СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2007 года по МПК C12P19/34 C12R1/865 

Описание патента на изобретение RU2302464C2

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из дрожжей, и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства противовирусных препаратов.

Известен способ получения дсРНК из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий осаждение суммарных нуклеиновых кислот из клеточного экстракта этанолом, фракционирование и осаждение дсРНК из супернатаната хлористым литием, очистку дсРНК в водном растворе с помощью хлороформа или смеси хлороформа с изоамиловым спиртом и выделение целевого продукта этанолом (см. ж. «Антибиотики. Медицина. Биотехнология». - 1985 янв., 30(1), с.19-21.

Для более полной очистки дсРНК необходимо многократное фракционирование хлоридом лития, что приводит к технологическим потерям и, в конечном итоге, снижению выхода целевого продукта.

Кроме того, предусматриваемый известной технологией значительный расход этанола особенно на стадии осаждения нуклеиновых кислот обуславливает необходимость принятия специальных мер для обеспечения пожаробезопасности производства, что, в конечном счете, ведет к увеличению себестоимости продукта.

Задачей настоящего изобретения является увеличение выхода целевого продукта при одновременном снижении затрат на его производство.

Техническим результатом является получение дсРНК со свойствами высоким молекулярным весом и прочной вторичной структурой, определяющими ее эффективность как индуктора интерферона.

Технический результат достигается за счет того, что в способе получения двуспиральной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, включающем выделение из экстракта клеток двуспиральной РНК фракционированием нуклеиновых кислот хлористым литием, очистку двуспиральной РНК в водном растворе хлороформа или смеси хлороформа с изоамиловым спиртом, выделение целевого продукта этанолом, клетки дрожжей разрушают автолизом в растворе, содержащем культуральную жидкость Arthrobacter luteus ATSS 21606 при температуре 30-40°С в течение 15-20 часов, полученный гомогенат депротеинизируют термообработкой при температуре 75-90°С в течение 5-20 мин, экстракт перед фракционированием нуклеиновых кислот очищают и концентрируют путем его ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения не менее 100000 Да и не более 500000 Да.

Вариант практического осуществления предлагаемого способа иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. 1 кг Биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма ВКПМ Y-448 с продуктивностью 350 мг/кг промывают в 3 л 0.05 М раствора тритона Б. Промытые и отжатые дрожжи суспендируют в 2.3 л буферного раствора, содержащего 0.01 М Na2SO3, 0.05 М трилона Б, 0.4 М KCl при рН 7.5. Добавляют дрожжелитический ферментный препарат, содержащийся в культуральной жидкости Arthrobacter luteus, в количестве 4000 ед. активности (150-200 мл), после чего суспензию, постоянно перемешивая, инкубируют при температуре 36°С в течение 17 час.

Гомогенат прогревают в течение 10 мин при температуре 75°С, после чего охлаждают и осветляют центрифугированием.

Полученный экстракт подвергают концентрированию и диафильтрации на ультрафильтрационном разделительном аппарате с полыми волокнами АР-2 с пределом отсечения 100 КДа. Для разбавления концентрата в процессе ультрафильтрации используют буферный раствор СТЭ (0.002 М трилон Б, 0.15 М NaCl, 0.05 М трис) при рН 7.2. Диафильтрацию проводят до тех пор, пока оптическая плотность ультрафильтрата не достигнет значения 3 при длине волны 260 нм.

К осветленному центрифугированием концентрату с оптической плотностью 150-200 при длине волны 260 нм добавляют литий хлористый до конечной концентрации 2 М и выдерживают смесь 15-17 час при температуре 4°С. Отделяют осадок центрифугированием, к супернатанату добавляют литий хлористый до конечной концентрации 4 М и выдерживают смесь 36-48 час при температуре 4°С.

Отделяют осадок центрифугированием, растворяют его в буферном растворе СТЭ до получения оптической плотности 80 при длине волны 260 нм, добавляют один объем хлороформа, интенсивно перемешивают смесь в течение 1-2 мин и отделяют водную фазу центрифугированием.

Из водной фазы двумя объемами этанола в течение 10-12 час при температуре 4°С осаждают дсРНК. Осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом и лиофильно высушивают. Выход дсРНК в пересчете на 100%-ное содержание - 295 мг (84%).

