МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ НУКЛЕОКАПСИДА (КОР) ВИРУСА ГЕПАТИТА С-4G5, СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВГС-ИНФЕКЦИИ И КОМБИНАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК C12P21/08 C07K16/08 G01N33/569 

Описание патента на изобретение RU2329303C2

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается диагностики гепатита С с помощью сэндвич-варианта иммуноферментного количественного анализа на основе специфически реагирующей с кор-белком вируса гепатита С (ВГС) комбинации моноклональных антител, включающей моноклональные антитела 4G5, продуцируемые штаммами гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus.

Специфическая диагностика вирусного гепатита С является актуальной проблемой медицины. Преимущественным методом первичной рутинной диагностики вирусного гепатита С в настоящее время является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на детекции антител к вирусным белкам. Однако одного этого теста недостаточно, поскольку специфические антитела не выявляются на ранних стадиях после инфицирования вирусом в так называемую фазу серонегативного «окна», имеющую продолжительность до нескольких месяцев, а также при иммунодефицитных состояниях. Прецизионная детекция вируса гепатита С и мониторинг подтвержденного гепатита С требуют определения прямых маркеров ВГС: РНК и вирусспецифических белков. Для количественного выявления РНК ВГС в плазме крови, и том числе и для количественной оценки, в настоящее время используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который обладает высокой чувствительностью, однако его широкое применение в практическом здравоохранении ограничено. В последние годы активно разрабатываются иммуноферментные методы выявления белка нуклеокапсида (кор-белка) ВГС в сыворотках крови, способные служить определенной альтернативой ПЦР. За рубежом предложено несколько коммерческих тест-систем для детекции кор-белка ВГС в сыворотках крови, однако в нашей стране они дороги и малодоступны. Отечественные тест-системы для выявления кор-белка ВГС отсутствуют.

Известен способ диагностики ВГС-инфекции - сэндвич-вариант иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител (МКА) к кор-белку для выявления кор-белка ВГС, циркулирующего в сыворотке и плазме крови ВГС-инфицированных доноров и больных гепатитом С (Seme К., Poljak M., Babic D.Z. et al. The role of core antigen detection in management of hepatitis C: a critical review // J. of Clin. Virol. - 2005. - V.32. - P.92-101). В тест-системе HCV Core antigen ELISA Test System (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ) моноклональные антитела 5F11 и 5Е3 использовали в сэндвич-варианте ИФА для захвата и детекции кор-белка соответственно. Невозможность выявлять core-белок в присутствии анти-ВГС антител являлась одним из существенных недостатков тест-систем первого поколения, что привело к появлению диагностикумов второго поколения. Тест-система Total HCV Core antigen ELISA Test System или trak-C (Ortho Clinical Diagnostics) основана на использовании четырех МКА: двух - для захвата и двух - для детекции кор-антигена (МКА С11-3, С11-7 и С11-10, С11-14 соответственно). Эти моноклональные антитела и сконструированные на их основе тест-системы могут быть выбраны в качестве наиболее близкого аналога к представленному изобретению.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в создании моноклональных антител, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С - 4G5, и разработке способа диагностики на основе сэндвич-варианта иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида (кор-белка) вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, направленных к линейным и к конформационно-зависимым эпитопам кор-белка. При этом комбинация моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С, используется как для захвата (захватывающие антитела), так и для детекции (детектирующие антитела) кор-белка.

К существенным признакам изобретения, совпадающими с признаками прототипа, относятся следующие.

1. Моноклональные антитела, входящие в состав сэндвича, получены методом гибридомной технологии при иммунизации мышей BALB/c рекомбинантными белками нуклеокапсида ВГС и специфически взаимодействуют с белком нуклеокапсида ВГС. В определенной комбинации они в составе сэндвич-варианта иммуноферментного анализа выявляют белок нуклеокапсида в сыворотках ВГС-позитивных лиц.

