СПОСОБЫ УСКОРЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА С, ОСНОВАННЫЕ НА ОБНАРУЖЕНИИ ГЕМАГГЛЮТИНИНОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С И АНТИТЕЛ К НИМ В РГА И РТГА В КРОВИ ЛЮДЕЙ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/569 G01N33/576 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к методу диагностики гепатита С, основанному на прямом выявлении вирусспецифических антигенов и антител к природным белкам ВГС и приспособленным для массовых ускоренных анализов проб крови больных гепатитом С с возможной автоматизацией процесса.

Существующий в настоящее время метод специфической диагностики гепатита С основан на двух тестах: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления последовательностей РНК-генома ВГС в сыворотке крови ВГС- инфицированных больных и иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител к рекомбинантным структурным и неструктурным белкам ВГС. В редких случаях для диагностики гепатита С используют биопсию печени.

В то же время известно, что оба этих метода имеют существенные недостатки: 1) метод ПЦР, как правило, дает отрицательные результаты в первые 6 месяцев после инфекции ВГС. Кроме того, ПЦР - дорогостоящий метод, требующий высокой квалификации специалистов, дорогостоящего оборудования, праймеров и реактивов, и поэтому имеет существенные ограничения в использовании его для массового скрининга образцов крови; 2) ИФА позволяет определять специфические антитела к ВГС в крови инфицированных больных. В качестве антигенов в этой реакция используют рекомбинантный нуклеокапсидный белок ВГС и один или несколько рекомбинантных неструктурных белков ВГС. Отсутствие полного набора ВГС-специфических природных белков в этой реакции, в частности поверхностных белков вирионов ВГС - Е2 и Е1, в значительной степени снижает ее чувствительность и часто приводит к отрицательным результатам при исследовании сывороток крови от ВГС-инфицированных больных.

Кроме того, до настоящего времени не разработаны способы прямого определения антигенов, агглютинирующих эритроциты и антигемагглютининов к ВГС в сыворотках крови инфицированных людей, что является необходимым для оценки динамики развития и тяжести инфекции ВГС у инфицированных людей, для оценки специфической и неспецифической противовирусной активности лечебно-профилактических препаратов
До сих пор нет коммерческих тест-систем для обнаружения ВГС-специфических антигенов в сыворотках крови людей и антител к природным, в том числе поверхностным белкам ВГС.

Из литературных данных известны попытки определить ВГС-специфические антигены в крови больных. Антигены ВГС в этих случаях определяют после концентрации больших объемов сыворотки крови с помощью моноклональных антител к рекомбинантному нуклеокапсиду ВГС (Кущ А.А. и др. 1997). Ясно, что этот метод не может получить широкого внедрения в практическое здравоохранение. Известны также данные определения антигенов ВГС методом иммунофлюоресценции и ИФА при биопсии печени больных гепатитом С. Однако и этот метод имеет серьезные ограничения использования его для массового скрининга сывороток крови людей.

Ограниченность существующих методов диагностики гепатита С, прежде всего, связана с отсутствием до настоящего времени экспериментальных моделей in vitro и in vivo, которые позволили бы выделять высокопродуктивные антигенно-активные штаммы вируса гепатита С, пригодные для конструирования экономически выгодных диагностических систем.

Возможность создания экспериментальных моделей инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток различного происхождения и в организме инфицированных животных, реализованная нами ранее, позволила выделить из сыворотки крови людей, инфицированных вирусом гепатита С, высокопродуктивные антигенно-активные варианты вируса гепатита С, изучить их основные свойства и разработать до сих пор неизвестные для ВГС методы диагностики вызываемой им инфекции (П. Г. Дерябин и др., 1997, 1998). Штамм вируса гепатита С (Д-1), выделенный нами из культур клеток, пригодный для приготовления диагностических и профилактических препаратов (патент РФ на изобретение 2130967, приоритет от 07. 10.97 г.).

Предложенный способ определения антигенов ВГС основан на способности выявления в крови людей, инфицированных ВГС, антигенов ВГС, обладающих гемагглютинирующей способностью. Гемагглютинины ВГС были обнаружены нами при культивировании ВГС-содержащего материала в культурах клеток различного происхождения, а также в органах и тканях ВГС-инфицированных животных. Как известно, для других представителей семейства Flaviviridae гемагглютинирующая (ГА) активность флавивирусов связана с эпитопами на поверхности белка Е. Результаты исследований показали, что ВГС и все известные генотипы этого вируса, культивируемые в культурах клеток или на уровне организма, как и другие представители семейства Flaviviridae, способны агглютинировать эритроциты при различных значений рН фосфатного буфера. При этом ГА-активность ВГС специфически тормозится в присутствии антител (антигемагглютининов) к ВГС. Это свойство, характерное для многих представителей вирусов семейства Flaviviridae, на протяжении многих лет используется для диагностики флавивирусных инфекций в реакциях РГА и в РТГА, предложенными Clarke и Casals в 1958 г. В отношении вируса гепатита С эти методы определения антигенов и их специфической активности до сих пор не применялись.

