СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАКТИВНОГО ЛИЗИСА КЛЕТОК Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения реактивного лизиса клеток в клинической практике и в научных исследованиях.

Известен способ определения реактивного лизиса по величине зоны лизиса эритроцитов барана, фиксированных в агарозном геле (Thompson R.A. Rowe D.C. Reactive lysis: a distinctive form of red cell lysis.//Immunology/, 1968, 14, N5, 745-762). Гель содержит ЭДТА, необходимый для блокирования начальных реакций активации комплемента путем хелатирования ионов кальция и магния. Именно цитолиз в условиях ингибирования протелитической фазы активации комплемента является признаком реактивного лизиса. C5b6 получают на поверхности активатора комплемента (иммунные комплексы, зимозан, эндотоксин, агароза) путем предварительной его обработки сывороткой крови. Реактивный гемолиз наблюдается при внесении источника C6b6 в лунки геля. В жидкой фазе при аналогичной постановке опыта не удается зарегистрировать существенной скорости лизиса.

Известен способ определения реактивного лизиса клеток, в котором используют природный комплекс мембранной атаки комплемента (Baker P.J. Lint T.F. McLeod B.C. Bherends C.L. Gewurz H. Studies on the inhibitioh of C56 induced lysis /reactive lysis/[1] В нормальную сыворотку крови человека добавляют зимозан в концентрации 4 мг/мл. Смесь инкубируют в течение 1 ч при 37^oC при постоянном перемешивании, затем центрифугируют с охлаждением при 1000 g 3 мин. Осадок отмывают дважды в 15 объемах ледяной дистиллированной воды C5b6, сорбированный на осажденном зимозане, элюируют 0,5 M NaCl 15 мин при комнатной температуре. Зимозан удаляют центрифугированием. Супернатант пропускают через колонку, заполненную ионообменной смолой Hatwan DE-52, промытую и уравновешенную 0,01 M фосфатом натрия (pH 7,4) с глицерином (40 об.). C5b6 элюируют линейным градиентом концентрации NaCl (0,01-0,3 M). Полученные фракции тестируют на наличие функциональной активности с помощью геля, содержащего комплемент, эритроциты барана и ЭДТА. Фракции, обладающие функциональной активностью, объединяют и подвергают гель-фильтрации в колонке (3х85 см), заполненной Sephadex-200, промытой и уравновешенной 0,05 М трис-буфером (pH7,2). Фракции анализируют на наличие C5b6 с помощью пластинок геля. Фракции, содержащие C5b6, используют для регистрации реактивного лизиса. В сыворотку морской свинки, разведенную 1:2 вероналовым буфером (pH 7,2), содержащим 0,01 M ЭДТА, добавляют эритроциты барана (50 млн.кл./мл) и частично очищенный C5b6. Смесь инкубируют 10 мин при 37^oC, центрифугируют 10 мин при 0^oC. Определяют степень лизиса клеток по выходу гемоглобина, т.е. путем регистрации оптической плотности при 412 нм жидкости, полученной после лизирования отмытых клеток дистиллированной водой.

Недостатком способа является его сложность. Особенно трудоемка процедура выделения и очистки комплекса C5b6. Требуются дорогостоящие хроматографические колонки и сорбенты. Из-за сложности и высокой стоимости способ используют только в научных целях.

Задачей изобретения является разработка простого, недорогого способа определения реактивного лизиса клетки, который может широко использоваться в клинической практике.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости путем воздействия на клетку-мишень комплекса мембранной атаки комплемента и регистрации лизиса клетки-мишени обрабатывают комплементом в присутствии полимерного инициатора альтернативного пути.

В предлагаемом способе для определения лизиса в сыворотке крови или другой биологической жидкости (плазма, трансудат, эксудат) используют эритроциты барана, которые, как известно, инициируют только классический путь активации комплемента. В присутствии блокатора классического пути (ЭГТА) сыворотка крови человека не лизирует эритроциты барана. Удаление из сыворотки крови человека компонента альтернативного пути активации комлемента, а именно фактора D, приводит к прекращению лизиса. Это свидетельствует о том, что эритроциты барана, несмотря на то, что не инициируют альтернативный путь, лизируются именно в результате активации альтернативного пути, обусловленной действием зимозана. Следовательно, зимозан инициирует каскад комплемента, а эритроциты барана разрушаются комплексом мембранной атаки, что и позволяет регистрировать реактивный лизис в сыворотке крови.

Способ может быть осуществлен, например, следующим образом. В теомостатированной при 37^oC кювете спектрофотометра формируют инкубационную смесь. Состав инкубационной смеси: 0,1-0,2 мл сыворотки крови или другой, содержащей комплемент биологической жидкости (плазма, трансудат, эксудат); 0,4 мл 10 мМ раствора ЭГТА (реагент, хелатирующий ионы кальция и таким образом, ингибирующий классический путь активации комплемента); 0,002-0,1 мл зимозана (инициатор альтернативного пути активации комплемента) в концентрации 1 мг/мл; 0,72-1,8 млн.кл./мл трижды отмытых эритроцитов барана; изотонический вероналовый буфер (pH 7,2) до объема 0,8 мл ЭГТА, зимозан и эритроциты приготовлены в изотоническом вероналовом буфере, содержащем 5 мМ MgC12. Регистрируют динамику лизиса эритроцитов по убыванию оптической плотности при 800 нм. Процедура включает две стадии: приготовление инкубационной смеси и спектрофотометрию. Время анализа 10-15 мин.

Пример 1. Определение реактивного лизиса в сыворотке крови здорового донора. Состав инкубационной смеси в опытной пробе: 0,2 мл сыворотки крови, 0,4 мл ЭГТА-буфера, 0,02 мл зимозана (1 мг/мл), 0,02 мл взвеси эритроцитов барана (0,72 млн.кл./мл), 0,16 мл вероналового буфера. Состав инкубационной смеси в контрольной пробе (без зимозана): 0,2 мл сыворотки крови, 0,4 мл ЭГТА-буфера, 0,02 мл взвеси эритроцитов барана, 0,18 мл вероналового буфера. Скорость лизиса в опытной пробе 3,9 млн.кл.мин. Скорость лизиса в контрольной пробе равна нулю.

Пример 2. Определение реактивного лизиса у пациента с аллергическим дерматитом при различных концентрациях зимозана. В таблице приведен состав инкубационной смеси (в мл). Концентрация эритроцитов барана (ЭБ) составляет 0,72 млн.кл./мл.

Результаты показывают, что в избранном диапазоне концентрации зимозана реактивный лизис существенно не изменяется. Следовательно, показатель характеризует исследуемую сыворотку крови. Величина показателя у пациента значительно выше, чем у здорового человека.

Предлагаемый способ может быть широко использован в клинической практике, так как прост в исполнении. Процедура включает две стадии: приготовление инкубационной смеси и спектрофотометрию. Время анализа 10-15 мин. Не требуется дорогостоящее оборудование.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости в клинической практике и в научных исследованиях. Задачей изобретения является разработка простого, недорогостоящего способа определения реактивного лизиса клеток. Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости путем воздействия на клетку-мишень комплекса мембранной атаки комплемента и регистрации лизиса согласно изобретению клетки-мишени обрабатывают комплементом в присутствии полимерного инициатора альтернативного пути. Время анализа 10-15 мин. 1 табл.

Способ определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости путем воздействия на клетку-мишень комплекса мембранной атаки комплемента и регистрации лизиса, отличающийся тем, что клетки-мишени обрабатывают комплементом в присутствии полимерного инициатора альтернативного пути.