2. «Захватывающие» (capture) моноклональные антитела сорбируются (наносятся) в лунки 96-луночных планшетов из полистирола или других полимерных материалов, обладающих высокой сорбционной способностью.

3. Контактирование адсорбированных на твердой фазе МКА с образцами сыворотки или плазмы крови, в результате чего при положительном взаимодействии формируется комплекс антиген-антитело.

4. Выявление комплекса моноклональных антител с кор-антигеном известными иммунологическими методами, например иммуноферментным, радиоизотопным, хемилюминесцентным и т.п. Это осуществляется посредством нанесения детектирующих моноклональных антител к кор-белку, меченных ферментом, радиоизотопом и т.п.

5. Выявление кор-белка является количественным методом. Концентрацию кор-белка в образцах сывороток оценивают по калибровочной кривой с рекомбинантным кор-белком.

К существенным признакам изобретения, отличающихся от признаков прототипа, можно отнести следующие.

1. Использование комбинации МКА 27, 1F9 и 4G5, направленных к другим эпитопам кор-белка ВГС: МКА 1F9 - к линейному эпитопу с аминокислотными остатками (а.о.) 81-85, МКА 27 и 4G5 - к конформационно-зависимым эпитопам на участке 1-150 а.о. кор-белка (Е.А.Речкина, Г.Ф.Денисова, О.В.Масалова, Л.Ф.Лидеман, Д.А.Денисов, Е.И.Леонова, Р.И.Атауллаханов, С.В.Гурьянова, А.А.Кущ. Картирование антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея // Молекулярная биология, 2006, т.40, №2, с.357-368), в то время как МКА в составе тест-систем прототипов направлены к линейным эпитопам кор-белка: а.о. 41-60 (МКА 5F11), 21-40 (МКА 5Е3), 100-120 (МКА С11-3), 120-130 (МКА С11-7), 21-40 (МКА С11-10) и 41-50 (МКА С11-14) (Orito Е., Mizokavi M., Tanaka Т. et al. Quantification of serum hepatitis C virus core protein level in patients chronically infected with different hepatitis С genotypes. // Gut. - 1996. - V.39. - P.876-880; Aoyagi К., Ohue С., Iida К. et al. Development of a simple and highly sensitive enzyme immunoassay for hepatitis С virus core antigen. // J Clin Microbiol - 1999. - V.37. - P.1802-1808).

2. Данная комбинация МКА используется как в качестве «захватывающих» антител, так и детектирующих в виде меченных ферментом конъюгатов, в то время как в составе вышеуказанных тест-систем «захватывающие» и детектирующие МКА направлены к разным эпитопам кор-белка.

Штамм 4G5, продуцирующий моноклональные антитела, реагирующие с кор-белком ВГС, получен гибридизацией культивируемых клеток миеломы мыши sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных рекомбинантным кор-белком ВГС с последовательностью 1-150 а.о., соответствующим генотипу (субтипу) 1b. Гибридные клетки культивируют на селективной среде ГАТ, выявляют клоны, продуцирующие моноклональные антитела к кор-белку ВГС. Путем серийных пассажей клетки наиболее продуктивного клона 4G5 выводят в массовую культуру. Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus 4G5 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 8/1/1 и характеризуется следующими признаками:

1. Морфологические свойства: культура клеток 4G5 состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрами.

2. Культуральные свойства: в качестве ростовой среды для культивирования использовали среду RPMI-1640, содержащую 15-20% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ед/мл инсулина, 50 мкг/мл гентамицина. Характер роста - стационарная суспензия, метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - 2-3 суток. Посевная доза 200 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева - 1:2-1:3. Введение клеток штамма в концентрации 107/мл в брюшную полость мышей, предварительно сенсибилизированных за 10-14 суток инъекцией 0,3-0,5 мл пристана, вызывает у них через 10-16 суток образование асцитных опухолей.

