Изобретение относится к синтезу и размещению материалов в определенном месте. В частности, одним из аспектов изобретения являются способ получения различных химических последовательностей в определенных местах на поверхности одного субстрата и устройство для его осуществления. Эти способ и устройство могут использоваться, например, для получения олигомеров, пептидов, нуклеиновых кислот, олигосахаридов, фосфолипидов, полимеров или обладающих лекарственными свойствами препаратов, в частности, для возможности получения большого количества различных химических соединений для использования их при скрининге на биологическую активность.
Выяснение взаимосвязи между строением молекул и их активностью является главной задачей при изучении биологических систем. Знание такой зависимости имеет важное значение, например, для понимания механизма функционирования ферментов, путей взаимодействия клеток друг с другом, а также для клеточного контроля и действия систем обратной связи.
Известно, что некоторые молекулы взаимодействуют и связываются с другими молекулами, имеющими весьма специфическое трехмерное пространственное и электронное распределение. Любую большую молекулу, обладающую такой специфичностью, можно рассматривать как рецептор независимо от того, является ли она ферментом, катализирующим гидролиз метаболического промежуточного соединения, белком поверхности клетки, служащим промежуточным звеном при мембранном транспорте ионов, гликопротеином, служащим для идентификации конкретной клетки по отношению к ее соседним клеткам, антителом ИгГ-класса, циркулирующим в плазме, олигонуклеотидной последовательностью ДНК в ядре и т.п. Различные молекулы, селективно связывающие рецепторы, известны под названием лиганды.
Существуют многочисленные методы анализа для определения степени сродства известных рецепторов и лигандов, однако информация, которая может быть получена из такого рода экспериментов, часто ограничивается числом и типом известных лигандов. Новые лиганды открываются иногда случайно или благодаря использованию новых методов для изучения строения молекул, включая рентгеновский кристаллографический анализ и рекомбинантные генетические методы исследования белков.
Пептиды небольших размеров являются типичной системой для выяснения взаимосвязи между их строением и биологической активностью. Пептиды представляют собой последовательности аминокислот. При конденсации двадцати природных аминокислот в полимерные молекулы возникает огромное количество трехмерных конфигураций, структура которых зависит от конкретной последовательности аминокислот и природы растворителя. Так, например, из 20 природных аминокислот в принципе может быть получено 205 или 3,2 миллиона различных пентапептидов. Вероятность того, что молекулы такого размера могут оказаться полезными при изучении образования рецепторных связей, подтверждается данными эпитопного анализа, из которых следует, что некоторые антитела распознают с высокой специфичностью последовательности, состоящие из нескольких аминокислот. Кроме того, средний молекулярный вес аминокислот ставит пептиды с небольшими размерами молекул в один ряд со многими использующимися в настоящее время фармацевтическими препаратами.
Одной из задач поиска, основанного на таком изучении взаимосвязи между строением молекул и их активностью, является обнаружение соединений, обладающих лекарственными свойствами. В большинстве случаев современный поиск лекарственных препаратов можно рассматривать как поиск новых лигандов с нужным характером специфичности к биологически важным рецепторам.
Другим примером является поиск новых соединений для использования в сельском хозяйстве, например, в качестве пестицидов и гербицидов.
Иногда попытки создания рациональных подходов к конструированию лигандов оказываются трудными или непродуктивными. Известные способы получения большого количества различных полимеров при попытке использования их в масштабах, достаточных для эффективного рационального или случайного скрининга, оказались весьма непродуктивными. Так, например, метод Merrifield (J. Am. chem. Soc. , 1963, 85, 2149-2154), на который мы все время ссылаемся в настоящей заявке использовался для синтеза пептидов на твердой подложке. По этому способу аминокислота ковалентно связывается с подложкой из нерастворимого полимера. Другая аминокислота с защищенной альфа-группой подвергается взаимодействию с вышеуказанной ковалентно-связанной кислотой с образованием в результате дипептида. После промывки защитную группу удаляют и добавляют к дипептиду третью кислоту с защищенной альфа-группой. Этот процесс продолжают до получения пептида нужной длины и с нужной последовательностью. Использование метода Merrifield экономически неоправданно для синтеза более, чем нескольких пептидных последовательностей в день.
Для синтеза большого количества полимерных последовательностей было предложено также использовать несколько реакторов для синтеза полимеров. Так, например, для синтеза линейного полимера на твердофазной подложке можно использовать трубчатый реактор с автоматическим последовательным добавлением реагентов. Этот способ, однако, не позволяет синтезировать достаточно большое количество полимерных последовательностей для эффективного и экономически оправданного скрининга.
Известны также способы получения большого количества полимерных последовательностей, по которым в перфорированную емкость помещают заданное количество реакционноспособных частиц, размер которых больше размера отверстий. Такие емкости могут быть подвергнуты селективному взаимодействию с нужными материалами для получения целевых молекул с нужными последовательностями. Как и в случае других известных способов, этот способ нельзя, в частности, использовать для синтеза достаточно большого количества различных полипептидов для эффективного скрининга.
