ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЕ ПОЛОСКИ ДЛЯ ЭКСПРЕСС ТЕСТА НА ИНДИВИДУАЛЬНУЮ СОВМЕСТИМОСТЬ КРОВИ ДОНОРА И РЕЦИПИЕНТА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/80 

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансфузиологии, и может применяться для экспрессии теста на индивидуальную совместимость крови для донора и реципиента. Предназначены для однократного выполнения у постели больного или в полевых условиях пробы на совместимость между эритроцитами крови донора и сыворотки реципиента. Идентификационные полоски для экспресс теста на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента предполагается использовать во всех областях медицины (хирургия, травматология, реаниматология, акушерство и др.), связанных с переливанием эритроцитов и других компонентов крови.

В 1957 году Эльдоном (K.T. Eldon) были предложены карты для выполнения пробы на совместимость крови донора и реципиента. Карта предусматривала выполнение на целлофановом покрытии реакции агглютинации между сывороткой реципиента и эритроцитами донора, обработанными протеолитическим ферментом - бромелином, а также непрямую пробу Кумбса с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами реципиента. Карты для проведения пробы на совместимость не получили широкого применения в практической медицине в значительной мере в результате того, что целлофановое покрытие показало определенную степень неспецифичности агглютинации эритроцитов.

Идентификационная полоска на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента содержала тонкую пластмассовую пластину (фибровую основу) размером 2,0 см х 8,5 см с наклеенными на нее четырьмя квадратами бумаги размером 2,0 см х 2,0 см, на которые послойной нанесено и высушено полимерное покрытие, полученное на основе сополимеризации акрилатов, инертное в отношении эритроцита и антител, и реагенты, способствующие соединению антитела сыворотки с антителом эритроцитов. В качестве реагента используют 12 мас.% раствор декстрана (полиглюкина) на втором квадрате бумаги. На третьем квадрате бумаги помещают 2 - 3 мас.% раствора протеолитического фермента фицина. На четвертом квадрате бумаги располагают антиглобулиновую сыворотку для пробы Кумбса с активностью антител не ниже титра 1:64. Первый квадрат бумаги используют без реагента для выявления на нем полных антител реципиента. Перед употреблением идентификационную полоску прикрепляют (приклеивают) к регистрационной форме и заполняют ее, указывая ФИО больного и донора, их группы крови и резус-принадлежность, ФИО врача, производившего исследование, дату проведения анализа и др. Далее пипеткой или стеклянной палочкой на первые три квадрата бумаги наносят по одной небольшой капле примерно 20 - 30% взвеси донорских эритроцитов в собственной плазме или сыворотке рядом с каплей высушенного реагента и перемешивают только на третьем квадрате бумаги. После этого спустя 2 - 3 минуты добавляют примерно 0,08 мл сыворотки реципиента на каждый из трех квадратов бумаги, тщательно перемешивают каплю взвеси эритроцитов, сыворотки реципиента, реагент и распределяют равномерным слоем по всей площади каждого квадрата бумаги.

Количество исследуемой сыворотки должно в 5 - 10 раз превосходить количество добавляемых эритроцитов. Три минуты полоску покачивают и наблюдают за изменением в агрегации эритроцитов. Учет результатов реакции осуществляют невооруженным глазом через 5 минут. Появление агглютинации эритроцитов на любом квадрате бумаги указывает на несовместимость сыворотки больного с эритроцитами донора. Последнее служит противопоказанием для переливания эритроцитарной массы или других компонентов крови от донора, с эритроцитами которого было проведено исследование.