В табл.1 представлены данные, демонстрирующие ГА- активность высокопродуктивных вариантов ВГС, выделенных из сыворотки крови больных гепатитом С методом заражения культур клеток различного происхождения.

Как видно из данных табл.1, ГА-активность изолированных вариантов ВГС проявляется при культивировании в культурах клеток различного происхождения. Данные показывают, что репликация ВГС в культурах клеток на всем протяжении сопровождается продукцией антигенов-гемагглютининов ВГС, которые регистрируются до появления цитодеструктивных свойств ВГС. Причем титры гемагглютининов ВГС для культур клеток варьируют и достигают максимальных значений к 72-96 ч после инфекции (1:64 - 1:128). А при коцентрации вируссодержащей культуральной жидкости, собранной из инфицированных культур клеток через 72 или 96 ч после инфекции, после центрифугирования ее при 30000 об/мин в течение 1 ч титры ГА-активность ВГС достигают 1:1024 - 1:2048. Показано, что ГА-активностью обладают все известные генотипы (субтипы) ВГС. Получены данные о ГА-активности антигенов, содержащихся в сыворотках крови, а также в различных органах и тканях мышей, кроликов, инфицированных цитопатогенными вариантами ВГС.

Полученные данные позволили предположить наличие антигенной активности ВГС в сыворотках крови инфицированных ВГС людей, обнаруживаемой по способности ВГС к гемагглютинации в классической реакции гемагглютинации (РГА).

Таким образом, в способе обнаружения антигенов ВГС была применена РГА, ранее известная для определения антигенов классических представителей альфа- и флавивирусов (вирусов восточного и венесуэльского энцефаломиелита лошадей, японского и клещевого энцефалитов, лихорадки Западного Нила, денге и др.) и до сих пор не использующаяся для обнаружения антигенов ВГС. Адаптация РГА для определения антигенов ВГС в сыворотках крови людей позволила обнаруживать ВГС-специфический антиген на всем протяжении инфекции, вызванной ВГС, в том числе и в случаях, когда данные высокочувствительного метода ПЦР были отрицательными, включая ранние сроки после инфекции. Определение антигенов ВГС в сыворотках крови людей оказалось наиболее чувствительным методом диагностики гепатита С у людей, использование которого позволяет в короткие сроки устанавливать диагноз инфекции. Простота постановки реакции позволяет использование ее для массового скриннинга проб крови людей на наличие инфекции, вызванной ВГС, для оценки эффективности лечения или профилактики гепатита С различными препаратами, для определения инфекции ВГС при отрицательных данных ПЦР. Показана возможность определения антигенов ВГС как в цельной крови, так и в сыворотках крови, во фракциях эритроцитов и лейкоцитов крови человека.

Сущность изобретения: основана на выявлени гемагглютинирующей способности антигенов вируса гепатита С. Пробы крови людей, подозрительных на инфекцию вирусом гепатита С, используют в качестве исследуемого антигенсодержащего материала в классической реакции гемагглютинации (РГА) в оптимальной зоне рН фосфатного буфера. Метод определения антигенов ВГС в крови людей позволяет количественно оценивать концентрацию (титры) антигенов (гемагглютининов) ВГС.

Специфичность гемагглютинирующей активности (ГА-активности) ВГС подтверждают в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в классической постановке (Clarke и Casals, 1958 г.). Способ обнаружения антител к вирусу гепатита С основан на возможности использования в РТГА в качестве специфических антигенов природных структурных белков вирионов вируса гепатита С, выделенного из культур клеток или органов животных, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС. Использование антигенно-активных природных белков и вирионов ВГС позволяет идентифицировать гемагглютинины в крови ВГС-инфицированных людей как антигены ВГС.