В литературе описаны также другие способы и среди них синтез пептидов на 96 пластиковых штифтах, соответствующих формату стандартного титрационного микропланшета. К сожалению, несмотря на определенный прогресс этих способов, они не позволяют решить главных проблем. Так, например, с их помощью нельзя экономично синтезировать и исследовать большое количество различных последовательностей.
Из всего вышесказанного следует, что существует необходимость в разработке усовершенствованного способа и устройства для синтеза большого количества различных химических последовательностей в определенном месте.
Описаны усовершенствованные способ и устройство для получения различных полимеров.
По предпочтительному варианту осуществления изобретения на субстрате иммобилизируются сшивающие молекулы, концевые реакционноспособные функциональные группы которых защищены фотоотщепляемыми защитными группами. С помощью литографических способов фотоотщепляемая защитная группа подвергается воздействию света и удаляется из сшивающих молекул в первых выбранных областях. Субстрат затем промывают или другим образом подвергают контактированию с первым мономером, который реагирует со свободными функциональными группами сшивающих молекул. По предпочтительному варианту осуществления изобретения указанным мономером является аминокислота, имеющая фотоотщепляемую защитную группу у аминного или карбоксильного конца, и сшивающая молекула связывается с аминной или карбоксильной группой, защищенной фотоотщепляемой защитной группой.
После этого воздействию света подвергаются вторые выбранные области, в результате чего в этих областях удаляется фотоотщепляемая защитная группа из комплекса сшивающая молекула - защищенная аминокислота. Субстрат затем подвергают контактированию с вторым мономером, имеющим фотоотщепляемую защитную группу, в результате чего происходит взаимодействие его со свободными функциональными группами. Этот процесс повторяют, используя соответствующим образом подобранные мономеры, до тех пор, пока не получают полимеры нужной длины с нужной химической последовательностью. Фотолабильные группы затем при желании удаляют и последовательность при желании обрывают. Защитные группы боковой цепи при наличии их в молекуле также удаляют.
Благодаря использованию литографической техники, описанной в настоящей заявке, становится возможным направлять свет на относительно небольшие и точно определенные участки субстрата. В результате обеспечивается возможность синтезировать определенные химические последовательности с определенным местоположением на субстрате.
Полученный в результате субстрат может использоваться для различных целей, в том числе, например, для скрининга большого количества полимеров, направленного на определение их биологической активности. Для определения биологической активности субстрат подвергают выдержке с одним или несколькими рецепторами, такими как полные клеточные антитела, рецепторы на пузырьках, липиды, или любыми другими рецепторами. Выбранные рецепторы предпочтительно метят, например, флуоресцентной или радиоактивной меткой, или меченным антителом, способным взаимодействовать с рецептором. Положение метки на субстрате определяют с помощью, например, фотонного детектора или авторадиографии. Зная последовательность материала в месте ее связи, определенном путем детектирования, можно быстро определить, какая последовательность связана с рецептором. Поэтому такой способ может использоваться для скрининга большого количества пептидов. Другие возможные области применения настоящего изобретения включают диагностические определения, при которых различные антитела против конкретных рецепторов размещают на субстрате, например, скрининг сыворотки крови на иммунодефицит. Другими областями применения являются, например, селективное "легирование" органических материалов в полупроводниковых устройствах и т.п.
Одним из предметов настоящего изобретения является усовершенствованная реакторная система для синтеза полимеров. Такая реакторная система включает держатель субстрата, расположенный вокруг него таким образом, что между субстратом и держателем образуется реакционное пространство, через которое или в которое подаются насосом или протекают жидкие реагенты. На субстрате размещается или фокусируется маска и освещается таким образом, чтобы удалить защитные группы в определенных областях субстрата в реакционном пространстве. Мономер прокачивают через реакционное пространство или другим образом подвергают контактированию с субстратом, в результате чего происходит взаимодействие его с областями с удаленными защитными группами. Путем создания на субстрате областей с селективно удаленными защитными группами и пропускания через реакционное пространство определенных мономеров можно синтезировать нужные полимеры с известным расположением.
Предметом изобретения являются также усовершенствованные способы детектирования и устройство для их осуществления. В предлагаемых способе и устройстве для детектирования используется субстрат с большим количеством полимерных последовательностей, расположенных в определенных точках его поверхности. Такой субстрат подвергается взаимодействию с имеющим флуоресцентную метку рецептором, который связывается с одной или несколькими полимерными последовательностями. Субстрат затем помещают в детекторный микроскоп для идентификации локаций, в которых произошло связывание. Микроскопное детектирующее устройство включает монохроматический или полихроматический источник света для облучения субстрата, средства для детектирования флуоресцентного излучения субстрата и средства для определения места, из которого исходит флуоресцирующее излучение. В некоторых вариантах осуществления средства для детектирования флуоресцентного излучения могут включать счетчик фотонов. Средства для определения места, из которого исходит флуоресцентное излучение, могут включать координатный стол для субстрата. Передвижение каретки и сбор данных осуществляются с помощью цифрового компьютера по специальной программе.
