ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЕ ПОЛОСКИ ДЛЯ ЭКСПРЕССОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППЫ КРОВИ И РЕЗУС-ФАКТОРА БОЛЬНОГО Российский патент 1998 года по МПК G01N33/80 

Идентификационные полоски предназначены для однократного определения группы крови и резус фактора и будут использованы во всех областях медицины (хирургии, травматологии, реаниматологии и др.), связанных с экстренным переливанием эритроцитов и других компонентов крови.

С 1956 года известен способ определения группы крови и резус фактора на карточках, покрытых целлофаном, с высушенными на них тестовыми реактивами [6] Позже в качестве покрытия стали применять поливиниловый спирт, содержащий щавелевую кислоту [3] Неудобство этого метода получения покрытия состоит в первую очередь в том, что поливиниловый спирт выпускается разной молекулярной массы и характеризуется неодинаковой степенью омыления нестабильных ацетатных групп, а также тем, что для получения покрытия необходимо проводить прессование изделия при высокой (135^oС) температуре. Кроме того, эти покрытия на карточках обладали заметной способностью вызывать псевдоагглютинацию (ложное склеивание) эритроцитов. По этой причине в тестовые реагенты, как это указано в [1,2] вводили низкомолекулярный декстран (мол.вес 1700-5000). Однако полностью устранить эти нежелательные свойства покрытий из целлофана и поливинилового спирта не представлялось возможным.

Другим недостатком упомянутого метода определения группы крови на карточках было то, что использованные для этой цели изогемагглютинирующие сыворотки, получаемые от лиц доноров крови, не позволяли добиться высокого уровня антигрупповых антител в тестовом реактиве и поэтому получить четкую и быстро наступающую агглютинацию эритроцитов. Общим недостатком всех вышеперечисленных карточек для определения группы крови и резус фактора является то, что нанесение тестовых реактивов осуществляли точечным путем в одно место. Поэтому высохшая капля тестового реактива плохо удерживается на карточке при длительном ее хранении. Очевидно, указанные недостатки до сих пор не позволили в России наладить серийного производства ни одной из рассмотренных разновидностей карточек.

Идентификационные полоски для определения группы крови и резус фактора больного представляют собой тонкую пластмассовую пластинку (фибровую основу) с размерами 8,5х1,5 см с наклеенными на нее четырьмя квадратами бумаги размером 1,5х1,5 см, на поверхность которых послойно нанесены и высушены полимерное покрытие и тестовый реактив. В качестве тестовых реактивов применяют гипериммунные сыворотки или моноклональные антитела: анти А, анти В, анти резус D специфичности, а также контрольный реактив (без антител). Перед употреблением идентификационную полоску прикрепляют к регистрационной форме и заполняют ее. При работе на каждый квадрат бумаги с высушенными тестовыми реактивами стеклянной палочкой наносят каплю водопроводной воды и перемешивают. После этого палочкой добавляют эритроциты (1/4 1/5 часть от объема реактива), перемешивают и учитывают результат реакции определения группы крови и резус фактора на основании агглютинации (склеивания) эритроцитов в тех квадратах, в которых произошло соединение антигена эритроцитов с антителами тестового реактива.

Способ приготовления идентификационного средства для экспресс-определения группы крови и резус фактора достигается решением нескольких взаимосвязанных задач:
применением полимерного покрытия, отличающегося от ранее использовавшегося на карточках по своей способности не вызывать псевдоагглютирацию и не снижать специфическую агглютинацию эритроцитов, сохранять свои свойства в течение длительного времени;
использованием тестовых реактивов,превосходящих по своей активности на карточках изогемагглютинирующие сыворотки;
равномерным нанесением тестовых реактивов на всю площадь реагирования с эритроцитами, что способствует их длительному хранению;
сохранением идентификационных полосок в течение длительного времени в газо-, водо-, светонепроницаемых пеналах.