3. Криоконсервирование гибридомы. За 24 часа до замораживания гибридому пересевают 1:2. Осажденные центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин) клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ЭТС, 10% ДМСО) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн/мл по 1-1,8 мл. Хранят 24 часа при -70С°, затем переносят в жидкий азот.

4. Характеристика иммуноглобулинов. Продуцируемые гибридомой МКА относятся к классу IgG, субкласс - IgG1.

В качестве образцов антител используют культуральную жидкость, образующуюся при культивировании гибридомы, или асцитную жидкость.

Пример 1. Активность и специфичность моноклональных антител определяли в твердофазном варианте иммуноферментного анализа. На твердую фазу сорбировали рекомбинантный кор-белок 1-150 а.о. в концентрации 1 мкг/мл, а также синтетические пептиды различной протяженности (от 12 до 40 а.о.), перекрывающие последовательность кор-белка, в концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5, в течение ночи при комнатной температуре. Затем отмывали лунки планшетов (PBS+0,1% твин-20) и наслаивали культуральные жидкости или асцитные жидкости клона 4G5 в серийных 5-кратных разведениях в блокировочном растворе (1% казеин в PBS-твин-20) и инкубировали 1 час при 37°С. После отмывки наносили козьи антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой (DAKO, Дания). Выявление ферментативной активности связавшейся пероксидазы проводили с использованием субстрата тетраметилбензидина (ТМБ). Измеряли оптическую плотность (ОП) образцов в двухволновом режиме - при длине волны 450 нм (измерение) и 620 нм (референс). За титр МКА принимали последнее разведение, ОП которого превышала ОП отрицательного контроля (МКА к неструктурным белкам ВГС) в 2,5 раза.

С рекомбинантным белком 1-150 а.о. культуральная жидкость клона 4G5 взаимодействует с титром 1:256-1:512, асцитная жидкость - с титром 1:107. Реакции с пептидами не зафиксировано. Это свидетельствует о конформационно-зависимой природе эпитопа, опознаваемого МКА 4G5: аминокислотные остатки, образующие эпитоп, сближены в пространстве, но разнесены в составе первичной структуры белка. Данные эпитопного картирования МКА 4G5, проведенное с помощью технологии фагового дисплея, подтвердили это заключение. Определен ключевой мотив аминокислотных остатков, который входит в состав эпитопа 4G5: QSPSRLxD и KQxKExxxE а.о. (Е.А.Речкина, Г.Ф.Денисова, О.В.Масалова, Л.Ф.Лидеман, Д.А.Денисов, Е.И.Леонова, Р.И.Атауллаханов, С.В.Гурьянова, А.А.Кущ. Картирование антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея // Молекулярная биология, 2006, т.40, №2, с.357-368).

В изобретении разработан способ диагностики гепатита С с помощью сэндвич-варианта ИФА с использованием комбинации моноклональных антител, направленных к разным эпитопам кор-белка ВГС.

Разработке данного способа диагностики гепатита С предшествовало изучение иммунохимических свойств 7 оригинальных МКА и их эпитопное картирование. Моноклональные антитела получали из асцитных жидкостей мышей и очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Protein A - Sepharose CL-4B (Pharmacia, Швеция) по методу, рекомендованному фирмой. Конъюгацию МКА с пероксидазой хрена выполняли перийодатным методом. Определяли концентрацию белка в очищенных иммуноглобулинах (Ig) из МКА, изотипы Ig, измеряли их специфическую активность в непрямом варианте твердофазного ИФА при сорбции на твердую фазу рекомбинантных кор-белков. Исследование эпитопной специфичности МКА проводили с помощью пептидного скринирования, реципрокного конкурентного анализа и при помощи технологии фагового дисплея (Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Атанадзе С.Н., Лакина Е.И., Семилетов Ю.А., Бурков А.Н., Уланова Т.И., Новиков В.В., Пименов В.К., Филдс Г., Худяков Ю.Е., Кущ А.А. Характеристика панели моноклональных антител и эпитопное картирование белков вируса гепатита С // Доклады Академии Наук, 2002, Т.383, №4, с.545-550; Е.А.Речкина, Г.Ф.Денисова, О.В.Масалова, Л.Ф.Лидеман, Д.А.Денисов, Е.И.Леонова, Р.И.Атауллаханов, С.В.Гурьянова, А.А.Кущ. Картирование антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея // Молекулярная биология, 2006, т.40, №2, с.357-368).