Более подробно суть настоящего изобретения и его преимущества излагаются в других частях описания и на прилагаемых чертежах.
На фиг. 1 изображены маскирование и облучение субстрата в первой области, поперечный разрез субстрата; на фиг. 2 - субстрат после взаимодействия с мономером "A"; на фиг. 3 - облучение субстрата во второй области; на фиг. 4 - субстрат после взаимодействия с мономером "B"; на фиг. 5 - облучение мономера "A"; на фиг. 6 - субстрат после второго взаимодействия с "B"; на фиг. 7 - субстрат после окончания обработки; на фиг. 8 и 9 - два варианта реакторной системы для формирования на субстрате большого количества полимеров; на фиг. 10 - детекторное устройство для определения местоположения флуоресцентных меток на субстрате; на фиг. 11 - иллюстрация способа получения тримеров мономеров "A" и "B"; на фиг. 12 и 13 - флуоресцентные следы для стандартных флуоресцентных бусин; на фиг. 14 - флуоресцентные кривые для NVOC соответственно без облучения светом и после облучения; на фиг. 15 и 16 - формирование предметного стекла с контрольной структурой YGGFL и GGFL, подвергнутого взаимодействию с антителом Герца; на фиг. 17 - картирование шестнадцати последовательностей, синтезированных на двух разных стеклянных предметных стеклах.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления.
Содержание
1. Словарь.
2. Общие положения.
3. Синтез полимеров.
4. Подробное описание одного из вариантов осуществления реакторной системы.
5. Подробное описание одного из вариантов осуществления флуоресцентного детекторного устройства.
6. Определение прочности связывания рецепторов.
7. Примеры.
A. Подготовка предметных стекол.
B. Синтез восьми тримеров "A" и "B".
C. Синтез димера аминопропиловой и флуоресцентной групп.
D. Определение величины сигнала.
E. Определение числа молекул на единицу поверхности.
F. Удаление NVOC и введение флуоресцентной метки.
C. Использование маски при удалении NVOC.
H. Введение YGGFL и последующее взаимодействие с антителом Герца и козьим антимышиным антителом.
I. Мономер-мономерное формирование YGGFL и последующее взаимодействие его с меченым антителом.
J. Мономер-мономерный синтез PGGFL и YGGFL.
K. Мономер-мономерный синтез YGGFL и YPGGFL.
L. Синтез шестнадцати различных аминокислотных последовательностей и определение их сродства с антителом Герца.
8. Другой вариант осуществления изобретения.
9. Выводы.
Словарь
Нижеперечисленные термины, использующиеся в настоящем описании, имеют следующие значения:
1. Комплементарный - употребляется для обозначения топологической совместимости или совместимости взаимодействующих поверхностей молекулы лиганда и ее рецептора, т. е. рецептор и его лиганд могут быть названы комплементарными, кроме того, комплементарными являются характеристики контактирующих поверхностей.
2. Эпитоп - часть молекулы антигена, трансдифференцированная областью взаимодействия с подклассом рецепторов, известных под названием антитела.
3. Лиганд - лигандом называется молекула, узнаваемая определенным рецептором, примерами лигандов, которые могут быть исследованы с помощью заявляемого изобретения, являются (этими примерами число таких лигандов однако не ограничивается) агонисты и антагонисты клеточных мембранных рецепторов, токсины и яды, вирусные эпитопы, гормоны (например, наркотики, стероиды и т. д. ), гормонные рецепторы, пептиды, ферменты, субстраты ферменты, лекарства, лектины, сахара, одигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, одигосахариды, белки и моноклональные антитела.
4. Мономер - элемент набора небольших молекул, которые могут соединяться друг с другом, образуя полимер, такой набор мономеров включает, не ограничиваясь, однако, приведенными примерами, в частности, набор природных L - аминокислот, набор D - аминокислот, набор синтетических аминокислот, набор нуклеотидов и набор пентоз и гексоз, в используемом в настоящем описании значения под мономерами имеется в виду любой член базисного набора для синтеза полимера, например, димеры L-аминокислот образуют базисный набор 400 мономеров для синтеза полипетидов, на отдельных стадиях синтеза полимера могут использоваться различные наборы мономеров.
5. Пептиды - полипер, образованный альфа-аминокислотами в качестве мономеров, связанными между собой амидными связями, другое название - полипептиды, в тексте настоящей заявки, когда речь идет об аминокислотах, имеются в виду как L - оптические, так и D - оптические изомеры, молекулы пептидов состоят из более, чем двух, а часто из более, чем двадцати аминокислот, для обозначения аминокислот используются стандартные аббревиатуры (например, P обозначает пролин), эти аббревиатуры приведены в руководстве Stryer, Biochemistry 3-е изд., 1988, которое включено в перечень ссылок.