В качестве полимерного материала используют суспензию функциональных полимерных частиц, пропитывающих бумагу карточек и образующих на их поверхности эластичную полимерную пленку, не влияющую на специфические свойства сывороток. Отличительной особенностью полимерного покрытия является то, что при пропитывании бумаги полимер и функциональные группы полимера, находящиеся на поверхности частиц суспензии, способны взаимодействовать с функциональными группами целлюлозы (бумаги) как за счет гидрофобного взаимодействия, так и образования ковалентной связи между ними. Это позволяет создать композиционный материал со стандартными свойствами и гарантировать длительное его использование.

Полимерную суспензию получают эмульсионной сополимеризацией бутилакрилата (БА), метилметакрилата (ММА), стирола (СТ), и акриловой кислоты (АК), инициированной персульфатом калия (ПК), в присутствии додецилсульфата натрия в качестве эмульгатора (ДСН).

Общее содержание воды составляло 180-200 мл, а мономеров 135-150 мл, при этом: БА 85-90 мл, ММА 10-15 мл, СТ 35-40 мл, АК 5 мл.

Концентрация ПК составляла 0,5-1,0 г, а ДСН 1-2 г в расчете на мономеры.

Сополимеризацию проводят в присутствии буфера ацетата натрия, в количестве 0,5-0,7 г.

Процесс проводят в реакторе с круглодонным дном, емкостью 1 л, в токе азота, при перемешивании четырехлопастной мешалкой со скоростью 400-600 об/мин, при температуре 60-80^oС
Время проведения сополимеризации мономеров до полной их конверсии составляет 20-24 ч, содержащие остаточного мономера в полимерной суспензии не более 0,05% В процессе реакции суспензия устойчива, коагулюма в конечной полимерной суспензии не содержалось, средний размер частиц суспензии составляет 0,2 мкм, распределение частиц по размерам узкое, D_w/D_n 1,01.

В отличие от ранее использованного покрытие хорошо удерживает высушенные тестовые сыворотки, оно инертно к антителам и не вызывает псевдоагглютинации.

На идентификационных полосках в качестве тестовых реактивов применяют не изогемагглютинирующие сыворотки, как было ранее, а гипериммунные сыворотки. Для их получения доноры-добровольцы подвергаются повторным внутримышечным инъекциям 1-2% -ного стерильного раствора препарата "фруглюмина" групповой субстанции А и В, полученной из слизистой оболочки желудка свиньи и лошади. В результате введения препарата фруглюмина титр антител против группового антигена А и В возрастал в несколько десятков раз. В качестве тестового реактива на идентификационных полосках используют сыворотки иммуных доноров с титром противогрупповых анти А и анти В антител не ниже 1:1000 [5] В качестве реактива антирезус D используют сыворотку лица АВ (IV) группы крови с титром антирезус неполных антител от 1:512 и выше. Сыворотки антирезус забирали от повторно рожавших женщин, сенсибилизированных естественным путем в процессе беременностей. Важно отметить, что в тестовые сыворотки вводили 100 об. 12 мас. раствора декстрана-полиглюкина, чем достигалась активация неполных анти-резус антител, а также улучшалась способность сывороток растворяться в воде при длительном хранении их в высушенном состоянии. Гипериммунные сыворотки, высушенные на идентификационных полосках, показывают достаточно четкую агглютинацию. Гипериммунные сыворотки могут быть заменены моноклональными анти А, анти В, анти резус (D) полными антителами с титром 1:5000 и выше с добавлением 10 об. 12 мас. раствора декстрана полиглюкина.

Технология нанесения покрытия и тестовых реактивов при приготовлении идентификационных полосок существенно отличается от таковой при приготовлении карточек для определения групп крови и резус фактора. Методом полива, использованном при приготовлении идентификационных полосок, достигается равномерное распределение тестового реактива по всей площади, на которой происходит реагирование с эритроцитами. Этот метод, кроме того, позволяет послойно или повторно производить нанесение тестовых реактивов.

Технология получения идентификационных полосок для экспресс определения групп крови складывается из следующих этапов работы.

Первым этапом работы является подготовка гипериммунных сывороток или моноклональных антител перед их нанесением на бумажную ленту и добавление к ним декстрана полиглюкина, гепарина, азида натрия и красителей в обычно принятых количествах.

