СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2007 года по МПК C12P19/34 C12R1/865 

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из дрожжей, и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства противовирусных препаратов.

Известен способ получения дсРНК из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий осаждение суммарных нуклеиновых кислот из клеточного экстракта этанолом, фракционирование и осаждение дсРНК из супернатаната хлористым литием, очистку дсРНК в водном растворе с помощью хлороформа или смеси хлороформа с изоамиловым спиртом и выделение целевого продукта этанолом (см. ж. «Антибиотики. Медицина. Биотехнология». - 1985 янв., 30(1), с.19-21.

Для более полной очистки дсРНК необходимо многократное фракционирование хлоридом лития, что приводит к технологическим потерям и, в конечном итоге, снижению выхода целевого продукта.

Кроме того, предусматриваемый известной технологией значительный расход этанола особенно на стадии осаждения нуклеиновых кислот обуславливает необходимость принятия специальных мер для обеспечения пожаробезопасности производства, что, в конечном счете, ведет к увеличению себестоимости продукта.

Задачей настоящего изобретения является увеличение выхода целевого продукта при одновременном снижении затрат на его производство.

Техническим результатом является получение дсРНК со свойствами высоким молекулярным весом и прочной вторичной структурой, определяющими ее эффективность как индуктора интерферона.

Технический результат достигается за счет того, что в способе получения двуспиральной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, включающем выделение из экстракта клеток двуспиральной РНК фракционированием нуклеиновых кислот хлористым литием, очистку двуспиральной РНК в водном растворе хлороформа или смеси хлороформа с изоамиловым спиртом, выделение целевого продукта этанолом, клетки дрожжей разрушают автолизом в растворе, содержащем культуральную жидкость Arthrobacter luteus ATSS 21606 при температуре 30-40°С в течение 15-20 часов, полученный гомогенат депротеинизируют термообработкой при температуре 75-90°С в течение 5-20 мин, экстракт перед фракционированием нуклеиновых кислот очищают и концентрируют путем его ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения не менее 100000 Да и не более 500000 Да.

Вариант практического осуществления предлагаемого способа иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. 1 кг Биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма ВКПМ Y-448 с продуктивностью 350 мг/кг промывают в 3 л 0.05 М раствора тритона Б. Промытые и отжатые дрожжи суспендируют в 2.3 л буферного раствора, содержащего 0.01 М Na₂SO₃, 0.05 М трилона Б, 0.4 М KCl при рН 7.5. Добавляют дрожжелитический ферментный препарат, содержащийся в культуральной жидкости Arthrobacter luteus, в количестве 4000 ед. активности (150-200 мл), после чего суспензию, постоянно перемешивая, инкубируют при температуре 36°С в течение 17 час.

Гомогенат прогревают в течение 10 мин при температуре 75°С, после чего охлаждают и осветляют центрифугированием.

Полученный экстракт подвергают концентрированию и диафильтрации на ультрафильтрационном разделительном аппарате с полыми волокнами АР-2 с пределом отсечения 100 КДа. Для разбавления концентрата в процессе ультрафильтрации используют буферный раствор СТЭ (0.002 М трилон Б, 0.15 М NaCl, 0.05 М трис) при рН 7.2. Диафильтрацию проводят до тех пор, пока оптическая плотность ультрафильтрата не достигнет значения 3 при длине волны 260 нм.

К осветленному центрифугированием концентрату с оптической плотностью 150-200 при длине волны 260 нм добавляют литий хлористый до конечной концентрации 2 М и выдерживают смесь 15-17 час при температуре 4°С. Отделяют осадок центрифугированием, к супернатанату добавляют литий хлористый до конечной концентрации 4 М и выдерживают смесь 36-48 час при температуре 4°С.

Отделяют осадок центрифугированием, растворяют его в буферном растворе СТЭ до получения оптической плотности 80 при длине волны 260 нм, добавляют один объем хлороформа, интенсивно перемешивают смесь в течение 1-2 мин и отделяют водную фазу центрифугированием.

Из водной фазы двумя объемами этанола в течение 10-12 час при температуре 4°С осаждают дсРНК. Осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом и лиофильно высушивают. Выход дсРНК в пересчете на 100%-ное содержание - 295 мг (84%).

Пример 2. Получение дсРНК проводят по примеру 1, но в качестве исходной биомассы используют Saccharomyces cerevisiae штамма ВКПМ-У-448 с продуктивностью 1000 мг/кг. Выход дсРНК в пересчете на 100%-ное содержание составляет 950 мг (95%).

В заявляемом способе разрушение биомассы происходит в результате «мягкого» ферментативного процесса автолиза, при котором частичное повреждение клеточных стенок ферментами, содержащимися в культуральной жидкости Arthrobacter luteus, приводит к высвобождению внутриклеточного содержимого, и дальнейшее разрушение клеток происходит за счет ее собственных ферментов. Использование автолиза обеспечивает более эффективную деструкцию клеток без привлечения энергоемкого технологического оборудования для механической дезинтеграции биомассы, что, в свою очередь, снижает затраты на производство продукта.

Использование для очистки и концентрирования экстракта метода ультрафильтрации на аппаратах с полыми волокнами позволяет уже на начальных стадиях процесса избавиться от большей части мешающих примесей : белков, полисахаридов, пигментов, низкомолекулярных одноцепочных РНК и практически полностью от ДНК (в виде фрагментов). Как следствие, из технологической цепочки получения дсРНК исключается операция - осаждение этанолом, что приводит к сокращению потерь целевого продукта, уменьшению расхода реактивов, повышению безопасности производства. Выход целевого продукта составляет 600-1000 мг на килограмм биомассы дрожжей.

Кроме этого, щадящее разрушение биомассы дрожжей автолизом позволяет сохранить неповрежденной двухцепочную структуру молекулы дсРНК, максимально сохранить длину цепи и двухцепочную конфигурацию ряда локальных участков в молекулах одноцепочных РНК, а ультрафильтрация позволяет отделить низкомолекулярные одноцепочные РНК, не являющиеся индукторами интерферона. Таким образом, заявляемый способ позволяет получать суммарные рибонуклеиновые кислоты дрожжевой клетки со свойствами - высокой молекулярной массой (не менее 100000 Да) и прочной вторичной структурой, определяющими их эффективность как индукторов интерферона.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности. Двуспиральную рибонуклеиновую кислоту получают из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448. Для этого указанные клетки инкубируют в присутствии Arthrobacter luteus ATSS 21606. Полученный гомогенат депротеинизируют и концентрируют при помощи ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения не менее 100 тыс. Да. Нуклеиновые кислоты фракционируют хлористым литием. Двуспиральную РНК очищают хлороформом или смесью хлороформа с изоамиловым спиртом и осаждают этанолом. Применение изобретения позволяет получить дсРНК с высоким молекулярным весом и прочной вторичной структурой.

Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, включающий выделение из экстракта клеток двуспиральной РНК фракционированием нуклеиновых кислот хлористым литием, очистку двуспиральной РНК в водном растворе хлороформом или смесью хлороформа с изоамиловым спиртом, выделение целевого продукта этанолом, отличающийся тем, что клетки дрожжей разрушают автолизом в растворе, содержащем культуральную жидкость Arthrobacter luteus ATSS 21606 при температуре 30-40°С в течение 15-20 ч, полученный гомогенат депротеинизируют термообработкой при температуре 75-90°С в течение 5-20 мин, экстракт перед фракционированием нуклеиновых кислот очищают и концентрируют путем его ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения не менее 100 тыс. Да.