Пример 2. Экспериментальная проверка способности 7 оригинальных МКА к кор-белку в различных сочетаниях выявлять кор-белок в образцах плазм крови ВГС-позитивных доноров крови.

Антигенную активность кор-белка определяли с помощью сэндвич-варианта ИФА в образцах плазм доноров крови, среди которых 17 образцов содержали антитела к ВГС и РНК ВГС, 20 образцов не содержали этих маркеров (отрицательный контроль). РНК ВГС определяли методом полимеразной цепной реакции (ПНР), наличие и спектр антител к белкам ВГС выявляли с использованием скринирующих и подтверждающих тест-наборов фирмы "Диагностические системы" (г.Нижний Новгород).

Подготовка проб для анализа кор-белка. К образцам плазмы добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ) 4000 ("Serva", Германия) до конечной концентрации ПЭГ 4%. Осадок формировался в течение ночи или не менее 3 ч при 4°С, затем смесь центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (PBS) таким образом, чтобы конечный объем составил 1/15 часть исходного объема образца плазмы. Затем к образцам добавляли твин-80 до конечной концентрации 0,5% с целью удаления липидной оболочки вирионов и поверхностных белков.

МКА к кор-белку сорбировали в лунки 96-луночных панелей Nunc Maxisorp (Дания) в концентрации 5 мкг/мл (50 мкл) в растворе PBS в течение ночи при комнатной температуре, отмывали (PBS+0,1% твин-20) и блокировали неспецифические участки связывания 5% обезжиренным сухим молоком на PBS в течение часа при 37°С. Затем наносили подготовленные образцы (50 мкл) и инкубировали 2 ч при 37°С при постоянном встряхивании. Одновременно вносили разведения положительного контроля - рекомбинантного кор-белка. После отмывки на 1 ч (37°С) добавляли конъюгаты - МКА к core-белку, меченные пероксидазой хрена, в блокировочном растворе (1% казеин в PBS-твин-20). Выявление ферментативной активности связавшейся пероксидазы проводили с использованием субстрата тетраметилбензидина (ТМБ). Измеряли оптическую плотность (ОП) образцов в двухволновом режиме - при длине волны 450 нм (измерение) и 620 нм (референс). Пробы считали положительными, если их ОП превышала критическую. Последнюю вычисляли, как среднюю ОП отрицательных контролей (плазмы доноров, не содержащие анти-ВГС) плюс две величины стандартного отклонения. Количество кор-белка в образцах оценивали по калибровочной кривой с рекомбинантным кор-белком, для которого показана линейная зависимость ОП от концентрации в диапазоне 0,1-15 нг/мл.

Исследования образцов в ИФА показали, что из 25 вариантов различных сочетаний испытуемых моноклональных антител самой высокой чувствительностью обладают комбинации, составленные из МКА 27, 1F9, 4G5 и 6D1 (таблица 1). Сравнительный анализ показал, что комбинация МКА 27, 1F9 и 4G5 (в равных соотношениях) при сорбции на твердую фазу и в виде конъюгатов более эффективно выявляет кор-белок в большинстве образцов, которые дали отрицательные результаты при использовании индивидуальных МКА. Так, применение комбинации данных МКА позволило достичь чувствительности 88% и выявить кор-белок в 15 из 17 исследованных образцов. Например, по сравнению с вариантом МКА 27-27 кор-белок был дополнительно обнаружен в 3 образцах, еще в 3 была значительно повышена интенсивность положительного сигнала. Чувствительность выявления рекомбинантного кор-белка была 300 пг/мл, что в пересчете на исходный объем плазмы с учетом 15-кратного концентрирования составило 20 пг/мл. Отсутствие кор-белка в 2 образцах при наличии РНК ВГС может свидетельствовать о низкой концентрации вируса в крови. Плазмы ВГС-негативных доноров не обнаружили неспецифических взаимодействий с МКА 27,1F9 и 4G5 (специфичность - 100%).

