отделении осадка центрифугированием в течение получаса, экстракционном выделении анализируемых соединений из центрифугата эфиром с последующим подщелачиванием центрифугата и повторной экстракции эфиром.

XI

00

о

fe

о

Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения алкилдинит- рофенолов.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемым ре- зультатам является способ определения ал- килдинитрофенолов (каратана) в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, неоднократной ее обработки порциями гексана каждый раз в течение 30 мин, отделения гексановых извлечений, их объединения и упаривания до сухого остатка с последующим растворением остатка в легколетучем органическом растворителе, хроматографированием в тонком слое силикагеля в системе растворителей гексан-ацетон (4:1).

Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и селективностью.

Цель достигается предлагаемым способом, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объеди- няют и упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент отгоняют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлоро- форм-гексан (7:4).

Сопоставительный анализ предлагав- мого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что биологическую ткань обрабатывают ацетоном, сухой остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хррматографирование осуществ- ляют в системе растворителей хлороформ- гексан при их объемном соотношении 7:4.

Сравнение предлагаемого решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в данной области тех- ники не позволяет выявить в них признаки, отличающие предлагаемое техническое решение от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию существенных отличий.

Способ осуществляется следующим образом. Биологическую ткань, содержащую алкилдинитрофенолы, измельчают, трижды настаивают с ацетоном (каждый раз в течение получаса), ацетоновые извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала i/ объединяют, ацетон испаряют, сухой растворяют в гидрофобном растворителе, экстрагируют водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент отгоняют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля с системе растворителей х. юро- форм-гексан (7:4).

П р и м е р 1. Определение 2-мети,1-4,6- динитрофенола в ткани печени.

К 50 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 5 мг 2;метил-4,6-динитрофенола, тщательна перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1 сут при 18-20°С. По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают 0,5 ч, периодически перемешивая. Извлечение отцеля- ют и операцию настаивания повторяю еще дважды. Ацетоновые вытяжки объединяют, испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа. Полученный раствор трижды экстрагируют щелонным буферным раствором с рН 9,5 (порциями по 50 мл каждая). Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24%-нь раствором хлороводородной кислоты до р Н 2-3 и экстрагируют порциями диэтиловогс эфира трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, раствор перенс сят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетоном. 0,1 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографич ;ской пластины типа Силуфол UV-254 и хрома огра- фируют в системе растворителей хлоро орм- гексан (7:4). 2-Метил-4,6-динитрооенол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с ,42.

Для определения количества извлеченного 2-метил-4,6-динитрофенола и сте пени извлечения участок хроматографичоской пластины с пятном вещества вырезают, обрабатывают 5 мл диметилформам1 да и фильтрую образующийся окрашенный раствор в спектрофотометрическую кк вету. Оптическую плотность раствора изме ряют на спектрофотометре СФ-26 при волны 435 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 2-метил- 4,6-динитрофенола определяют

по

пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

уравнению калибровочного графика и

Построение калибровочного граф

ка.

На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254 наносят 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,80, 1,20, 1,60 мл 0,005% раствора 2-метил-4,6-динитрофено- ла в ацетоне и осуществляют хроматографи- рование в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 2-Метил-4,6-динитрофенол обнаруживается на хроматограм- ме.в виде желтых пятен с ,42. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин. Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через бумажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 435 им на спектрофотометре. Раствор сравнения - злюат, полученный при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид

,08495-0+0,0005, где D - оптическая плотность;

С - концентрация окрашенного раствора, мкг/мл.

Результаты определения 2-метил-4,6- динитрофенола в ткани печени представлены в табл.1.

П р и м е р 2. Определение 2-втор-октил- 4,6-динитрофенола в ткани печени.

К 50 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 26 мг 2-втор-октил-4,6-динитрофенола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1 сут при 18- 20°С. По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают 0,5 ч, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настраивания повторяют еще дважды, Ацетоновые вытяжки объединяют, испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 50 мл гексана. Полученный раствор трижды экстрагируют щелочным раствором (универсальный буфер с рН 11,98, разбавленный водой в четыре раза) порциями по 50 мл. Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24%- ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3 и экстрагируют порциями диэти- лового эфира трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, раствор переносят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетоном. 0,1 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254 и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 2- втор-0ктил-4,6-динитрофенол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с

,76.