6. Излучение - энергия, которая может селективно излучаться, включает энергию с длиной волны 10-14 - 104 м, это может быть, например, излучение электронного пучка, гамма-излучение, рентгеновское излучение, ультрафиолетовое излучение, излучение энергии видимого света, инфракрасное излучение, микроволновое излучение и радиоволновое излучение, под "облучением" имеется в виду обработка поверхности излучением.
7. Рецептор - молекула, имеющая сродство к определенному лиганду, рецепторы могут быть природными и искусственными, они могут использоваться как сами по себе, так и в виде агрегатов с другими частицами, рецепторы могут быть связаны с помощью ковалентных или нековалентных связей со связующим элементом или непосредственно, или через специфическое связующее вещество, примеры рецепторов, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, включают (этими примерами однако не ограничивается число возможных для использования рецепторов) антитела, клеточные мембранные рецепторы, моноклональные антитела и антисыворотки, связанные со специфическими антигенными детерминантами (например, на вирусах, клетках или других материалах), лекарства, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны и органеллы, иногда рецепторы называют в литературе антилигандами, в настоящей заявке между обоими терминами не делаются различия, "пара лиганды - рецептор" образуется при объединении двух макромолекул в результате молекулярного узнавания и представляет собой комплекс, другими примерами рецепторов, которые могут быть исследованы с помощью настоящего изобретения (этими примерами число таких рецепторов, однако, не ограничивается), являются: а) рецепторы микроорганизмов: обнаружение лигандов, которые могут связываться с рецепторами, например, специфический транспорт белков или ферментов, имеющий важное значение для выживания микроорганизмов, представляет интерес для получения нового класса антибиотиков. В частности, интерес представляет антибиотики против opportunistic fungi, protozoa и бактерий, стойких к существующим антибиотикам,
b) ферменты: например, место связывания ферментов, таких как ферментов, ответственных за расщепление нейтротрансмиттеров, обнаружение лигандов, связывающихся с определенными рецепторами с целью модулирования действия ферментов, расщепляющих различные нейротрансмиттеры, представляет интерес для получения лекарств для лечения нарушений нейротрансмиссии,
c) антитела: настоящее изобретение может, например, представлять интерес для определения места связывания лиганда в молекуле антитела, связанный с эпитопом исследуемого антигена, определение последовательности, имитирующей антигенный эпитоп, может привести к разработке вакцин, основой иммуногена которых является одна или несколько таких последовательностей, диагностические агенты или соединения, которые могут оказаться пригодными для лечения, например, аутоиммунных заболеваний (например, за счет блокирования аутоантител),
d) нуклеиновые кислоты: для получения последовательностей, связывающих ДНК или РНК, могут быть синтезированы последовательности нуклеиновых кислот,
e) каталитические полипептиды: полимеры, предпочтительно полипептиды, способствующие протеканию химических реакций, включая конверсию одного или нескольких реагентов с образованием одного или нескольких продуктов. В таких полипептидах обычно имеется рецепторная зона, специфичная по меньшей мере к одному реагенту или реакционноспособному промежуточному соединению, и реакционноспособная функциональная группа, расположенная рядом с этой рецепторной зоной, которая может химически модифицировать связанный реагент. Каталитические пептиды описаны, например, в заявке США N 404920, включенной в перечень ссылок к настоящей заявке.
f) рецепторы гормонов: например, рецепторы инсулина и гормонов роста. Обнаружение лигандов, прочно связывающихся с такими рецепторами, может представлять интерес, например, для получения оральных препаратов взамен ежедневных инъекций, которые необходимо делать больным диабетом для снятия симптомов болезни, а также для замены редкого человеческого гормона роста, который может быть получен только из трупов или с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Другим примером являются рецепторы сосудосуживающих гормонов. Обнаружение лигандов, которые связываются с такими гормонами, может позволить создавать лекарства, контролирующие давление крови,
g) рецепторы наркотиков: обнаружение лигандов, которые связываются с рецепторами наркотиков в мозгу, может помочь создавать заменители морфина и других аналогичных лекарств, обладающие менее сильным наркотическим действием.
8. Субстрат - материал с жесткой или полужесткой поверхностью. В большинстве случаев по меньшей мере одна поверхность субстрата является практически плоской, хотя в отдельных случаях может оказаться необходимым физически разделить области синтезов различных полимеров с помощью, например, лунок, выступающих областей, канавок травления и т.п. По другому варианту на поверхности могут быть сформированы маленькие бисеринки, облегающие процесс синтеза.
9. Защитная группа - материал, связанный с мономерным звеном, который может быть пространственно удален путем селективного воздействия активатора, например, электромагнитного излучения. Примерами защитных групп, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, являются нитровератрилоксикарбонил, нитробензилоксикарбонил, диметилдиметоксибензилоксикарбонил, 5-бром-7- нитроиндолинил, o-окси, α - метилциннамоил и 2-оксиметиленантрахинон. Другими примерами активаторов являются ионные пучки, магнитные поля, пучки электронов, рентгеновское излучение и т.п.
