СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1998 года по МПК C12P19/34 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для поучения рибонуклеиновой кислоты, применяемой в медицинской и химической промышленности для получения различных препаратов.

Известен способ получения рибонуклеиновой кислоты, включающий экстракцию рибонуклеиновой кислоты из кормовых дрожжей в подогретом растворе хлористого натрия в щелочной среде, отделение биомассы и осаждение рибонуклеиновой кислоты из экстракта минеральной кислотой с последующими промывкой и сушкой осадка [1].

Недостатком известного способа является сравнительно малый выход готового продукта (60% от теоретического) и высокая загрязненность примесями (содержание основного продукта 88%).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является известный способ получения рибонуклеиновой кислоты, который включает экстракцию рибонуклеиновой кислоты из различных дрожжей раствором хлористого натрия в нагретой щелочной среде, осаждение и отделение биомассы, осаждение из экстракта рибонуклеиновой кислоты хлористым кальцием и обработку полученного осадка минеральной кислотой [2].

Недостатком известного способа является недостаточно высокая степень чистоты целевого продукта и, в частности, загрязненность белками, содержащимися в сырье.

Изобретение направлено на уменьшение содержания белка в готовом препарате.

Это достигается тем, что осуществляют последовательно: экстрагирование рибонуклеиновой кислоты из биомассы дрожжей в нагретой щелочной среде; отделение биомассы дрожжей; обработку экстракта рибонуклеиновой кислоты протеолитическим ферментом, вводимом из расчета от 10 е.а. до 100 е.а. на 1 л экстракта; снижение рН раствора до 3,8-4,2; его нагрев до 80-100^oС; осветление раствора; осаждение рибонуклеиновой кислоты хлористым кальцием и обработку полученного осадка минеральной кислотой.

Отличием предлагаемого способа от известного является то, что перед осаждением рибонуклеиновой кислоты из экстракта экстракт обрабатывают протеолитическим ферментом из расчета от 10 е.а. до 100 е.а. на 1 л экстракта, затем уменьшают рН раствора до 3,8-4,2, нагревают его до 80-100^oС и осветляют.

За счет указанной совокупности отличительных и известных признаков удалось снизить содержание белка в получаемой РНК и тем самым повысить чистоту целевого продукта. В частности, обработка экстракта РНК протеолитическими ферментами позволяет разложить белки, содержащиеся в экстракте. Опытным путем установлено, что если вводить ферменты в количестве менее 10 е.а., то процесс ферментолиза идет очень медленно, и для достижения заметного результата необходимо значительное время, что снизит выход целевого продукта, так как одновременно будет идти процесс разложения РНК. Если вводить ферменты в количестве более 100 е.а., то, как показали опыты, процесс идет столь активно, что приводит к расщеплению РНК.

Уменьшение рН раствора позволяет обеспечить осаждение белков. При этом, если рН больше 4,2, то процесс осаждения практически не идет, а снижение рН до величины менее 3,8 приводит к выпадению РНК, и ее нежелательным потерям. Нагрев раствора обеспечивает коагуляцию белков, содержащихся в нем. При этом, если температура раствора менее 80^oС, то процесс коагуляции практически не идет, а верхний предел (100^oС) обусловлен температурой кипения раствора (если не принимать во внимание закон Рауля).

При проведении операции осветления раствор освобождается от осажденных и скоагулировавших белков, что благотворно сказывается на качестве целевого продукта.

В процессе проведения экспериментов проверялось влияние последовательности выполнения составляющих его операций. В частности обработке ферментом подвергали уже осажденную хлористым кальцием РНК с последующими корректировкой pН, нагревом, осветлением, повторным осаждением.

Установлено, что если обработку ферментами осуществлять до осаждения РНК, то ее содержание в готовом продукте составляет до 98,8%, а при обработке после осаждения - только 75,6%. Анализ на присутствие белков и продуктов их частичного гидролиза дает отрицательную реакцию в препарате, полученном при последовательном проведении ферментолиза и высаждении кальциевой соли РНК, и положительную реакцию, свидетельствующую о присутствии белков в препарате, полученном при обработке ферментом после осаждения кальциевой соли РНК.