Для определения количества извлеченного 2-втор-октил-4,6-динитрофенола и степениизвлечения участок хроматографической пластины с пятном вещества вырезают, обрабатывают 5 мл диметилформамида и фильтруют образующийся окрашенный раствор в спектрофотометри- ческую кювету. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре

СФ-26 при длине волны 445 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 2-втор-октил-4,6-динитрофенола определяют по уравнению калибровочного

графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика. На линию старта хроматографической

пластины типа Силуфол UV-254 наносят 0,025, 0,05, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40, 0,50, 0,60, 0,70, 0,80, 0,90, 1,00 мл 0,005%-ного раствора 2-втор-октил-4,6-динитрофенола в ацетоне и осуществляют хроматографирование в

системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 2-втор-Октил-4,6-динитрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с ,76. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин. Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через бумажный фильтр, оптическую плотность измеряют

при 445 гм на спектрофотометре. Раствор сравнения - элюзт, полученный при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график зависимости оп- тической плотности растворов от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид ,05545-C+0,00504,

где D - оптическая плотность;

С - концентрация окрашенного раствора, мкг/мл.

Результаты определения 2-втор-октил- 4,6-динитрофенола в ткани печени приведены в табл.2.

ПримерЗ. Определение 4-втор-октил- 2,6-динитрофенола в ткани печени.

К 50 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 25 мг 4-втор-октил-2,6-динитрофенола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1 сут при 18- 20°С. По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают0,5 ч, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды. Ацетоновые вытяжки объединяют, испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 50 мл гексана. Полученный раствор трижды экстрагируют щелочным раствором (универсальный буфер с рН 11,98, разбавленный водой в четыре раза) порциями по 50 мл. Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24%- ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3 и экстрагируют порциями диэти- лового эфира трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, рас- твор переносят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетоном. 0,1 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа Силу- фол UV-254 и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 4- втор-0ктил-2,6-динитрофенол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с

,30.

Для определения количества извлечен- ного 4-втор-октил-2,6-динитрофенола и сте- пениизвлечения ... участок хроматографической пластины с пятном вещества вырезают, обрабатывают 5 мл диме- тилформамида и фильтруют образующийся окрашенный раствор в спектрофотометре СФ-26 при длине волны 490 нм, Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 4-втор-октил-2,6-динитрофенола оп- ределяют по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика. На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254 наносят 0,02, 0,04, 0,08, 0,16, 0,32, 0,48, 0,64, 0,80 мл 0,005%-ного раствора 4-втор-октил-2,6-ди- нитрофенола в ацетоне и осуществляют хро- матографированиев системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 4- втор-0ктил-2,6-динитрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с ,70. Участки пластины с находящими- ся на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилфор- мамида в течение 5 мин. Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через бумажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 590 нм на спектрофотометре, Раствор сравнения - элюат, полученный при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид

,02576-С+0,00482,

где D - оптическая плотность;

С - концентрация окрашенного рас -вора, мкг/мл.

Результаты определения 4-втор-ок Ил- 2, 6-динитрофенола в ткани печени приведены в табл.3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом повышает степень извлечения алкилдинитрофенолов из ткани печени Е 2,5 раза и чувствительность определения в 4 раза. В отличие от прототипа предлагаемый способ более селективен и позволяет определять алкилдинитрофенолы в присутствии различных классов органических соединений: производных тропана (ТРОПИНОЕОГО эфира d.l-троповой кислоты, скопиноного эфира l-троповой кислоты), пиперидина (1,2,5-триметил-4-пропионилокси-4-фен|/1л- пиперидина), хинуклидина (3-ацетоксихи- нуклидина), хинолина (/ -диэтиламинорти- ламида-2-бутоксицинхониновой кислоты), 4-(1 -метил-4 -диэтиламино)-7-хлорхинолина, 2-(4 -нитростирил}-4-(1|-метил-4 -диэтиламин- обутиламино)-6-метоксихинолина, б -мегок- сихинолил-(41)- 5-винилхинуклид и л -(2 )- карбинола), фенотиазина 2-хлор-10-(3 -д11ме- тиламинопропил)-фенотиазина, 10-(3 гди- мети.ламинопропил)-фенотиазина, 10-(2 -диметиламинопропил)-фенотиазина, хинолизидина (а-спартеина), пирролизиди- на (платифиллина), изохинолина 6,7-диметок- си-1-(3,4 -диметоксибензил)-изохинолина, фенантренизохинолина (морфина, кодеина), имидазола (пилокарпина).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов предста злена в табл.4.