Подтверждающей реакцией служит исследование с антиглобулиновой сывороткой. Для этого на квадрат бумаги с высушенной каплей антиглобулиновой сыворотки добавляют пипеткой равный объем 5 - 10% взвеси донорских эритроцитов в физиологическом растворе, предварительно инкубированных 20 - 30 минут при 37^oC с сывороткой реципиента и трехкратно отмытых физиологическим раствором путем центрифугирования. Наличие агглютинации эритроцитов с антиглобулиновой сывороткой укажет на наличие у реципиента неполных антител и невозможность осуществления гемотрансфузии от донора, с эритроцитами которого было проведено исследование. Только отсутствие агглютинации во всех четырех пробах, выполненных на идентификационной полоске для проведения пробы на индивидуальную совместимость, укажет на соответствие эритроцитов крови донора с сывороткой реципиента. После записи результатов пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента в регистрационную форму врач может приступить к выполнению биологической пробы на совместимость.

Технология приготовления идентификационных полосок для экспресс теста на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента складывается из следующих этапов работы:
1. Приготовление смеси полимеров для нанесения покрытия и реагентов для экспресс теста на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента с добавлением к последним гепарина, азида натрия в обычно принятых количествах. Полимерную суспензию (покрытие) получают эмульсионной сополимеризацией бутилакрилата (БА), метаметилакрилата (ММА), стирола (СА) и акриловой кислоты (АК), инициированной персульфатом калия (ПК), в присутствии додецилсульфата натрия в качестве эмульгатора (ДСН).

Общее содержание воды составило 180 - 200 мл, а мономеров 135 - 150 мл, при этом БА - 85 - 90 мл, ММА 10 - 15 мл, СТ 35 - 40 мл, АК 5 мл.

Концентрация ПК составляла 0,5 - 1,0 г, а ДСН 1 - 2 г в расчете на мономеры.

Сополимеризацию проводят в присутствии буфера - ацетата натрия в количестве 0,5 - 0,7 г.

Процесс проводят в реакторе с круглодонным дном емкостью 1 л в токе азота, при перемешивании четырехлопастной мешалкой со скоростью 400 - 600 об/мин, при температуре 60 - 80^oC.

Время проведения сополимеризации мономеров до полной их конверсии составляет 20 - 24 ч, содержание остаточного мономера в полимерной суспензии не более 0,05%. В процессе реакции суспензия устойчива, коагулюма в конечной полимерной суспензии не содержалось, средний размер частиц суспензии составляет 0,2 мкм, распределение частиц по размерам узкое, D/D = 1,01.

2. Нанесение покрытия, которое осуществляется путем полива бумажной ленты раствором полимерной суспензии на поливочных машинах, осуществляющих также его сушку при температуре 37 - 40^oC [3].

3. Нанесение на полностью высохшее полимерное покрытие методом полива приблизительно 0,04 - 0,06 мл/см реагента 11 - 13 мас.% раствора декстрана - полиглюкина и высушивание его при 37 - 40^oC.

4. Продольная нарезка бумажной ленты с нанесением на нее и высушенным полимерным покрытием и раствором декстрана - полиглюкина на полосу шириной 2,0 см. Наматывание полосы бумаги с полимерным покрытием и реагентом на бобину и хранение ее в полиэтиленовом мешке в холодильнике при 6 - 8^oC.

5. Нанесение методом полива на полностью высохшее полимерное покрытие приблизительно 0,04 - 0,06 мл/см реагента 2 - 3 мас.% раствора протеолитического фермента - фицина в физиологическом растворе и высушивание при комнатной температуре +18^oC.

6. Нарезка бумажной ленты с нанесением на нее и высушенным полимерным покрытием и раствором протеолитического фермента - фицина на полосу шириной 2,0 см. Наматывание полосы бумаги с полимерным покрытием и реагентом на бобину и хранением ее в полиэтиленовом мешке в холодильнике при 6 - 8^oC.

7. Нанесение прежним способом на полностью высохшее покрытие приблизительно 0,04 - 0,06 мл/см реагента - антиглобулиновой сыворотки для пробы Кумбса с активностью антител не ниже титра 1:64 и высушивание его при 37 - 40^oC.

8. Нарезка бумажной ленты с нанесением на нее и высушенным полимерным покрытием и антиглобулиновой сыворотки на полосу шириной 2,0 см.