Пример 2. Получение дсРНК проводят по примеру 1, но в качестве исходной биомассы используют Saccharomyces cerevisiae штамма ВКПМ-У-448 с продуктивностью 1000 мг/кг. Выход дсРНК в пересчете на 100%-ное содержание составляет 950 мг (95%).

В заявляемом способе разрушение биомассы происходит в результате «мягкого» ферментативного процесса автолиза, при котором частичное повреждение клеточных стенок ферментами, содержащимися в культуральной жидкости Arthrobacter luteus, приводит к высвобождению внутриклеточного содержимого, и дальнейшее разрушение клеток происходит за счет ее собственных ферментов. Использование автолиза обеспечивает более эффективную деструкцию клеток без привлечения энергоемкого технологического оборудования для механической дезинтеграции биомассы, что, в свою очередь, снижает затраты на производство продукта.

Использование для очистки и концентрирования экстракта метода ультрафильтрации на аппаратах с полыми волокнами позволяет уже на начальных стадиях процесса избавиться от большей части мешающих примесей : белков, полисахаридов, пигментов, низкомолекулярных одноцепочных РНК и практически полностью от ДНК (в виде фрагментов). Как следствие, из технологической цепочки получения дсРНК исключается операция - осаждение этанолом, что приводит к сокращению потерь целевого продукта, уменьшению расхода реактивов, повышению безопасности производства. Выход целевого продукта составляет 600-1000 мг на килограмм биомассы дрожжей.

Кроме этого, щадящее разрушение биомассы дрожжей автолизом позволяет сохранить неповрежденной двухцепочную структуру молекулы дсРНК, максимально сохранить длину цепи и двухцепочную конфигурацию ряда локальных участков в молекулах одноцепочных РНК, а ультрафильтрация позволяет отделить низкомолекулярные одноцепочные РНК, не являющиеся индукторами интерферона. Таким образом, заявляемый способ позволяет получать суммарные рибонуклеиновые кислоты дрожжевой клетки со свойствами - высокой молекулярной массой (не менее 100000 Да) и прочной вторичной структурой, определяющими их эффективность как индукторов интерферона.

Похожие патенты RU2302464C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (дсРНК) ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae 2014
  • Аликин Юрий Серафимович
  • Подгорный Владимир Федорович
  • Лебедев Леонид Рудольфович
  • Азаев Мамедьяр Шакирович
RU2558256C1
Способ получения биологически активных компонентов из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и лечебное средство на их основе 2018
  • Лебедев Леонид Рудольфович
  • Азаев Мамедьяр Шакирович
RU2722731C2
ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА 2004
  • Золин Владимир Викторович
  • Колокольцов Алексей Александрович
  • Таргонский Сергей Николаевич
  • Бажутин Николай Борисович
  • Войтенко Александр Васильевич
RU2306936C2
Способ фракционирования нуклеиновых кислот 1989
  • Дужак Александр Борисович
  • Подгорный Владимир Федорович
  • Штань Алла Васильевна
SU1692986A1
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РЕЦИДИВИРУЮЩЕГО УРОГЕНИТАЛЬНОГО ГЕРПЕСА С СИМПТОМАМИ ХРОНИЧЕСКОЙ УСТАЛОСТИ 2012
  • Таргонский Сергей Николаевич
  • Усова Светлана Владимировна
  • Бажутин Николай Борисович
  • Мухина Ольга Николаевна
  • Шарыпова Марьяна Григорьевна
RU2492861C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ИНГРЕДИЕНТА СО СВОЙСТВАМИ СОРБЕНТА МИКОТОКСИНОВ 2014
  • Куцакова Валентина Еремеевна
  • Шкотова Татьяна Викторовна
  • Марченко Владимир Иванович
  • Ефимова Светлана Васильевна
  • Чичина Татьяна Викторовна
RU2556380C1
БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ 2005
  • Власов Сергей Александрович
  • Крашенинникова Татьяна Константиновна
  • Краснопевцева Наталья Валентиновна
  • Кузнецова Ирина Вячеславна
  • Смоляная Галина Леонидовна
  • Синицын Алексей Николаевич
  • Украинцев Анатолий Дмитриевич
RU2299101C1
ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ 2003
  • Золин В.В.
  • Агафонова О.А.
  • Колокольцов А.А.
  • Таргонский С.Н.
  • Бажутин Н.Б.
RU2255735C2
ШТАММ БАКТЕРИИ Bacillus stratosphericus, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ ЭТАНОЛ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ 2014
  • Брянская Алла Викторовна
  • Старостин Константин Викторович
  • Шеховцов Сергей Викторович
  • Розанов Алексей Сергеевич
  • Горячковская Татьяна Николаевна
  • Пельтек Сергей Евгеньевич
RU2560584C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus stratosphericus, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТАНОЛА ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ 2014
  • Брянская Алла Викторовна
  • Старостин Константин Викторович
  • Розанов Алексей Сергеевич
  • Шеховцов Сергей Викторович
  • Горячковская Татьяна Николаевна
  • Пельтек Сергей Евгеньевич
RU2560585C1

