СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ИЗМЕНЕННЫХ ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 G01N33/483 G01N33/50 

Изобретение относится к области микробиологии, касается способа выявления морфологически измененных форм микобактерий туберкулеза (МБТ) и может быть использовано при диагностике туберкулеза.

Известен способ выявления измененных, преимущественно L-форм МБТ методами посева и фазово-контрастной микроскопии с использованием щадящей обработки патологического материала и элективных полужидких или жидких питательных сред, содержащих нативные белки и осмотические стабилизаторы (1,2). Недостатки - трудоемкость, сложность и длительность. Процесс индикации L-форм МБТ с последовательной предварительной обработкой патологического материала, посевом на элективные питательные среды и приготовлением содержащих нефиксированные МБТ, препаратов патологического материала для последующей фазово-контрастной микроскопии длительный (2,5-3 месяца), сложный, трудоемкий, требующий использования специальных питательных сред очень сложного композиционного состава. Кроме того, работа с нефиксированными МБТ опасна для персонала.

Известен также способ выявления измененных форм МБТ сравнительной люминесцентной микроскопией парных мазков-отпечатков, один из которых обрабатывается дезинтегрирующим раствором (3). Недостатки - трудоемкость и сложность.

Люминесцентная бактериоскопия с целью выявления измененных форм МБТ - процесс трудоемкий из-за необходимости просмотра двух препаратов парных мазков-отпечатков из каждой пробы патологического материала, требующий применения сложного, многокомпонентного дезинтегрирующего раствора для обработки мазков-отпечатков. Кроме того, известный способ не предусматривает возможность одновременного выделения и изучения культур МБТ вследствие необходимости дополнительной обработки патологического материала, ранее уже использованного для приготовления мазков-отпечатков.

В качестве прототипа рассматривается способ выявления МБТ и их морфологически измененных форм (зернистых, ультрамелких, L-форм) люминесцентной микроскопией с предварительной обработкой патологического материала щелочами, щелочными детергентами или соляной кислотой и соответствующей подготовкой препаратов для люминесцентной микроскопии - мазок фиксируют, окрашивают флуорохромами лазерной чистоты (аурамином, родамином, гасителем фона). Техника люминесцентной микроскопии - объектив 40^х, окуляры 5^х, иммерсия не предусматривается (4).

Известный способ позволяет в короткий срок выявлять в патологическом материале типичные бактериальные и морфологически измененные формы МБТ, однако приготовление мазков из предварительно обработанного патологического материала - процесс сложный и трудоемкий из-за необходимости коррекции и выравнивания рН, а применение "жестких" реагентов для обработки патологического материала не обеспечивает щадящего выделения из патологического материала морфологически измененных форм МБТ в процессе его обработки.

Недостатки известных способов затрудняют проведение ранней диагностики туберкулеза и могут привести к отрицательным результатам при наличии в патологическом материале небольшого количества возбудителя.

Цель изобретения - повышение эффективности при упрощении и снижении трудоемкости.

Поставленная цель достигается обработкой патологического материала 0,1%-ным раствором препарата "Лесептик" и люминесцентной микроскопией мазков с масляной иммерсией с объективом не менее 90^х и окулярами 5^х.

Дезинфекционное средство "Лесептик" (свидетельство о государственной регистрации Р 082-0049/6 от 09.08.2000 г.) представляет собой прозрачную жидкость от бесцветного до желтого цвета со специфическим запахом, содержит в качестве действующих веществ алкилдиметилбензиламмоний хлорид, монотерпеновые соединения, ПАВ-эмульгаторы и изопропанол при оптимальном соотношении, обладает антимикробным действием в отношении бактерий и грибов родов кандида и трихофитон, а также плесневых грибов (5).

Способ осуществляется следующим образом. Патологический материал смешивают с 0,1%-ным раствором дезинфекционного средства "Лесептик" в равных объемах, оставляют при комнатной температуре на 18-24 ч. Субстрат для приготовления мазка готовят центрифугированием экспозиционной смеси, наносят на предметное стекло без коррекции рН, фиксируют и окрашивают флуорохромами лазерной чистоты и проводят люминесцентную микроскопию с масляной иммерсией с объективом не менее 90^х и окулярами 5^х.

Сущность изобретения заключается в обработке патологического материала дезинфекционным средством "Лесептик" концентрацией 0,1% смешиванием в равных объемах в течение 18-24 ч при комнатной температуре с последующей люминесцентной микроскопией мазка с помощью масляной иммерсии с объективом не менее 90^х, окулярами 5^х.

На основании проведенных исследований по источникам патентной и научно-технической литературы можно сделать вывод, что совокупность существенных признаков является новой и позволяет повысить эффективность вследствие максимального высвобождения бактериальных и измененных форм МБТ без их повреждения, а также возможности последующего использования субстрата для выделения культуры МБТ методом посева и упростить способ вследствие исключения необходимости коррекции рН в процессе приготовления мазков, т.к. субстрат для приготовления мазков, полученный после обработки патологического материала, имеет нейтральную среду (рН 7,0).