Пример 3. Выявление кор-белка ВГС в образцах сывороток и плазм лиц, инфицированных ВГС различных генотипов.

Известно, что ВГС обладает высокой генетической изменчивостью. В России наиболее распространены генотипы 1 (субтип 1b) и 3 (субтип 3а), реже встречается ВГС генотипа 2. Оригинальные МКА были получены при иммунизации мышей рекомбинантными белками, синтезированными в соответствии с аминокислотной последовательностью кор-белка генотипа 1b. Важно было выяснить возможность использования разработанного способа диагностики гепатита С для выявления ВГС разных генотипов.

Исследовали сыворотки и плазмы крови от 57 ВГС-позитивных лиц, среди которых были больные с острым и хроническим гепатитом С (ОГС и ХГС) и инфицированные доноры крови. Генотипирование образцов проводили с помощью ПЦР с использованием праймеров из участка кор-белка. Подготовку образцов и проведение ИФА осуществляли по методикам, описанным в примере 2. В сэндвиче использовали комбинацию МКА 27, 1F9 и 4G5.

Выявление кор-белка в сыворотках с генотипами 1 (1a и 1b) и 3 (3а) было сходным и достигало 89% (таблица 2). В образцах с генотипом 2 (2а, 2b и 2с) кор-белок был обнаружен реже (в 69% случаев); этот показатель, однако, достоверно не отличался от такового для генотипов 1 и 3 (р>0,05). Таким образом, разработанный способ диагностики гепатита С эффективно выявлял ВГС по крайней мере трех генотипов, наиболее актуальных для России. Детекция кор-белка генотипов 2 и 3, возможно, обусловлена присутствием в сэндвиче МКА 1F9: эти антитела, как было установлено с помощью технологии фагового дисплея, опознают участок аминокислотной последовательности (81-84 а.о.), консервативный у всех известных генотипов ВГС (Е.А.Речкина, Г.Ф.Денисова, О.В.Масалова, Л.Ф.Лидеман, Д.А.Денисов, Е.И.Леонова, Р.И.Атауллаханов, С.В.Гурьянова, А.А.Кущ. Картирование антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея // Молекулярная биология, 2006, т.40, №2, с.357-368).

Пример 4. Использование разработанного способа для диагностики ранних стадий острого гепатита С.

При инфицировании вирусом гепатита С характерна длительная (продолжительностью до нескольких месяцев) фаза серонегативного «окна»; в этот период можно выявить только прямые маркеры ВГС - РНК и вирусспецифические белки. Цель работы - выявление кор-белка ВГС у пациентов с острым гепатитом в серонегативный период.

Исследовали образцы сывороток от 4 больных с симптомами острого гепатита (желтуха, гепатоспленомегалия, повышение аланинаминотрансферазы (АЛТ) более чем в 10 раз по сравнению с нормой). При первичном скрининге сывороток антитела к ВГС, маркеры других вирусных гепатитов, а также иные этиологические причины не обнаружены, в связи с чем этим больным был постановлен диагноз острого гепатита неясной этиологии. Далее проводили динамическое наблюдение за этими больными.