В реакции используют кровь или эритроцитарную или лейкоцитарную фракции крови, или сыворотку из крови человека, взятую в количестве до 100 - 200 мкл (0,1-0,2 мл). Затем сыворотку разводят до 1:10 боратным буферным раствором, содержащим 0,4% бычьего альбумина (рН 9,0). Используя тот же состав боратно-буферного раствора, делают 2-кратные разведения сыворотки, начиная с 1:10, 1: 20, 1:40 и т.д., в 96-луночных панелях с u-образным дном. Эритроциты гуся получают из подкрыльцовой вены гусей-самцов или голубей, используя антикоагулирующий раствор Альзовера. В реакции используют 0,4% взвесь эритроцитов на фосфатном буферном растворе (зона рН 6-7), который готовят перед опытом, смешивая фосфатно-буферные растворы рН 6 и 7.

По 20 мкл взвеси эритроцитов гуся вносят в каждую из лунок с разведениями сыворотки крови человека. В качестве контролей в РГА служат: а) 0,4% взвесь эритроцитов, внесенная в лунки с боратным буферным раствором без крови ВГС-инфицированных людей или с кровью заведомо здоровых доноров. Через 1 ч учитывают результаты. Образование плотного осадка эритроцитов на дне лунки свидетельствует об отрицательных результатах. Формирование "зонда" из агглютинированных эритроцитов на всей поверхности эритроцитов свидетельствует о положительной реакции. В контрольных опытах наблюдают формирование плотного осадка эритроцитов.

Учет результатов основан на подсчете титров антигена ВГС. Результаты считаются положительными, если титр антигенов ВГС в РГА превышает 1:20 - 1: 40.

Данный способ определения антигенов ВГС позволяет использовать минимальные объемы сыворотки крови ВГС инфицированных людей, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а также высокой квалификации персонала.

Сущность предложенного способа определения антигемагглютининов заключается в получении культуральных, в том числе концентрированных и очищенных антигенов ВГС или антигенно-активного вируса, антигенов ВГС, полученных методом щелочной или сахарозоацетоновой экстракции - классические способы получения антигенов для большинства вирусных инфекций, описанные в литературе. Антигены ВГС, полученные таким образом, должны обладать высокой гемагглютинирующей активностью, что дает возможность их использования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для определения антигемагглютининов в сыворотках крови ВГС инфицированных людей. РТГА используется в классической постановке, описанной Clarke и Casals (1958 г.).

В табл.2 представлены данные, полученные в РТГА, о циркуляции в сыворотке крови ВГС инфицированных людей антигемагглютининов ВГС. В частности, показано, что антитела, тормозящие гемагглютинацию ВГС, циркулируют у людей в разные сроки после инфекции ВГС. В то же время антигемагглютинины в более высоких титрах обнаруживают в начале инфекции, когда данные ПЦР не позволяют обнаруживать РНК ВГС.

Полученные данные позволяют проследить динамику инфекционного процесса, а наличие антигемагглютининов в сыворотке крови людей позволяет обнаруживать инфекцию ВГС в ранние сроки или оценить действие лечебных препаратов на течение инфекции.

Пример 1. Способ определения антигенов - гемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Табл.3, в РГА, поставленной микрометодом с использованием эритроцитов гуся в фосфатном буферном растворе были обследованы 145 образцов сыворотки крови людей, инфицированных ВГС, 182 образца сывороток от людей, не содержащих РНК ВГС и антител к ВГС. Из данных табл.3 видно, что все сыворотки от инфицированных ВГС содержали антигены ВГС, причем максимальные значения титров ГА активности наблюдаются у больных, сыворотки которых содержали как антитела, так и РНК ВГС. Значительно более низкие титры гемагглютининов (1:128 - средние данные) обнаруживали у людей, в сыворотке крови которых не выявлена РНК ВГС. Однако обнаруженная концентрация антигенов ВГС у таких больных (а это больные в ранние сроки после инфекции) дает возможность устанавливать диагноз инфекции в случаях, когда данные ПЦР являются отрицательными. Определение ГА-активности в образцах сывороток крови контрольных групп людей (182 образца) показало, что в среднем эти данные не превышают титров 1:18, что, как известно, скорее всего связано с неспецифическим проявлением ГА-активности у людей: доноров, больных гриппом, гепатитом В, пневмонией и краснухой.

Таким образом, РГА дает возможность быстрого выявления антигенов ВГС, агглютинирующих эритроциты гуся в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей, положительных и отрицательных на РНК ВГС по данным ПЦР.

Пример 2. Способ определения антигемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Возможность определения антител, тормозящих ГА-активность ВГС, появилась благодаря выделению из ВГС-инфицированных культур клеток антигенно-неактивных вариантов ВГС, которые и были успешно использованы в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В табл.4 представлены данные, демонстрирующие возможность РТГА для определения антител к ВГС в сыворотках крови инфицированных гепатитом С. Показано, что:
- Антигемагглютинины ВГС циркулируют в сыворотках крови людей на разных стадиях инфекции ВГС.

