Способ получения рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей Советский патент 1992 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам выделения нуклеиновых кислот, в частности РНК, являющейся сырь-ем для производства нуклеотидов и нуклеозидов и применяющейся в медицине.

Цель изобретения - повышение степени чистоты полученного препарата РНК и сокращение продолжительности процесса выделения.

Основу предложенного способа сост вляет совокупность следующих приемов: биомассу дрожжей кипятят 15 мин в растворе, содержащем 0,2 М хлористый натрий и 0,01-0,04 М CaCh. с рН 7,5, доведенным NaOH. После удаления клеток центрифугированием РНК из экстракта осаждают в форме кальциевой соли путем дополнительного

внесения в экстракт CaCl2. Свободную РНК из ее комплекса с кальцием выделяют обработкой кальциевой соли РНК кислотой (напрмер, серной) в течение 5-30 мин.

Отличительными признаками предлагаемого способа являются: 1) осуществление экстракции РНК из клеток в присутствии 0,01-0,04 М CaCla: 2) осаждение РНК из экстракта в форме кальциевой соли с последующим разрушением комплекса обработкой минеральной кислотой.

Предлагаемый способ позволяет сократить время выделения конечного продукта, т.е. РНК в 3 раза (с 14,5 до4-5 ч) и увеличить степень чистоты целевого продукта с 78 до 90-97%. Л р и м е р 1. В реакционный сосуд вносят 400 мл Н20, 25 мл 4 М NaCl, 15 мл 1 М CaCIa и 60мл 0,625 М NaOH. После доведения раствора до кипения к нему прибавляют 100 г,сухого БВК (биомасса Candida maltosa производства Новополоцкого завода БВК), Смесь перемешивают в течение 15 мин, после чего биомассу дрожжей осаждают центрифугированием (5000 д. 10 мин) и промывают 200 мл раствора, содержащего 0,2 М NaCl и 30 мМ CaCl2. Супернатанты, полученные после обоих центрифугирований, объединяют и в суммарный раствор (500 мл) вносят 40 мл 2М СаСг2 (конечная концентрация 0,16 М) и образевавшийся осадок кальциевой соли РНК отделяют центрихфугированием (5000 д, 10 мин). Осадок суспендируют в 75 мл Н20, прибавляют к суспензии 0,35 мл 1М H2S04 и суспензию перемешивают в течение 15 мии. Осадок РНК отделяют центрифугированием (5000 д, 10 мин), промывают 100 мл i laO и высушивают при 60°С в термостате. Выход препарата РНК составляет 5,57 г, он содержит 97% основного вещества, что соответствует выходу 72% от теоретически возможного, В-оличины отношений Е2бо:Е2зо и Е5ео;Е2ео раствора целевого продукта составляют 2,2 и 0,47 соответственно. Содержание фосфата.9,24%. Пример 2. Условия выделения совпадают с описанными в примере 1, за исключением того, что вместо дрожжей Caodde maitosa используют дрожжи Saccharomyces ceravisiae. Candida scottii и Candida sainionlcoSa. Степень чистоты целевого продукта 96,1; 95,2 и 95,8 соответственно, а выход целевого продукта (% от теоретически возможного) 71,8; 72,3 и 72,7 в порядке перечисления объектов. П р и М е р 3. Условия примера совпадают с описанными в примере 1 за исюиочением того, что используются различные концентрации CaCIa (0-70 мМ) в среде для экстракции РНК и различные концентрации CaCl2 (40-1000 мМ), вносимого в экстракт для осаждения РНК. Требованию получения целевого продукта не только с высокой степенью чистоты (flfl 97%), но и с высоким выходом (60-73,9%) удовлетворяют сочетания анализируемых параметров, предусматривающих концентрации CaCl2 в среде экстракции 10-40 мМ и концентрации CaCIa вносимого в экстракт для осаждения РНК 100- 1000 мМ. Таким образом предложенный способ позволяет получить до 73,9% от теоретически возможного количества РНК из эукариотических клеток (дрожжи), причем достигается высокий уровень чистоты ко-, нечного продукта до 97,1 %. Затраты же времени на всю процедуру составляют всего 4-5 ч. Предлагаемый метод технологичен и может быть успешно использован в условиях производства без дополнительных научных исследований. Применение предлагаемого изобретения внесет существенный вклад в обеспечение потребности медицины, сельского хозяйства и научных исследований как в самой РНК, так и получаемых из нее нуклеозидах рибо ряда. Фор м.у л а изобретения Способ получения рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей, предусматривающий экстрагирование биомассы раствором хлористого натрия при слабощелочных рН и повышенной температуре и осаждение РНК из экстракта, отличаю а1ийся тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта и сокращения продолжительности процесса, в раствор для экстракции РНК вносят в концентрации 0,01 0,04 М и РНК осаждают в виде кальциевой соли путем внесения в экстракт CaCl2 в концентрации O.I-I.O М с последующим переводом соли РНК в свободную кислоту обработкой минеральной кислотой.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам выделения нуклеиновых киСлот, в частности РНК, которая применяется в медицине, сельском хозяйстве и является исходным сырьем для получения нук- пеотидов и нулеозидов. Цель изобретения - повышение степени чистоты получаемого препарата РНК и сокращение продолжительности процесса выделения.. Способ заключается в экстракции РНК из биомассы кормовых дрожжей в присутствии 0,2 М NaC! и 0,01-Ч),04 М CaCl2, рН 7,5, при кипячении в течение 15 мин, удалении клеточного дебриса, осаждении РНК из экстракта в виде соли Са путем дополнительного внесения в экстракт CaCh до 0,1-1,0 М. Регенерацию РНК из ее соли осуществляют согласно стандартной процедуре вытеснения ионов кальция из комплекса с РНК минеральной кислотой. Способ позволяет получить целевой продукт 97%-ной чистоты с выходом до 73% от теоретически возможного при сокращении времени выделения до 4-5 ч.