Подготовку образцов и сэндвич-ИФА выполняли, как описано в примере 2, использовали комбинацию МКА 27, 1F9 и 4G5. РНК определяли с помощью ПЦР. Наличие и спектр антител к белкам ВГС выявляли с использованием скринирующих и подтверждающих тест-наборов фирмы "Диагностические системы" (г.Нижний Новгород).

У 2 пациентов (№1 и №2) при отсутствии анти-ВГС антител были выявлены как кор-белок, так и РНК ВГС (таблица 3). Таким образом, этим больным был поставлен диагноз острого гепатита С. В дальнейшем у этих пациентов диагноз был подтвержден - отмечена сероконверсия ВГС. У 2 пациентов (№3 и №4) в образцах не определялись ни кор-белок, ни РНК ВГС; при динамическом наблюдении данных пациентов также не обнаружен ни один из маркеров гепатита С, в связи с чем диагноз острого гепатита неясной этиологии остался без изменений.

Таким образом, разработанный сэндвич-вариант иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител, включающей МКА 4G5, обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять кор-белок в крови как у бессимптомных ВГС-инфицированных доноров, так и у больных острым и хроническим гепатитом С. Показано достоверное совпадение (р<0,05) результатов определения кор-белка данным способом и РНК ВГС методом ПЦР. Предлагаемый способ позволяет диагностировать с большой вероятностью гепатит С уже на ранних стадиях заболевания, а именно: в тот период, когда еще не выявляются специфические антитела, и эффективен для детекции ВГС по крайней мере трех генотипов, наиболее актуальных для России. Преимущества количественного определения кор-белка могут быть полезны для определения вирусной нагрузки при интерферонотерапии. Внедрение метода в практику позволит увеличить надежность диагностики гепатита С и вирусную безопасность гемотрансфузий.

Таблица 1
Эффективность выявления кор-белка в составе вирионов в РНК-позитивных плазмах доноров с помощью различных сочетаний моноклональных антител
№ вариантаСостав сэндвича - МКА-конъюгатЭффективность выявления core-белка в составе вирионов в РНК-позитивных плазмах доноров127-2712/17*71**227-4G51/520327-1F94/1136427-6D110/15675D4-275/9566D4-4G58/14577D4-1F93/11278D4-6D15/13389D4-1A124/1040101А12-272/1020111A12-4G56/1060121A12-6D16/967131А12-1А122/1414141F9-276/1250151F9-1F910/1471161F9-6D110/1471176D1-276/1346186D1-4G57/1070196D1-6D16/1443206D1-1A124/1040214G5-276/1060224G5-4G55/1050234G5-1F93/1030244G5-6D16/1060254G5-1A126/11552627, 1F9, 4G5 - 27, 1F9, 4G515/1788Примечание: * количество core-позитивных плазм / количество исследованных РНК-позитивных плазм доноров; ** - % core-позитивных плазм крови

Таблица 2
Сравнительная эффективность выявления core-белка у ВГС-позитивных доноров и пациентов, инфицированных ВГС различных генотипов
Генотипы ВГСЭффективность выявления core-белка в сывороткахВГС-позитивные донорыБольные ОГС и ХГСне иссл.2/31b21/23*8/9Итого в генотипе 131/35 (88,6%)1/26/92bне иссл.1/11/1не иссл.Итого в генотипе 29/13 (69,2%)4/44/5Итого в генотипе 38/9 (88,9%)Примечание: * количество core-позитивных сывороток / количество исследованных сывороток данного генотипа

Таблица 3
Выявление маркеров ВГС у пациентов с острым гепатитом в динамике
пациент №день от начала болезни/ желтухиконц. кор-белка, пг/млРНКантитела к ВГС*АЛТ (мкмоль/мин·л)CoreNS3NS4NS5114/10139+отр. скрининг41227/23<20-0,8**1,20,30135220/18152+отр. скрининг120025/23512+0,53,10065231/2974н/и0,73,30039453/5169+1,53,000155314/12<20-отр. скрининг105035/33<20-0000412,5 мес.<20-0000397 мес.<20-000030413/3<20-отр. скрининг131619/9<20-000070026/16<20-00001924 мес.<20-000023Примечания: * - определение антител к ВГС проводили с помощью скринирующих и подтверждающих тест-систем "Диагностические системы" (г.Нижний Новгород); отр. скрининг - суммарные антитела к ВГС не обнаружены, пол. скрининг - обнаружены; ** - ОП образцов с антигенами ВГС в ИФА; "-" - не обнаружено; н/и - не исследовали.