Формула изобретения

Способ определения алкилдинитрофенолов в биологическом материале путег измельчения пробы обработки органическим растворителем, упаривания, растворения полученного сухого остатка и хроматогра- фирования раствора в тонком слое сил чка- геля, отличающийся тем, что, с цепью повышения чувствительности и селекти шости способа, в качестве органического растворителя используют ацетон, сухой остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографи- рование осуществляют в системе растворителей хлороформ - гексан при их объемном соотношении 7:4.

Использование: в аналитической химии. Сущность изобретения: биологическую пробу измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют и упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэти- ловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикэге- ля в системе растворителей хлороформ-Гек- сан (7:4). 4 табл. СО с

Результаты определения 2-метил-4,6-динитрофенола в ткани печени

Результаты определения 2-втор-октил-4,6-динитрофенола в ткани печени

Результаты определения 4-втор-октил-2,6-динитрофенола в ткани печени

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере 2-метил-,6-динитрофенола)

Показатель

Предлагаемый способ

тепень извлечения, %

увствительность, мг в 0 г печени

лективность

81,ЭО%

Позволяет селективно определять алкилдинитрофенолы в присутствии производных тропана (тропинового эфира d,1-троповой кислоты, скопинового эфира 1-троповой кислоты); пиперидина (1 .З-триметил- -пропионилок- си-4-фенилпиперидина); хинук- лидина (3-ацетоксихинуклидина, 3-бензоилоксихинуклидина); хинолина (/ -диэтиламиноэтилами- да-2-бутоксицинхониновой кислоты) , k- (1 -метил- -диэтил- аминобутиламино)-7-хлорхиноли- на, 2-(4 -нитростирил)г -{11- метил-1 -диэтиламинойутилами- но)-6-метоксихинолинп, б -ме- токсихинолил-(4)- 5 винилхи- нуклидил) (2ц -карбинола); фенотиазина 12-хлор-1 р-(3 -диметиламинопропил)-фeнoтиaзинaJ , 10-(з -диметиламинопропил)- фенотиазина, 10-(2 -диметиламинопропил) -фенотиазина ; хинолизидина (л-спартеина); пирролизидина (платифиллина); изохинолина 6,7-Диметокси-1- (З1 , -диметоксибензил)-изо- хинолина ; фенатренизохиноли- на (морфина, кодеина); имида- зояа (пилокарпина)

Таблица А

Известный способ 28,83%

Не позволяет селективно определять алкилдинитрофенолы в присутствии производных тропана (тропинового эфира d,1-троповой кислоты, скопинового эфира 1-троповой кислоты); пиперидина (1,2,5-триметил- -пропио- нилокси- -фенилпиперидина); хи- нуклидина (3-ацетоксихинуклиди- на, 3-бензоилоксихинуклидина); хинолина (Ј-диэтиламиноэтил- амида-2-бутоксицинхониновой кислоты), Аг(1 -метил- --ди- этиламинобутиламино)-7-хлор- хинолина, 2-{V-нитростирил)- 4-(1 -метил-4- дйэтиламинобутил амино)-6-метоксихинолина; 6 -метоксихинолил-( )- 5-ви- нилхинуклидил-(2)J-карбинола ; фенотиазина 2-хлор-1 О-(3 -диметиламинопропил)-фенотиазина , 1 О -(3 -диметиламинопропил)-фенотиазина., 10-(2Г-диметиламино- пропил)-фенотиазина . j хиноли- зидина (оС-спартеина); пирроли- зидина (платифиллина); изохи- нолина f6, 7-Диметокси-1 -(3 , - диметоксибензил) -изохинолина |; фенантренизохинолина (морфина, кодеина); имидазола (пилокарпина)