Наматывание полосы бумаги с полимерным покрытием и реагентом на бобину и хранение ее в полиэтиленовом мешке при 6 - 8^oC.

9. Наклеивание на пластмассовую ленту (фибровую основу) в продольном направлении параллельно друг другу сначала полосы бумаги с полимерным покрытием без реагента, рядом полосы бумаги с высушенным декстраном - полиглюкином, рядом полосы бумаги с высушенным фицином, затем полосы бумаги с высушенной антиглобулиновой сывороткой, прикатка и высушивание при комнатной температуре +18^oC.

10. Поперечная нарезка пластмассовой ленты (фибровой основы) с накленными на нее полосками бумаги на полоски шириной 2,0 см, запаивание их в пакеты из газо-, водо-, светонепроницаемой ламинированной фольги или упаковки их в пеналы с герметично закрывающимися крышками и поглотителями влаги внутри них и хранение в бытовом холодильнике при 6 - 8^oC в течение 2 лет.

Пример 1. Больная Ма - на A/II/ rh- имела трансфузионное осложнение в результате переливания эритроцитов A//II Rh+. Обычные пробы на совместимость на плоскости были отрицательными. Испытание сыворотки больной с эритроцитами крови A//II/ Rh+ на полоске для экспресс теста на индивидуальную совместимость, полученной описанным выше способом, показало положительный результат в ферментной и антиглобулиновой пробах. Исследование сыворотки больной с последовательными разведениями ее физиологическим раствором 1 : 2,1 : 4 и т. д. в непрямой пробе Кумбса выявило слабые неполные анти D антитела в титре 1 : 16.

Пример 2. У больной М - ва A/II rh развилось трансфузионное осложнение в ответ на переливание A/II Rh+ крови. Обычные пробы на совместимость на плоскости были отрицательными. Сыворотка больной на идентификационной полоске на совместимость показала положительный результат в декстрановой, ферментной и антиглобулиновой пробах с эритроцитами A/II D+. Анализ сыворотки больной в отношении панели эритроцитов с разновидностями антигенов системы резус показал наличие в ней неполных анти E антител в титре 1 : 16.

Предлагаемый способ получения идентификационных полосок для экспресс теста на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента отмечается высокой технологичностью, возможностью полного исключения ручного труда и получения идентификационных полосок на индивидуальную совместимость с высокостандартным качеством.

Средство может быть использовано в медицине. Средство содержит носитель - пластмассовую пластинку, полимер и реагенты. В качестве реагентов используются 12 мас. % раствор декстрана (полиглюкина), 2-3 мас. % раствор протеолитического фермента - фицина и антиглобулиновая сыворотка с активностью не ниже титра антител 1: 64. Раствор полиглюкина и антиглобулиновую сыворотку наносят на бумагу с полимерным покрытием методом полива и высушивают при 37-40^oС. Раствор фицина высушивают при 18^oС. Средство обеспечивает повышение точности и сокращение времени тестирования. 1 з.п.ф-лы.

1. Средство для экспресс теста на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента, содержащее носитель, полимер и реагент, отличающееся тем, что оно содержит пластмассовую пластинку с четырьмя наклеенными на нее бумажными квадратами, на поверхность которых последовательно нанесены полимерная суспензия и далее на три бумажных квадрата - три реагента, обеспечивающие агглютинацию эритроцитов донора крови сывороткой реципиента при наличии в ней полных или неполных антител. 2. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве реагентов оно содержит 12 мас.% раствора декстрана (полиглюкина), 2 - 3 мас.% раствора протеолитического фермента - фицина и антиглобулиновую сыворотку с активностью не ниже титра антител 1 : 64, причем раствор полиглюкина и антиглобулиновую сыворотку наносят на бумагу с полимерным покрытием методом полива и высушивают при 37 - 40^oC, раствор фицина - при 18^oC.