НАБОР ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/579 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии. Может быть использовано в научных исследованиях, а также в практике здравоохранения, ветеринарии для выявления микобактерий туберкулеза.

Известны флуоресцентные красители для диагностики кислотоустойчивых микобактерий и включающие следующие флуорохромы и гасители фона: Аурамин О - перманганат калия [1] Аурамин О акридиновый оранжевый [2] Аурамин О - Родамин В перманганат калия [3]
Прототип: наиболее близок к предлагаемому комплекс реагентов для окраски микобактерий по ВОУ [4] водный раствор красящей смеси, включающей аурамин О
родамин С и водный раствор гасителя фона метиленового синего.

Вышеназванные в качестве аналогов и прототипа комплексы флуорохромов пригодны для выявления типичных микобактерий, однако они имеют следующие недостатки. Аналоги [1, 2, 3] характеризуются недостаточной избирательностью. В связи с тем, что в условиях интенсивной химиотерапии и других воздействий микобактерии претерпевают существенные морфологические и метаболические изменения, многие палочковидные микробные клетки не адсорбируют в достаточной мере флуорохромы или обесцвечиваются при дифференциации смесью спирта и соляной кислоты. Кроме того, зернистые формы, отдельные L-варианты микобактерий не адсорбируют традиционно применяемые флуорохромы в той степени, которая обеспечивает их микроскопическое и микрофотографическое выявление.

К недостаткам прототипа относятся: невозможность выявления ультрамелких (<0,2 мкм) форм микобактерий клетки. Помимо этого используемый в прототипе в качестве гасителя фона метиленовый голубой (КДМ) снижает специфическое свечение, не обеспечивает контрастного изображения нетуберкулезных микроорганизмов грибковой флоры клеток бронхиального эпителия.

Цель изобретения создание набора красителей, позволяющих повысить избирательность, специфическое свечение, обеспечить надежную выявляемость морфологически измененных форм (зернистых, ультрамелких, L-форм), а также обнаруживать мелкоструктурные элементы возбудителя на ранних стадиях нормального деления микобактериальной клетки.

Поставленная цель достигается тем, что используют набор красителей, содержащий в качестве красящей смеси аурамин и родамин С лазерной чистоты или аурамин и родамин 4С лазерной чистоты, а в качестве гасителя фона используют следующие феноксазиновые красители: перхлорат 3,6-диэтиламинофеноксазония (оксазин-1 перхлорат, OH-120) или цинковую соль 3,6-диэтиламинофеноксазония (оксазин-1 цинковая соль, OH-121) или ацетат 5-амино-9-диэтиламинобензо/а/феноксазония (нильский синий ацетат, OH-111) или изобутират 5-амино-9-диэтиламинобензо/а/феноксазония (нильский синий изобутират, OH-112) лазерной чистоты в виде водных растворов при следующих соотношениях компонентов, г/л:
Аурамин 0,5 5,0
Родамин С или 4С 0,02 0,4
Дистиллированная вода Остальное до 1 л
Гаситель фона: оксазин-1 перхлорат или оксазин-1 цинковая соль, или нильский синий ацетат, или нильский синий изобутират 0,01 0,6
Дистиллированная вода Остальное до 1 л
К предлагаемым красителям наряду с обычными требованиями химической чистоты предъявляли требования "лазерной чистоты", принятые для люминесцирующих генерирующих красителей [5] При этом в красителях контролировали содержание примесей, поглощающих в области люминесценции, путем измерения коэффициента молярной экстинкции на фиксированной для каждого красителя длине волны (ε_к) аналогично описанному в [5]
Аурамин (МА-1) получали сплавлением 80 г хлористого цинка, 80 г хлористого аммония, 80 г кетона Михлера при 200^oC и постоянном перемешивании в течение 24 ч. Плав охлаждали, растирали, перемешивали с 800 мл воды, фильтровали. Краситель, выпавший из фильтрата после высаливания его хлоридом натрия, фильтровали, сушили. Аурамин лазерной чистоты имеет в этаноле спектральные характеристики: λgjuk&макс.

Родамин С (PH-55) и родамин 4С (PH-56) получали из соответствующих технических красителей путем очистки переосаждением из водно-спиртового раствора соляной кислотой. Родамин С и родамин 4С лазерной чистоты имеют в этаноле: λgjuk&макс.

5-Амино-9-диэтиламинобензо/а/феноксазоний ацетат (нильский синий ацетат, OH-111) получали из 0,5 г основания нильского синего в 50 мл толуола с добавлением 0,1 г уксусной кислоты. Раствор охлаждали, выпавший краситель отфильтровывали, промывали петролейным эфиром, сушили. 5-Амино-9-диэтиламинобензо/а/феноксазоний изобутират (нильский синий изобутират, OH-112) получали аналогично из 0,2 г основания нильского синего и 0,05 г изомасляной кислоты. Нильский синий ацетат и нильский синий изобутират лазерной чистоты имеют в этаноле: λпогл.макс.

Перхлорат 3,6-диэтиламинофеноксазония (оксазин-1 перхлорат, OH-120) и цинковую соль 3,6-диэтиламинофеноксазония (оксазин-1 цинковая соль, OH-121) получали из 5,4 г м-диэтиламиноанизола, 6,3 мл конц. соляной кислоты и 6,3 мл спирта. К этой смеси при перемешивании и охлаждении льдом с солью до 0 - 3^oC прибавляли раствор 3,2 г нитрата натрия в 6,3 мл воды, перемешивали 1 ч и прибавляли порциями к кипящему раствору 4,3 г м-диэтиламинофенола в 8,6 мл спирта, перемешивали 15 мин, добавляли 8 мл хлорной кислоты (для OH-120) или 8 г хлористого цинка (для OH-121), выпавший краситель отфильтровывали, а затем очищали перекристаллизацией из этанола. Оксазин-1 перхлорат и оксазин-1 цинковая соль лазерной чистоты имеют в этаноле: λпогл.макс.