10. Предетерминированная область - предетерминированной областью называется локализованная поверхность, активирующаяся, проактивированная или предназначенная для активации для образования полимера. Предетерминированная область может иметь любую форму. Она может быть, например, круглой, прямоугольной, эллиптической, клиновидной и т.д. Для кратности в дальнейшем предетерминированные области иногда будут называться просто "областями".
11. Практически чистый - полимер, считается практически чистым в пределах предетерминированной области субстрата, если он имеет характеристики, отличающие его от других предетрминированных областей. Обычно чистоты характеризуют биологической активностью ил функцией однородности последовательности. Как правило, эти характеристики определяют, изучая связанные с определенным лигандом или рецептором.
2. Общие положения
Предметами настоящего изобретения являются способ и устройство для получения и использования субстрата с большим количеством полимерных последовательностей, расположенных в определенных, заранее заданных областях. Изобретение описано, в первую очередь, на примере получения молекул, содержащих последовательности аминокислот, однако его можно легко использовать для получения и других полимеров. Такими полимерами могут быть, например, линейные и циклические полимеры нуклеиновых кислот, полисахариды, фосфолипиды и пептиды, содержащие α , β - или ω -аминокислоты, гетерополимеры, в которых известное лекарство ковалентно связано с любым из вышеперечисленных полимеров, полиуретаны, полиэфиры, поликарбонаты, полимочевины, поиламиды, полиэтиленимины, полиариленсульфиды, полисилоксаны, полиимиды, полиацетаты или другие полимеры, упоминающиеся в настоящем описании. По предпочтительному варианту настоящее изобретение используется для синтеза пептидов.
Полученный предлагаемым способом субстрат может использоваться, например, для скрининга большого количества различных полимеров на предмет использования их в качестве лигандов для связывания с рецептором, хотя, разумеется, изобретение может использоваться и для синтеза рецепторов для связывания с лигандом. Являющийся предметом настоящего изобретения субстрат может использоваться и для других различных целей, к примеру, для определения пептидов и последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с белками, для обнаружения последовательностей, специфически связывающихся с лекарствами, идентификации эпитопов, распознаваемых антителами, для разработки лекарств для клинических и диагностических целей, а также для решения комбинаций вышеперечисленных задач.
По предпочтительному варианту предметом настоящего изобретения является использование субстрата S с поверхностью. На поверхности такого субстрата при необходимости могут быть сформированы мостиковые молекулы L, которые в некоторых случаях служат для облегчения распознавания рецептором синтезированных полимеров.
При желании мостиковые молекулы могут быть химически защищены. Назначением такой защиты является возможность хранения. В некоторых случаях в качестве такой защитной группы, защищающей молекулу от химических изменений, можно использовать, например, t-BOC (третбутоксикарбонил). Такие химические защитные группы могут быть химически удалены путем взаимодействия защищенной молекулы, например, - с кислым раствором. Они служат для защиты поверхности в процессе хранения.
На субстрате или периферийном конце мостиковой молекулы формируется функциональная группа с защитной группой Po. Защитная группа Po может быть удалена путем воздействия на молекулу излучения, электрических полей, электрического тока или других активаторов.
По предпочтительному варианту осуществления изобретения в качестве источника излучения используют ультрафиолетовый (УФ), инфракрасный (ИК) или видимый свет. Как будет видно из дальнейшего, защитная группа может быть электрохимически чувствительной и может быть удалена под воздействием электрического поля. Для удаления защитных групп можно использовать также ионные и электронные пучки.
В некоторых случаях подвергаемые воздействию области и таким образом площади, занимаемые отдельными синтезированными полимерными последовательностями меньше примерно 1 см2 или 1 мм2. Предпочтительно подвергаемая воздействию область меньше примерно 100 мкм2, а в некоторых случаях центр связывания состоит из одной молекулы. В этих областях каждый полимер синтезирован практически в чистом виде.
Непосредственно в процессе или после облучения определенной области субстрата светом осуществляют контактирование его поверхности с первым мономерным звеном M1, которое взаимодействует с функциональной группой, которая подвергалась воздействию на стадии защитной группы P1. P1 может быть такой же, как и P0, но может и отличаться от нее.
В результате после первого цикла определенные первые области поверхности могут включать последовательность:
S-L-M1-P1,
а остальные ее области включают последовательность:
S-L-P0.
После этого действию света подвергают вторые области поверхности (они могут включать и первую область) и осуществлять контактирование их с вторым мономером M2 (это может быть тот же мономер, что и M1 или другой мономер), имеющим защитные группы P2. P2 может быть такой же, как и P0 или P1, но может и отличаться от них. После второго цикла области субстрата могут включать одну или более из следующих последовательностей:
S-L-M1-M2-P2
S-L-M2-P2
S-L-M1-P1 и/или
S-L-P0
Описанный процесс повторяют до тех пор, пока на субстрате не будут синтезированы нужные полимеры нужной длины. Контролируя локализации на субстрате, подвергаемые воздействию света, и реагенты, контактируемые с ним после такого воздействия, можно знать локализацию каждой последовательности.