Похожие патенты RU2329303C2

название год авторы номер документа
НАБОР АНТИГЕНОВ ДЛЯ РАЗДЕЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К СТРУКТУРНЫМ И НЕСТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА ГЕПАТИТА С 2007
  • Дмитриева Рената Игоревна
RU2370776C2
НАБОР АНТИГЕНОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА C "ДС-HCV-АНТИГЕНЫ" 2004
  • Бурков А.Н.
  • Обрядина А.П.
  • Уланова Т.И.
  • Гладышева М.В.
RU2262704C1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ РАБОЧЕГО СТАНДАРТА СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ АНТИТЕЛА К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С 2008
  • Канев Александр Николаевич
  • Юдина Ирина Викторовна
  • Черепанова Наталья Сангиреевна
  • Бектимиров Тагир Абдулаевич
  • Шалунова Нина Васильевна
  • Мусина Елена Ефграфовна
  • Бочарова Нина Григорьевна
  • Дроздов Илья Геннадьевич
  • Медуницин Николай Васильевич
RU2380711C2
Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1F1 - продуцент моноклонального антитела к нуклеокапсидному белку N вируса SARS-CoV-2 2021
  • Черепушкин Станислав Андреевич
  • Гребенникова Татьяна Владимировна
  • Цибезов Валерий Владимирович
  • Ларичев Виктор Филиппович
  • Щебляков Дмитрий Викторович
  • Есмагамбетов Ильяс Булатович
  • Фаворская Ирина Алексеевна
  • Деркаев Артем Алексеевич
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2769817C1
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЯДЕРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА С КЛАССА IGM 1997
  • Мукомолов С.Л.
  • Плотникова В.А.
  • Жебрун А.Б.
  • Вербов В.Н.
  • Колобов А.А.
  • Кампе-Немм Е.А.
  • Шпень В.М.
RU2142134C1
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЯДЕРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА С 1997
  • Мукомолов С.Л.
  • Плотникова В.А.
  • Жебрун А.Б.
  • Вербов В.Н.
  • Колобов А.А.
  • Кампе-Немм Е.А.
  • Шпень В.М.
RU2133622C1
Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 2021
  • Черепушкин Станислав Андреевич
  • Гребенникова Татьяна Владимировна
  • Цибезов Валерий Владимирович
  • Ларичев Виктор Филиппович
  • Щебляков Дмитрий Викторович
  • Есмагамбетов Ильяс Булатович
  • Фаворская Ирина Алексеевна
  • Деркаев Артем Алексеевич
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2771288C1
ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЯДЕРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА С В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 1997
  • Мукомолов С.Л.
  • Плотникова В.А.
  • Жебрун А.Б.
  • Вербов В.Н.
  • Колобов А.А.
  • Кампе-Немм Е.А.
  • Шпень В.М.
RU2138286C1
ПАНЕЛЬ СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ АНТИТЕЛА К АНТИГЕНАМ HCV РАЗНЫХ СУБТИПОВ 2010
  • Канев Александр Николаевич
  • Юдина Ирина Викторовна
  • Черепанова Наталья Сангиреевна
  • Максютов Ринат Амирович
  • Дроздов Илья Геннадиевич
  • Салим Камили
RU2456617C2
СПОСОБЫ УСКОРЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА С, ОСНОВАННЫЕ НА ОБНАРУЖЕНИИ ГЕМАГГЛЮТИНИНОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С И АНТИТЕЛ К НИМ В РГА И РТГА В КРОВИ ЛЮДЕЙ 2000
  • Дерябин П.Г.
  • Исаева Е.И.
  • Львов Д.К.
RU2194993C2