- Максимальных значений антигемагглютинины достигают в сыворотках крови людей, содержащих антитела к ВГС (по данным ИФА), но отрицательных в ПЦР реакции (РНК ВГС отрицательные сыворотки). Вероятно, этим и объясняется низкий титр гемагглютининов ВГС, выявляемый в этих же сыворотках: ГА -активность в этом случае в значительной степени подавлена антителами к ВГС.

- Использование в РТГА в качестве антигенов ВГС сывороток крови ВГС-инфицированных людей, ВГС- инфицированных кроликов, а также культуральных антигенов ВГС позволяет выявлять антигемагглютинины во всех случаях, однако максимальные титры антител обнаруживаются при использовании культуральных антигенов (культуральная жидкость, собранная из инфицированных ВГС культур клеток, выращиваемых роллерным способом).

- Атигемагглютинины ВГС не были выявлены в образцах сывороток контрольных групп людей: доноров, больных гепатитом В, краснухой, гриппом, пневмонией, что ярко демонстрирует специфичность как антигемагглютининов ВГС, так и ГА-активности ВГС в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей.

- ВГС-специфические рекомбинантные белки (нуклеокапсидный и неструктурные белки), входящие в состав коммерческих тест-систем, производимых фирмой "Органон" (США), не способны выявлять в РТГА антитела в сыворотках крови ВГС- инфицированных, что свидетельствуют о том, что ГА-активность ВГС связана с белками оболочки вириона, скорее всего с белком Е2, не входящим в состав данной тест-системы.

Источники информации
1. Clarke D.H. and Casals J. Techniques for haemagglutination and haemagglutination inhibition with arthropod borne viruses. Am. J.Trop. Med. Hyg. 7:562(1958).

2. Дерябин П.Г., Львов Д.К., Исаева Е.И., Вязов С.О. Штамм, virus hepatitis С, Д-1, для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Патент на изобретение 2130967, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 1999 г., Москва. Приоритет по заявке 97116620 от 07.10.1997 г.

3. П. Г. Дерябин, С.О. Вязов, Е.И. Исаева и др. Персистенция вируса гепатита С в культурах клеток головного мозга мышей-сосунков. Вопр. вирусол., 1997, Т.6., стр.254-258.

4. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Вязов С.О. и др. Хроническая инфекция культур клеток почки эмбриона свиньи, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусол.,1997, т.6., стр.259-263.

5. П.Г. Дерябин, Е.И. Исаева, С.О. Вязов, Д.К. Львов. Летальная инфекция новорожденных мышей, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусолог., 1997, т.6., стр.251-253.

6. П.Г. Дерябин, Д.К. Львов. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация. Доклады Академии наук РФ, 1998, т.358, N5, стр.688-691.

7. А. А. Кущ, О. В. Масалова, С.Н. Атанадзе. и др. Материалы 2-й Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты B, C, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики, Москва 14-16 октября 1997 г.

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской вирусологии, и касается способов ускоренной диагностики гепатита С. Сущность изобретения включает выявление антигенов вируса гепатита С(ВГС) в крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, основанное на способности антигенов ВГС агглютинировать эритроциты гусей или голубей в реакции гемагглютинации. Результаты считаются положительными, если титры антигенов ВГС в РГА превышают 1:20 - 1:40. Второй вариант включает выявление в крови этих людей индуцируемых гемагглютининами ВГС антител, которые определяют в реакции торможения гемагглютинации. Преимущество изобретения заключается в ускорении и упрощении способа диагностики. 2 с. и 3 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Способ ускоренной диагностики гепатита С, предусматривающий использование (исследование) крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, отличающийся тем, что обнаружение (выявление) антигенов вируса гепатита С (ВГС) основано на способности антигенов ВГС агглютинировать эритроциты гусей или голубей в реакции гемагглютинации (РГА), при этом результаты считаются положительными, если титры антигенов ВГС в РГА превышают 1: 20-1: 40. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию гемагглютинации ставят при рН 6,1-6,5. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве буферной смеси в РГА используют боратный буфер рН 9,0, содержащий 0,4% бычьего альбумина и смесь фосфатных буферов рН 6 и рН 7. 4. Способ ускоренной диагностики гепатита С, предусматривающий использование (исследование) крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, отличающийся тем, что выявляют индуцируемые гемагглютининами ВГС антитела в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве гемагглютининов для РТГА используют антигены цитопатогенных вариантов ВГС, выделенных из инфицированных культур клеток и/или из органов зараженных ВГС животных.