После этого защитные группы удаляют со всего субстрата или его части и последовательности при желании копируют звеном C. В результате получают субстрат с размещенным на его поверхности большим количеством полимеров общей формулы:
S-[L]-(Mi-(Mj)-(Mk)...(Mx)-[C],
в которой квадратные скобки означают возможные группы, а Mi... Mx-последовательности полимеров. Количество мономеров может варьироваться в широких пределах. По предпочтительному варианту осуществления оно находится в пределах 2-100.
В некоторых случаях в нескольких локализациях субстрата полимеры должны содержать обычную последовательность мономеров. К примеру, хотят синтезировать последовательность S-M1-M2-M3 в первых и последовательность S-M4-M2-M3 во вторых локализациях. Процесс начинают с облучения первых локализаций и контактирования затем субстрата с M1-P, в результате чего в первой локализации получают последовательность S-M1-P. После этого облучают вторые локализации и осуществляют контактирование с M4-P, получая в результате во вторых локализациях последовательность S-M4-P. После этого первую и вторую локализации подвергают облучению и осуществляют контактирование с димером M2-M3 с образованием в результате последовательности S-M1-M2-M3 в первых и S-M4-M2-M3 во вторых локализациях. Для описанного синтеза, естественно, можно использовать обычные последовательности любой длины, в частности, состояние из 2 или более, 2-100, 2-20, наиболее предпочтительно 2-3 мономеров.
По другому варианту осуществления изобретения для получения первого мономерного слоя используют набор масок, после чего проводят селективное удаление защитных групп, облучая субстрат светом различной длины волны. Так, например, для получения субстрата с вышеизложенными последовательностями вначале выделяют первые области с помощью маски и осуществляют взаимодействие их с первым мономером, имеющим первую защитную группу P1, которая может быть удалена путем облучения светом первой длины волны (например, ИК). После этого выделяют с помощью маски вторые области и осуществляют защитную группу P2, которая может быть удалена путем облучения светом второй длины волны (например, УФ). Далее необходимость в масках уже отпадает, поскольку для удаления защитных групп весь субстрат может быть попеременно подвергнут воздействию света первой и второй длин волн.
Полученные на субстрате вышеописанными способами полимеры могут использоваться для различных целей, например, при скрининге на биологическую активность. При таком скрининге субстрат с имеющимися на нем последовательностями подвергают взаимодействию с меченным или немеченным рецептором, например антителом, рецептором на клетке, фосфолипидным пузырьком или любым другим рецептором. По предпочтительному варианту полимеры подвергают взаимодействию с первым немеченным излучаемым рецептором, после чего подвергают взаимодействию с меченным, специфично распознающим указанный рецептор элементом, например антителом. При этом на стадии детектирования будет появляться усиленный сигнал.
Молекулы рецептора могут связываться с одним или несколькими полимерами на субстрате. Присутствие меченного рецептора, а следовательно, и присутствие связанной с этим рецептором последовательности по предпочтительному варианту определяют с помощью авторадиографии, детектирования флуоресценции связывающим заряды устройством, флуоресцентной микроскопии и т.п. Последовательность полимера в локализациях, в которых обнаружена рецепторная связь, может использоваться для определения всей или части последовательности, комплементарной к этому рецептору.
Использование заявляемого изобретения иллюстрируется, в первую очередь, примерами скрининга на биологическую активность. Оно однако может найти и другие области применения. Так, например, оно может использоваться для хранения информации (например, на оптических данных), для получения молекулярных электронных устройств, стационарных фаз, в процессах разделения, для получения красителей и осветлителей, в фотографии и для иммобилизации клеток, белков, лектинов, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.п. на поверхности образцов через молекулярное распознавание специфических полимерных последовательностей. Синтезируя в соседних локализациях одно и тоже соединение в различных прогрессивно меняющихся концентрациях, можно определить градиент для контроля хемотаксиса или для получения dipsticks, которые можно использовать, например, для титрования антитела против возрастающего количества антигена. Синтезируя несколько каталитических молекул, близких по строению, можно путем "координатной иммобилизации" добиться более эффективной многостадийной конверсии. Координатную иммобилизацию можно также использовать в системах с переносом электронов и для придания материалам структурной целостности и других нужных свойств, например смачиваемости, способности оказывать смазывающее действие и т.д.
Кроме того, настоящее изобретение позволяет исследовать биораспределение или фармакокинетические свойства. Так, в частности, для определения стойкости к кишечным или сывороточным протеазам полимеры могут быть копированы флуоресцентной меткой и потом подвергнуты взаимодействию с исследуемой биологической жидкостью.
3. Синтез полимеров.