Сущность способа поясняется примерами
Пример 1. Для обработки патологического материала готовят 0,1%-ный раствор дезинфекционного средства "Лесептик" смешиванием 1 мл концентрата с дистиллированной водой до 1000 мл. Патологический материал в специальных флаконах заливают 0,1%-ным раствором "Лесептика" в объемном соотношении 1:1, гомогенизируют на встряхивателе и оставляют при комнатной температуре на 18-24 ч, после чего экспозиционную смесь центрифугируют, субстрат наносят на предметное стекло. Мазок фиксируют, окрашивают флуорохромами лазерной чистоты - аурамином, родамином и гасителем фона и просматривают на люминесцентном микроскопе с масляной иммерсией. Объектив - 90^х, окуляры - 5^х.

Пример 2. Проводят выявление измененных форм МБТ в патологическом материале от обследуемых и больных туберкулезом (мокроте, бронхоальвеолярном лаваже, отделяемом верхних дыхательных путей) предлагаемым способом в сравнении с прототипом. Пробы патологического материала обрабатывают, а выявление измененных форм МБТ в соответствии с предлагаемым способом проводят, как в примере 1. В соответствии с прототипом патологический материал обрабатывают 10%-ным раствором тринатрия фосфата с коррекцией рН мазков соляной кислотой, мазки окрашивают флуорохромами лазерной чистоты и просматривают на люминесцентном микроскопе, объектив 40^х, окуляры 5^х. Результаты представлены в таблицах 1,2, 3, 4.

Как видно из таблицы 1, эффективность выявления бактериальных измененных форм МБТ предлагаемым способом в 2,5 раза выше, чем известным способом, что обусловлено увеличением (в 5,7 раза) количества проб, в которых выявлены только измененные формы МБТ.

Как видно из таблицы 2, предлагаемый способ обеспечивает более эффективное выявление измененных форм МБТ независимо от морфологических характеристик. Так, эффективность выявления зернистых форм выше в 3,1 раза, мелких форм в 1,6 раза, L-форм в 4 раза по сравнению с прототипом.

Как видно из таблицы 3, эффективность выявления измененных при отсутствии бактериальных форм МБТ предлагаемым способом в 5,7 раза выше, чем известным способом. Предлагаемый способ дополнительно позволяет выявлять измененные формы МБТ в 142 пробах, что составляет 2,3% от общего количества исследованных проб, тогда как известный способ позволяет выявлять измененные формы МБТ при отсутствии бактериологических в 30 пробах, что составляет лишь 0,43% от общего количества исследованных проб.

Как видно из таблицы 4, предлагаемый способ обеспечивает более эффективное выявление измененных при отсутствии бактериальных форм МБТ независимо от их морфологических характеристик и возможных сочетаний по сравнению с прототипом (в 3,3-8 раз со статистическим подтверждением разницы).

Проведенные исследования подтвердили эффективность предлагаемого способа при его упрощении. Так, эффективность выявления измененных при наличии бактериальных форм МБТ в 2,5, а эффективность выявления измененных при отсутствии бактериальных форм МБТ в 5,7 раза выше по сравнению с прототипом, что обеспечивает раннюю диагностику бактериовыделения у больных туберкулезом, а трудоемкость снижается из-за отсутствия необходимости коррекции рН мазка. Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает возможность более полного и детального описания и морфологической оценки выявляемой популяции возбудителя туберкулеза, находящейся в патологическом материале в различных морфологических вариантах, вследствие приготовления бактериального субстрата с использованием всей пробы патологического материала, что повышает информативность способа.

Источники информации
1. Выделение L-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала: Методические рекомендации/Под ред. И.Р.Дорожковой, З.М.Кочемасовой, М.М. Дыхно. - М.: Б.И., 1984.- 19 с.

2. Дорожкова И.Р., Круду В.Н., Попеску Т.Г. Клиническое значение выделения L- форм микобактерий туберкулеза у лиц с остаточными туберкулезными изменениями в легких// Проблемы туберкулеза.- 1990. - 2. - С.5-8.

3. Кожухарь Г. Н. , Аникин В.Н., Жук Н.А., Навценя И.В., Лимонова Н.Я. Способ обнаружения микобактерий туберкулеза// Новости науки и техники. Сер. Медицина. - Вып. Туберкулез - 1999. - 3. - С. 9 - 11.

4. Алексеева В.И., Аникин В.А., Калия О.Л., Казанкова Н.В. и др. Набор для флуоресцентного выявления микобактерий туберкулеза. Патент RU 2102763 // Новости науки и техники. Сер. Медицина. - Вып. Туберкулез - 1998. - 9. - С. 9-11.

5. Методические указания по применению и методам контроля качества дезинфицирующего средства "Лесептик" ГУП "ЦНИЛХИ" (Россия). МЗ РФ. -Москва, 2000.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и касается способа выявления морфологически измененных форм микобактерий туберкулеза и может быть использовано при диагностике туберкулеза. Сущностью способа является обработка патологического материала дезинфекционным средством "Лесептик" концентрацией 0,1%, взятого в равном объеме с патологическим материалом, в течение 18-24 ч при комнатной температуре и последующее его исследование с помощью люминесцентной микроскопии. Техническим результатом является повышение эффективности выявления измененных при отсутствии бактериальных форм микобактерий туберкулеза, что обеспечивает раннюю диагностику бактериовыделения у больных туберкулезом. 4 табл.

Способ выявления измененных форм микобактерий туберкулеза, включающий обработку патологического материала и его исследование с помощью люминесцентной микроскопии, отличающийся тем, что обработку патологического материала проводят дезинфекционным средством "Лесептик" концентрацией 0,1%, взятого в равном объеме с патологическим материалом, в течение 18-24 ч при комнатной температуре.