Вторым этапом работы является нанесение полимерного покрытия, которое осуществляется путем полива бумажной ленты раствором полимерной суспензии на поливочных машинах, осуществляющих также их сушку при 37-40^oС.

Третьим этапом является нанесение на полностью высохшее покрытие тестового реактива гипериммунной сыворотки человека или моноклональных антител анти А, окрашенных в светло-синий цвет смесью метиленовой сини, трипанблау и бриллиантовой сини и их высушивание при 37-40^oС.

Четвертым этапом является продольная нарезка бумажной ленты с нанесенным на нее тестовым реактивом анти А на полосу шириной не менее 15 мм. Наматывание полосы бумаги на бобину и хранение ее помещенной в полиэтиленовый мешок в холодильнике при 6-8^oС в течение некоторого времени.

Пятым этапом является нанесение на бумажную ленту с покрытием тестового реактива гипериммунной сыворотки человека или моноклональных антител анти В, окрашенных в светлорозовый цвет эозином с последующим высушиванием при 37-40^oС.

Шестым этапом является продольная нарезка бумажной ленты с нанесенным на нее тестовым реактивом анти В, на полосу шириной не менее 15 мм. Наматывание полосы бумаги на бобину и хранение ее помещенной в полиэтиленовый мешок в холодильнике при 6-8^oС в течение некоторого времени.

Седьмым этапом является нанесение на бумажную ленту с полимерным покрытием тестового реактива гипериммунной сыворотки человека или моноклональных антител анти резус D, окрашенных в светло-коричневый цвет флюорисцеином в флюорисцеинате с последующим высушиванием при 37-40^oС.

Восьмым этапом является продольная нарезка бумажной ленты с полимерным покрытием и нанесенным на нее тестовым реактивом анти резус D на полосу шириной не менее 15 мм. Наматывание полосы бумаги на бобину и хранение ее помещенной в полиэтиленовый мешок в холодильнике при 6-8^oС в течение некоторого времени.

Девятым этапом является нанесение на бумажную ленту с покрытием неокрашенной неиммунной сыворотки АВ (IV) или культуральной среды без антител для контрольного исследования с последующим высушиванием при 37-40^oС.

Десятым этапом является продольная нарезка бумажной ленты с покрытием и нанесенным на нее контрольным без антител реактивом на полосу шириной не менее 15 мм. Наматывание полосы бумаги на бобину и хранение ее помещенной в полиэтиленовый мешок в холодильнике в течение некоторого времени.

Одиннадцатым этапом является приклеивание к пластмассовой (фибровой) основе продольно полос бумаги с нанесенным покрытием тестовыми и контрольными реактивами в определенном порядке. Сначала с краю наклеивают светло-синюю полосу бумаги с реагентом анти А. Рядом с ней светло-розовую полосу бумаги с реагентом анти В. Рядом с ней идет полоса бумаги светло-коричневого цвета с реагентом анти резус D. Рядом с ней идет полоса неокрашенной бумаги с контрольным без антител реагентом с последующим высушиванием клея при 37-40^oС.

Двенадцатым этапом является поперечная нарезка пластмассовой (фибровой) основы с наклеенными на нее полосами бумаги не менее 15 мм шириной и упаковка в пеналы с закрывающимися герметичными крышками и поглотителями влаги внутри них.

Важным аргументом в пользу возможности осуществления изобретения является факт создания диагностических полос на основе приклеивания к пластмассовой (фибровой) основе полос бумаги с полимерным покрытием и нанесенными тестовыми реактивами, необходимыми для определения группы крови и резус фактора непосредственно у постели больного или при работе в примитивных условиях, приближеннных к чрезвычайным. Предлагаемый способ получения идентификационных полосок отличается высокой технологичностью, возможностью полного исключения ручного труда и получения идентификационных полосок с высокостандартными качествами.

ЛИТЕРАТУРА
1. Авторское свидетельство СССР N 202439, 1967.

2. Авторское свидетельство СССР N 202440, 1967.

3. Авторское свидетельство СССР N 213253, 1968.