Сущность изобретения поясняется примерами и таблицей.

Пример 1.

Готовят 2 водных раствора красителей. Первый раствор представляет собой водный раствор красящей смеси из аурамина и родамина С, содержащий 5 г/л первого их них и 0,4 г/л второго красителя. Второй раствор содержит 0,6 г оксазина-1 цинковой соли (OH-121) в 1 л воды (таблица, пример 1).

Фиксированные в сухожаровом шкафу мазки (75^oC, 2 ч) заливают раствором красящей смеси аурамин-родамин на 30 мин. Затем промывают дистиллированной водой, обесцвечивают 3%-ным солянокислым спиртом в течение 3 5 мин, докрашивают раствором гасителя фона оксазина в течение 10 15 с. Мазки высушивают, микроскопируют в ультрафиолетовом свете в микроскопе с объективом 40^x, окуляры 4^x или 5^x. Микобактерии туберкулеза и их зернистые и ультрамелкие варианты окрашиваются в оранжево-рубиновый цвет, шарообразные варианты L-формы окрашиваются в апельсиново-желтый цвет.

При обработке диагностического материала щелочами и щелочными детергентами для выравнивания pH к 1 мл посевного осадка добавляют 0,1 мл 5%-ного раствора соляной кислоты. При обработке диагностического материала 1%-ным раствором соляной кислоты для выравнивания pH к 1 мл посевного осадка добавляется 0,1 мл 40%-ного раствора KOH.

Примеры 2 19. Водные растворы готовили аналогичным образом и испытывали по аналогичной примеру 1 методике. Состав компонентов, их соотношение и результаты испытаний представлены в таблице.

Как видно из таблицы, использование водных растворов красящей смеси, состоящей из аурамина и родамина С или аурамина и родамина 4С лазерной чистоты, а в качестве гасителя фона использование водных растворов цинковой соли оксазина-1 или перхлората оксазина-1, или ацетата нильского синего, или изобутирата нильского синего лазерной чистоты в представленных соотношениях (примеры 1 18) позволяют обнаружить по сравнению с прототипом (пример 19) мелкие и ультрамелкие формы микобактерий туберкулеза, а также обнаружить деление микробной клетки.

Таким образом, предлагаемый набор красителей для диагностики туберкулеза позволяет выявлять мелкие и ультрамелкие (<0,2 мкм ) формы микобактерий, обнаруживать деление микробной клетки, существенно расширить возможности флуоресцентного метода выявления не только типичных, но и морфологически измененных микобактерий, создать оптимальные возможности для микроскопирования и микрофотографирования возбудителя туберкулеза.

Источники информации
1. Blaiz E. B. Weiser O.L. Tull A.H. Mycrobacteriology Laboratory Methods. Lab. Report. US Army Medical Research and Nutrion Laboratory. Denver. 1969. 235 P.

2. Smithwick R.W. David H.L. Acridin orange as a fluorescent counterstein with the auramine acid-fast stein. Tubercle. 1971. N 52. P. 226 - 231.

3. Traunt I.P. Brett W.A. Thomas W. Fluorescence microscopy of rtubercle bacilli steined with auramine and rhodamine. Henry Ford Hosp. Med. Bull. 1962. N 10. P. 3287 296.

4. Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза. Методические рекомендации. М. 1992, с. 7 9.

5. Дудкин В.С. Коган Б.Я. Галов А.П. Саввина Л.П. Тез.докл. III Всесоюз. конф. "Лазеры на основе сложных органических соединений и их применение". Ужгород, 1980, с. 177 179.

Использование: микробиология, диагностика, туберкулез, флуоресцентный анализ. Сущность изобретения: предложен набор для флуоресцентного выявления микобактерий туберкулеза, состоящий из красящей смеси, включающей аурамин лазерной чистоты и родамин С или родамин 4С лазерной чистоты, взятые в массовом соотношении 12:1 - 25:1 соответственно, а также гаситель фона, включающий феноксазиновый краситель перхлорат 3,6-диэтиламинофеноксазония или цинковую соль 3,6-диэтиламинофеноксазония или ацетат 5-амино-9-диэтиламинобензо/а/феноксазония или изобутират 5-амино-9-диэтиламинобензо/а/феноксазония лазерной чистоты. Диагностический набор позволяет выявлять мелкие и ультрамелкие формы микобактерий, обнаруживать деление микробной клетки и существенно расширяет возможности флуоресцентного метода выявления не только типичных, но и морфологически измененных микобактерий. 1 табл.

Набор для флуоресцентного выявления микобактерий туберкулеза, включающий красящую смесь из аурамина и родамина и гаситель фона, отличающийся тем, что красящая смесь содержит аурамин лазерной чистоты, из родаминов родамин C или родамин 4C лазерной чистоты, взятые в массовом соотношении 12 1 25 1 соответственно, а в качестве гасителя фона феноксазиновой краситель перхлорат 3,6-диэтиламинофеноксазония, или цинковую соль 3,6-диэтиламинофеноксазония, или ацетат 5-амино-9-диэтиламинобензо(а)феноксазония, или изобутират 5-амино-9-диэтиламинобензо(а)феноксазония лазерной чистоты.