Реферат патента 2008 года МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ НУКЛЕОКАПСИДА (КОР) ВИРУСА ГЕПАТИТА С-4G5, СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВГС-ИНФЕКЦИИ И КОМБИНАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается диагностики гепатита С. Сущность изобретения заключается в создании моноклональных антител, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С - 4G5, и разработке способа диагностики на основе сэндвич-варианта иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида (кор-белка) вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, направленных к линейным и к конформационно-зависимым эпитопам кор-белка: МКА 1F9 - к линейному эпитопу с аминокислотными остатками (а.о.) 81-85, МКА 27 и 4G5 - к конформационно-зависимым эпитопам на участке 1-150 а.о. кор-белка. При этом комбинация моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С, может быть использована как для захвата (захватывающие антитела), так и для детекции (детектирующие антитела) кор-белка. Разработанный сэндвич-вариант иммуноферментного количественного анализа для детекции нуклеокапсида вируса гепатита С с использованием комбинации моноклональных антител, включающей МКА 4G5, обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять кор-белок в крови как у бессимптомных ВГС-инфицированных доноров, так и у больных острым и хроническим гепатитом С. Способ позволяет диагностировать с большой вероятностью гепатит С на ранних стадиях заболевания и эффективен для детекции ВГС по крайней мере трех генотипов, наиболее актуальных для России. Преимущества количественного определения кор-белка могут быть полезны для определения вирусной нагрузки при интерферонотерапии. 3 н.п. ф-лы, 3 табл.

Формула изобретения RU 2 329 303 C2

1. Моноклональное антитело 4G5, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus 4G5, депонированным в коллекции перевиваемых клеточных культур ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 8/1/1, иммунореактивное с белком нуклеокапсида (кор-белком) вируса гепатита С (ВГС) и специфичное к конформационно-зависимой антигенной детерминанте на участке 1-150 аминокислотных остатков кор-белка ВГС.2. Способ диагностики ВГС-инфекции, включающий выявление кор-белка вируса гепатита С в сэндвич-варианте иммуноферментного количественного анализа путем использования комбинации моноклональных антител, иммунореактивных с кор-белком вируса гепатита С, отличающийся тем, что используемые в комбинации моноклональные антитела 27, 1F9 и 4G5 направлены к линейным и к конформационно-зависимым эпитопам (антигенным детерминантам) кор-белка ВГС: МКА 1F9 - к линейному эпитопу с аминокислотными остатками (а.о.) 81-85, МКА 27 и 4G5 - к конформационно-зависимым эпитопам на участке 1-150 а.о. кор-белка.3. Комбинация моноклональных антител 27, 1F9 и 4G5, иммунореактивных с белком нуклеокапсида вируса гепатита С, используемая для захвата и детекции кор-белка при осуществлении способа по п.2.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2008 года RU2329303C2

US 2004229218 A, 18.11.2004
JP 2006180884 А, 13.07.2006
US 2003049608 А, 13.03.2003
ОЛИГОМЕРНАЯ ЧАСТИЦА, ИНДУЦИРУЮЩАЯ ИММУНИТЕТ ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОМЕРНОЙ ЧАСТИЦЫ, КОМПОЗИЦИЯ, СПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО, НАБОР (ВАРИАНТЫ), ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С 1999
  • Депла Эрик
  • Мартенс Герт
  • Босман Альфонс
  • Ван Вейнендале Франс
RU2247729C2

RU 2 329 303 C2

Авторы

Масалова Ольга Владимировна

Вишневская Татьяна Викторовна

Кущ Алла Александровна

Даты

2008-07-20Публикация

2006-08-02Подача