СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 1998 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицинской промышленности.

Известно, что в растительном сырье содержится много различных ферментов. Известны способы выделения из растительного сырья каталазы [1] пероксидазы [2, 3] суперксиддисмутазы [4] Эти способы включают, как правило, гомогенизацию растительного сырья, экстракцию, подходящим растворителем, гельфильтрацию, хромотографию. Все эти способы с относительно невысоким выходом позволяют выделить один фермент. Известен способ выделения супероксиддисмутазы (СОД) из культуры ткани раувольфии змеиной [5] включающий гомогенизацию ткани и экстракцию белка, дифференциального центрифугирования, очистку гель-фильтрацией на сефадексе доочистку на ионообменнике, рехромотографию на сефадексе. Способ достаточно сложен и позволяет выделить СОД с относительно невысоким выходом.

Наиболее близок к предлагаемому способ выделения ферментного комплекса, содержащего СОД, каталазу и пероксидазу, из биомассы культивируемых растительных клеток женьшеня и полисциасса [6] Способ состоит из следующих стадий: экстракция водно-спиртовым раствором, гомогенизация, центрифугирование, деалкоголизация, гельфильтрация и лиофилизация. Недостатки способа: недостаточно высокая активность ферментов, в частности СОД, кроме того, способ требует проводить непрерывно во времени экстракцию, гомогенизацию и центрифугирование. Плохо масштабируется.

Задача изобретения увеличение активности выделяемого ферментного комплекса при одновременном эффективном масштабировании.

Задача изобретения реализуется предлагаемым способом, включающим экстрагирование, биомассы культуры клеток, гомогенизацию, центрифугирование, гельфильтрацию и лиофилизацию, причем перед экстракцией биомассу замораживают до (-14^oC) (-18^oC), затем экстрагируют при 3 6^oC, после гомогенизации еще раз экстрагируют при той же температуре и перед гельфильтрацией проводят дополнительную лиофилизацию.

Используемая в процессе получения ферментного комплекса биомасса культуры растительных клеток обладает низкой механической устойчивостью, чувствительна к контаминации микроорганизмами, а также способностью быстро окисляться под действием кислорода воздуха. Из-за этого транспортировка и хранение этого сырья требует специальных условий. Оказалось, что если биомассу заморозить, то при этом не изменяется состав выделяемого ферментного комплекса, можно ее хранить и использовать по мере надобности.

Экстрагирование, проводимое при низкой температуре, тоже позволяет хранить экстракт несколько дней, после гомогенизации можно также прервать процесс и хранить гомогенизат.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

30 навесок по 500 г культуры ткани женьшеня (штамм ИФРЖ-1) взяли для определения оптимальных параметров разработанного процесса. На первом этапе провели замораживание ткани. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.

На следующем этапе к замороженной ткани добавили 500 мл этилового спирта (96^o) и хранили при низкой температуре. Результаты экспериментов представлены в табл. 2.

На следующем этапе проводили гомогенизацию ткани при 3000 об/мин в течение 2 мин. Полученный гомогенат хранили при низкой температуре. Результаты эксперимента представлены в табл. 3.

Полученный гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин.

За процессом выделения ферментного комплекса следили по удельной активности СОД в надосадочной жидкости, которая составляла 28,3 + 1,7 усл.опт.ед. Надосадочную жидкость лиофилизировали, полученный осадок растворяли в 50 мл фосфатного буфера 0,01 М, pH 7,2. Удельная активность СОД полученного раствора составила 422,5 ± 2,7 усл.опт.ед/мл. Весь объем полученного раствора (50 мл) наносили на хроматографическую колонку (500x40 мм) с молселектом Г-25 и элюировали фосфатным буфером 0,01 М, pH 7,2. Собирали фракции с удельной активностью не менее 20 усл.опт.ед./мл. которые объединили и лиофилизировали.

Потеря активности фермента составила 19%
В лиофилизированной пробе определяли удельную активность СОД, которая составила 27,8 ± 2,1 усл.опт.ед./мг белка.

По прототипу 20,0 ± 1,8 усл.опт.ед./мг белка.