4. Пискунова Т.М. Ракитянская А.А. Григорьева Т.Г. Лазаренко Ю.Н. Башлай А.Г. Зотиков Е.А. Получение тестовых сывороток анти А и анти В специфичности методом искусственной иммунизации. Журнал "Лабораторное дело", N 3, 1990, с. 55-60.

5. Патент US N 2770572, 1956.

Идентификационная полоска предназначена для однократного определения группы крови и резус фактора больного. Она может быть использована во всех областях медицины, связанных с экстренным переливанием эритроцитов и других компонентов крови. Средство представляет собой пластмассовую пластинку с наклеенными на нее четырьмя полосками бумаги, на поверхность которых последовательно нанесены и высушены полимерная суспензия и тестовый реактив. Полимерное покрытие при этом получено из суспензии полимерных частиц в воде, образованных гетерофазной сополимеризацией бутилакрилата, метилметакрилата, стирола и акриловой кислоты и наносится на бумагу методом полива с последующей сушкой при температуре 37-40^oС. В качестве тестовых реактивов средство содержит гипериммунные сыворотки человека или моноклональные антитела анти А, анти В, анти резус D специфичности. Предлагаемые идентификационные полоски обладают высокостандартными качествами и позволяют определить группу крови и резус фактор непосредственно у постели больного или при работе в примитивных условиях, приближенных к чрезвычайным. 12 з.п.ф-лы.

1. Средство для экспрессопределения группы крови и резус-фактора, содержащее носитель, полимер и тестовый реактив, отличающееся тем, что оно представляет собой пластмассовую пластинку с четырьмя бумажными полосками на ней, на поверхность которых последовательно нанесены полимерная суспензия и тестовый реактив. 2. Средство по п.1, в котором полимерное покрытие получено из суспензии полимерных частиц в воде, образованных гетерофазной сополимеризацией бутилакрилата (БА), метилметакрилата (ММА), стирола (СТ) и акриловой кислоты (АК). 3. Средство по п.1, в котором массовое соотношение звеньев в полимерном покрытии составляет ММА БА СТ АК 1,0 -1,5 6,0 8,5 2,6 3,5 0,3 0,5 соответственно. 4. Средство по п.1, в котором полимерное покрытие получают гетерофазной сополимеризацией БА, ММА, СТ и АК, инициированной персульфатом калия ПК, в количестве 0,5 1,0 г в расчете на смесь мономеров при 60 80^oС. 5. Средство по п.1, в котором полимерное покрытие получают гетерофазной сополимеризацией БА, ММА, СТ и АК, инициированной ПК, в присутствии додецилсульфата натрия в количестве 1 2 г в расчете на мономеры и ацетата натрия в количестве 0,5 0,7 г в расчете на мономеры. 6. Средство по п.1, в котором полимерное покрытие получают гетерофазной сополимеризацией БА, ММА, СТ и АК, при скорости перемешивания реакционной системы 400 600 об/мин в течение 20 24 ч до содержания остаточного мономера в суспензии не более 0,05%
7. Средство по п.1, в котором полимерное покрытие наносится на бумагу методом полива и высушивается при температуре 37 40^oС. 8. Средство по п.1, которое в качестве тестовых реактивов содержит гипериммунные сыворотки человека или моноклональные антитела анти-A, анти-B, антирезус D специфичности. 9. Средство по п.1, которое имеет размеры пластмассовой пластинки 8,5 • 1,5 см. 10. Средство по п.1, которое содержит бумажные полоски размером 1,5 • 1,5 см. 11. Средство по п.1, в котором пластмассовая пластинка обеспечивает ровную поверхность всех четырех наклеенных на нее полосок бумаги с нанесенным покрытием и тестовым реактивом. 12. Средство по пп.1 и 8, в котором в гипериммунные анти-A, анти-B аллогенные сыворотки с титром полных антител не ниже 1 1000 и антирезус D с титром неполных антител 1 512 и выше вводят 100 об. 12 мас.-ного раствора декстрана-полиглюкина. 13. Средство по пп.1 и 8, в котором тестовыми реагентами являются моноклональные антитела, последние примерно 10-кратно должны превосходить активность гипериммунных сывороток.