Нагрев щелочного раствора при осуществлении экстракции РНК из дрожжей необходим для ее ускорения, так как чем выше температура, тем выше эффективность процесса. Экстракция в принципе может идти и при температурах, близких к комнатным, но процесс этот становится очень длительным, а качество целевого продукта ухудшается.

В общем случае способ реализуется следующим образом. Исходное сырье, в качестве которого могут быть использованы любые дрожжи (хлебопекарные, пивные, кормовые, белково-витаминный концентрат и т.п.), заливают водным раствором, содержащим щелочь (NaOH, аммиак, КОН, и т.д.) с pН 7,0-9,5, нагревают до 60-100^oС при перемешивании и выдерживают при достигнутой температуре от 10 до 60 мин для осуществления экстракции. Эмпирическое установлено, что чем выше температура раствора и рН, тем меньше времени необходимо для завершения экстракции.

После этого биомассу отделяют от полученного экстракта любым из известных приемов - фильтрованием, сепарацией, центрифугированием.

Полученный экстракт обрабатывается любым из известных ферментных препаратов, содержащим протеолитические ферменты, например, протосубтилин или панкреатин. Для обеспечения процесса обработки в соответствии с регламентом применения данного ферментного препарата корректируется рН раствора с помощью кислот или щелочей, и раствор нагревается или охлаждается до оптимальной для использования данного препарата температуры. Процесс ферментолиза осуществляется при установленной регламентом температуре и постоянном перемешивании в течение необходимого для его завершения времени. После завершения процесса ферментолиза рН реакционной среды доводят до 3,8-4,2 введением любой из известных минеральных кислот (серная, соляная и т.д.).

Полученный экстракт нагревают при перемешивании до 80-100^oС. При этом происходит коагуляция белковых примесей. Затем раствор осветляют путем удаления выпавших осадков любым из известных приемов - центрифугированием, фильтрованием, сепарированием.

В полученный осветленный раствор РНК вносят хлористый кальций, в результате чего она осаждается в виде нерастворимой кальциевой соли РНК. Полученный осадок отфильтровывают, ресуспендируют и промывают в охлажденной до 0-5^oС воде, а затем доводят рН суспензии до 1-2 любой минеральной кислотой (соляная, серная, фосфорная и т.д.). В результате в осадок выпадает свободная РНК. Ее отделяют от раствора любым из известных методов, промывают водой и каким-либо органическим растворителем (этанол, ацетон, изопропанол) и сушат. Выход продукта составил 73% от теоретического. По описанной выше методике осуществлялись серии опытов для выявления оптимальных параметров технологического процесса и последовательности выполнения операций.

Для удобства результаты некоторых экспериментов приведены в табл. 1 и 2.

Таким образом, из полученных данных следует, что получение максимально чистой РНК обеспечивает заявленная совокупность операций с указанным порядком их выполнения и оптимальными условиями проведения.

Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения РНК. Сущность изобретения: способ включает экстракцию РНК из биомассы дрожжей в нагретой щелочной среде, отделение биомассы от экстракта, обработку экстракта РНК протеолитическим ферментом, вводимом из расчета от 10 е.а. до 100 е.а. на 1 л экстракта, снижение рН раствора до 3,8-4,2, его нагрев до 80-100^oС, осветление раствора, осаждение РНК хлористым кальцием и обработку полученного осадка минеральной кислотой. 2 табл.

Способ получения рибонуклеиновой кислоты, включающий ее экстракцию из биомассы дрожжей в нагретой щелочной среде, отделение биомассы и осаждение рибонуклеиновой кислоты из экстракта хлористым кальцием с последующей обработкой осадка минеральной кислотой, отличающийся тем, что перед осаждением рибонуклеиновой кислоты экстракт обрабатывают протеолитическим ферментом из расчета от 10 е.а. до 100 е.а. на 1 л экстракта, уменьшают его pН до 3,8 - 4,2, затем нагревают до 80 100^oС и осветляют.