Активность каталазы и пероксидазы по предлагаемому способу, по сравнению с прототипом, изменилась незначительно:
удельная активность каталазы 0,13 ± 0,05 мМ H₂O₂/мин. мг белка
удельная активность пероксидазы 0,65 ± 0,05 усл.опт.ед./мг белка.

Пример 2.

10 кг биомассы женьшеня штамма ИФРЖ-5 заморозили при (-16^oC), на следующий день к замороженной культуре добавили 10 л этилового спирта (96^o) и оставили на сутки при температуре 4^oC. Смесь гомогенизировали частями по 1л при 3000 об/мин в течение 2 мин и хранили при температуре 4^o в течение суток. Гомогенат центрифугировали по частям по 4 л 30 мин при 3000 об/мин. Удельная активность СОД в надосадочной жидкости составила 28,1 ± 2,3 усл.опт. ед./мл.

Надосадочную жидкость лиофилизировали, полученный порошок взвесили и разделили на 20 частей, каждая из которых затем последовательно была растворена в 50 мл фосфатного буфера 0,01 М, pH 7,2 и хроматографически очищали на колонке (500x40 мм) с молселектом Г-25, при этом были собраны фракции с удельной активностью СОД не менее 20 усл.опт.ед./мл. Полученные фракции объединили и лиофилизировали.

Потеря активности фермента составила 22%
Удельная активность СОД в лиофилизированной пробе составила 26,9 ± 2,3 усл.опт.ед./мг белка.

Были проведены опыты по выделения ферментного комплекса из биомассы культуры ткани селективного штамма женьшеня IX-13 (ВСККК N 26) активность СОД 26,2 ± 1,4 усл.опт.ед./мг белка и штамма полисциасса папортниколистного (ВСКККВР N 24), активность СОД 23,6 ± 1,2 усл.опт.ед./мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить активность ферментного комплекса по СОД на 27 30% способ более технологичен, так как процесс можно прервать на любой стадии без потери активности, прекрасно масштабируется.

Источники информации
1. Stansell M.J. Dtutsh H. F. J. Biol. Chem. 240, 11, 4299, 1965.

2. ЧССР, авт. св. N 237669 от 13.09.85. C 12 P 9/08 "Способ получения пероксидазы".

3. РФ, патент N 2031946 от 27.03.94, C 12 P 9/08, БИ 5-95 "Способ получения пероксидазы из растительной ткани полыни".

4. НРБ, авт.св. N 38722 от 28.02.86, C 12 P 9/04 "Способ получения СОД"
5. СССР, авт. св. N 1540270 от 24.11.88, C 12 N 9/02 "Способ выделения СОД".

6. РФ, патент N 2046140 от 8.07.92, C 12 N 9/02, ПБ N 29-95 "Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток".

Использование: биотехнология, может найти применение в медицинской промышленности. Сущность изобретения: способ предусматривает водно-спиртовую экстракцию биомассы, замороженной до (-14^oC) - (-18^oC), при температуре 3 - 6^oC, гомогенизацию, отделение осадка центрифугированием и лиофилизацию растворимой фракции. Полученный осадок растворяют в 0,01 М фосфатном буфере и проводят гельхроматографическую очистку с молселектом Г-25, элюцию 0,01 М фосфатным буфером, активные фракции объединяют и лиофильно высушивают. Предлагаемый способ позволяет увеличить активность выделяемого комплекса по СОД на 27 - 30%, способ технологичен за счет того, что его можно прервать на любой стадии без потери активности, прекрасно масштабируется. 3 табл.

Способ выделения и очистки ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток, предусматривающий водно-спиртовую экстракцию биомассы культуры клеток, гомогенизацию, отделение осадка центрифугированием, гельфильтрацию растворимой фракции и элюцию 0,01М фосфатным буфером, объединение активных фракций и лиофилизацию, отличающийся тем, что исходную биомассу замораживают до -14^o -18^oС, водно-спиртовую экстракцию проводят при 3 6^oС, перед гельфильтрацией растворимую фракцию лиофилизируют и растворяют полученный осадок в 0,01М фосфатном буфере.