На фиг. 1 изображен поперечный разрез субстрата 2 в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения. В принципе для осуществления изобретения может использоваться любой субстрат. Он может быть биологическим, небиологическим, органическим, неорганическим или представлять собой комбинацию любых перечисленных субстратов и находиться в форме частиц, нитей, осадков, гелей, листов, трубок, сфер, контейнеров, капилляров, подложек, срезов, пленок, пластин, предметных стекол и т.п. Субстрат может иметь любую форму, например форму диска, квадрата, сферы, круга и т.д. предпочтительно, чтобы субстрат был плоским, однако он может иметь возвышенные или пониженные участки поверхности, на которых протекает синтез. Предпочтительно субстрат вместе с поверхностью образует жесткую подложку, на которой протекает описание реакции. Субстрат и поверхность выбирают таким образом, чтобы обеспечить соответствующие характеристики в отношении абсорбции им света. Например, в качестве субстрата можно использовать полимерную пленку Лангмюра-Блоджетта, стекло с функциональными группами, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4, модифицированный кремний или любой другой из широкого круга гелей или полимеров, например, (поли)тетрафторэтилен, (поли)винилидендифторид, полистирол, поликарбонат или их комбинации.
Представление о других возможных для использования в качестве субстрата материалах специалист в данной области получит при ознакомлении с описанием настоящей заявки. Предпочтительным субстратом для осуществления изобретения является плоское стекло или монокристалл кремния с микрообъектами рельефа менее 10 ангстрем.
По другому варианту осуществления изобретения поверхность субстрата травят известными способами для получения нужной ее структуры. Например, путем образования на ней канавок, V-образных канавок, мезаструктур и т.п. области синтеза могут быть приближены к фокусной точке падающего света, им может быть придана структура отражательного зеркала для оптимального собирания света от флуоресцентных источников и т.д.
Поверхность на субстрате обычно, хотя и не всегда, выполнена из того же материала, что и сам субстрат. Так, поверхность может быть выполнена из любого из широкого круга материалов, например из полимеров, пластиков, смол, полисахаридов, диоксида кремния или из материалов на его основе, углерода, металлов, неорганических стекол, мембран или любых других вышеперечисленных материалов субстрата. В некоторых случаях поверхности может быть придана форма, позволяющая использовать ее для ребристых связующих элементов, которые жестко соединяются с поверхностью субстрата по способу в соответствии с одновременно рассматриваемой заявкой N 404920, на которую мы уже ссылались ранее. Предпочтительно, чтобы на поверхности присутствовали реакционно-способные группы, которыми могут быть карбоксильная, аминогидроксильная или другие группы. Наиболее предпочтительно, чтобы поверхность была оптически прозрачной и имела функциональные группы Si - OH, как это имеет место на поверхности из диоксида кремния.
На поверхность субстрата 4 предпочтительно наносят слой мостиковых молекул 6, хотя такие мостиковые молекулы не являются обязательным элементом настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы мостиковые молекулы имели длину, достаточную для того, чтобы позволить полимерам на сформированном субстрате свободно взаимодействовать с молекулами, приводимыми в контакт с ним. Для обеспечения хорошего контактирования мостиковые молекулы должны иметь длину в 6 - 50 атомов. В качестве мостиковых молекул можно использовать, например, арилацетилен, этиленгликолевые олигомеры, содержащие 2 - 10 мономерных звеньев, диамины, диациды, аминокислоты или комбинации перечисленных соединений. Как будет видно из дальнейшего, возможно использование и других мостиковых молекул.
По другому варианту осуществления изобретения мостиковые молекулы выбирают, исходя из их гидрофильно-гидрофобных свойств с целью повышения доступности синтезированных полимеров к определенным рецепторам. Так, например, в случае гидрофильного рецептора целесообразно, чтобы и мостиковые молекулы имели гидрофильный характер, чтобы позволить рецептору как можно больше приблизиться к синтезированному полимеру.
По другому варианту осуществления изобретения в мостиковые молекулы вводят фотоотщепляемые группы в промежуточном положении. Предпочтительно, чтобы отщепление такой группы происходило при другой длине волны света, чем в случае защитной группы. Это позволяет удалять различные полимеры после завершения синтеза путем облучения субстрата светом рзличной длины волн.
Мостиковые молекулы могут связываться с субстратом через углерод - углеродную связь с использованием, например, (поли)трифторхлорэтиленовых поверхностей или, что более предпочтительно, с помощью силоксановых связей (с использованием, например, поверхностей из стекла или диоксида кремния). По одному из вариантов осуществления силоксановые связи с поверхностью субстрата могут быть образованы за счет взаимодействия мостиковых молекул, имеющих трихлорсилиловые группы. Мостиковые молекулы могут быть связаны с поверхностью в заданном положении, а именно в качестве частей головных групп в полимеризованной пленке Ленгмюра-Блоджетта. По другому варианту осуществления мостиковые молекулы адсорбируют на поверхности субстрата.