Реферат патента 2007 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности. Двуспиральную рибонуклеиновую кислоту получают из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448. Для этого указанные клетки инкубируют в присутствии Arthrobacter luteus ATSS 21606. Полученный гомогенат депротеинизируют и концентрируют при помощи ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения не менее 100 тыс. Да. Нуклеиновые кислоты фракционируют хлористым литием. Двуспиральную РНК очищают хлороформом или смесью хлороформа с изоамиловым спиртом и осаждают этанолом. Применение изобретения позволяет получить дсРНК с высоким молекулярным весом и прочной вторичной структурой.

Формула изобретения RU 2 302 464 C2

Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, включающий выделение из экстракта клеток двуспиральной РНК фракционированием нуклеиновых кислот хлористым литием, очистку двуспиральной РНК в водном растворе хлороформом или смесью хлороформа с изоамиловым спиртом, выделение целевого продукта этанолом, отличающийся тем, что клетки дрожжей разрушают автолизом в растворе, содержащем культуральную жидкость Arthrobacter luteus ATSS 21606 при температуре 30-40°С в течение 15-20 ч, полученный гомогенат депротеинизируют термообработкой при температуре 75-90°С в течение 5-20 мин, экстракт перед фракционированием нуклеиновых кислот очищают и концентрируют путем его ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения не менее 100 тыс. Да.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2302464C2

ANTIBIOT MED BIOTEKHNOL
Приспособление для установки двигателя в топках с получающими возвратно-поступательное перемещение колосниками 1917
  • Р.К. Каблиц
SU1985A1
US 3716452, 13.02.1973
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВТОЛИЗАТА ДРОЖЖЕЙ 2001
  • Оганесянц Л.А.
  • Кардаш Н.К.
  • Телегин Ю.А.
  • Маргулис М.А.
  • Поролло В.А.
  • Васильченко С.В.
  • Дмитриева А.Ф.
RU2204909C2
ДЖ
ДЭВИДСОН, Биохимия нуклеиновых кислот
- М.: изд
"Мир", М: 1976, стр.83-87
US 4830969, 16.05.1989
RU 92001860 A, 10.07.1996
Способ выделения белков и нуклеиновых кислот из белково-нуклеиновых смесей 1981
  • Мамцис Анатолий Михайлович
  • Николаева Валерия Владимировна
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Галкин Олег Михайлович
  • Вайнерман Ефим Семенович
  • Рогожин Сергей Васильевич
SU960261A1
Способ получения синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью 1979
  • Хирофуми Аримура
  • Масанори Нагаи
  • Такеси Ямаути
  • Цутому Китагава
  • Тадаказу Суяма
SU933001A3
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков 1922
  • Асафов Н.И.
SU6A1

RU 2 302 464 C2

Авторы

Бажутина Наталья Владимировна

Бажутин Николай Борисович

Белова Наталья Васильевна

Гурьева Татьяна Леонидовна

Гурьев Владимир Павлович

Дегтева Светлана Альбертовна

Еникеева Раиса Вильевна

Золин Владимир Викторович

Комарова Татьяна Леонидовна

Колокольцов Алексей Александрович

Моисеенкова Ольга Афанасьевна

Наумова Нина Васильевна

Остапенко Елена Витальевна

Пикалова Марина Ивановна

Самотяжко Земфира Марсовна

Таргонский Сергей Николаевич

Шарафаненко Ольга Викторовна

Шамрина Лариса Викторовна

Даты

2007-07-10Публикация

2003-11-12Подача