Мостиковые молекулы и мономеры, использующиеся при осуществлении настоящего изобретения, имеют функциональные группы, с которыми связываются защитные группы. Предпочтительно защитная группа находится на отдаленном по отношению к субстрату конце мостиковой молекулы. Защитная группа может быть отрицательной (т.е. снижающей реакционную способность мостиковой молекулы по отношению к контактирующему с субстратом мономеру) или положительной (т.е. повышающей реакционную способность мостиковой молекулы по отношению к контактирующему с субстратом мономеру). В случае отрицательных защитных групп необходима дополнительная стадия реактивации. В некоторых случаях такая реактивация осуществляется путем нагревания.
Защитные группы для мостиковых молекул могут быть выбраны из большого числа положительно реагирующих на действие света групп. Предпочтительно сюда относятся нитроароматические соединения, такие как o-нитробензильные или бензилсульфонильные производные. По предпочтительному варианту осуществления в качестве защитных групп используются 6-нитровератрилоксикарбонил (NVOC), 2-нитробензилоксикарбонил (NBOC) или α,α -диметилдиметоксибензилоксикарбонил (DDZ). По одному из вариантов осуществления в качестве защитной группы используют нитроароматическое соединение, содержащее бензильный водород в ортоположении по отношению к нитрогруппе, а именно соединение формулы:
в которой
R1 означает алкоксигруппу, алкил, атом галогена, арил, алкенил или атом водорода, R2 - алкоксигруппу, алкил, атом галогена, арил, нитрогруппу или атом галогена, R3 - алкоксигруппу, алкил, атом галогена, нитрогрупп, арил или атом водорода, R4 - алкоксигруппу, алкил, атом водорода, арил, атом галогена или нитрогруппу, а R5-алкил, алкинил, цианогруппу, алкоксигруппу, атом водорода, атом галогена, арил или алкенил. Другими подходящими материалами являются o-окси- α -метилциннамоильные производные. Фотоотщепляемые защитные группы описаны, например, Patchornik в j.Am.Chem> Soc. (1970) 92: 6333 и Amit и др. в J. Org. Chem. (1974) 39:192. Обе эти работы включены в перечень ссылок к настоящей заявке.
По другому варианту осуществления изобретения положительные реакционноспособные группы активируют для взаимодействия с реагентами в растворе. Так, например, 5-бром-7-нитроиндолиновую группу, связанную с карбонилом, подвергают взаимодействию путем облучения светом длиной волны 420 нм.
По другому варианту осуществления реакционноспособную группу в мостиковой молекуле выбирают из большого числа отрицательно реагирующих на действие света групп, включая цинамматную группу.
По другому варианту осуществления реакционноспособную группу активируют или дезактивируют с помощью электронно-лучевой литографии, рентгеновской литографии или любого иного источника излучения. Подходящие для электронно-лучевой литографии реакционноспособные группы включают сульфонил. Другие подходящие для использования способы включают, например, воздействие тока. Для осуществления изобретения могут использоваться и другие реакционноспособные группы и способы активации.
Как видно из фиг. 1, мостиковые молекулы предпочтительно подвергаются воздействию света, например, через маску 8, создаваемую литографическими способами, типа используемых в полупроводниковой технологии и описанных, например, SZE в VLSI Technology, McGraw-Hill (1983) и Mead и др. в Jntroduction to VLSI Systems, Addison-Wesley (1980), включенных в перечень ссылок к настоящей заявке. Свет может быть направлен или на поверхность, содержащую защитные группы, или на заднюю сторону субстрата, если он прозрачен для длин волн света, необходимых для удаления защитных групп. В случае варианта осуществления, изображенного на фиг. 1, свет направляется на поверхность субстрата, содержащую защитные группы. Фиг. 1 иллюстрирует использование такой техники маскирования в отношении положительных реакционноспособных групп для активирования мостиковых молекул и экспонирования функциональных групп на участках 10a и 10b.
Маска 8 по одному из вариантов осуществления представляет собой основу из прозрачного материала, покрытую слоем непрозрачного материала. Часть непрозрачного материала удаляют, оставляя его в определенных местах поверхности субстрата. Маску располагают в непосредственной близости с изображением или непосредственно наносят на поверхность субстрата, как это показано на фиг. 1. Отверстия в маске соответствуют локализациям на субстрате, в которых с него необходимо удалить защитные группы. Совмещение может быть осуществлено с помощью обычных способов с использованием меток (не показаны) для точного нанесения маски на предварительно полученное изображение. Можно однако использовать для этого и более сложные, например, интерферометрические способы, в частности, описанные Flanders и др. в "A New Jnterferometric Alignment Technique", App. Phys. Zett (1977) 31:426-428, включенной в перечень ссылок к настоящей заявке.
Для увеличения контрастности света, которым облучается субстрат, желательно между маской и субстратом размещать повышающие контрастность материалы, как это делается по некоторым вариантам осуществления изобретения. Такой повышающий контрастность слой может включать молекулы, разлагающиеся под действием света, например хинондиазид или материал, нестационарно обесцвечивающийся под действием света нужной длины волны. Нестационарное обесцвечивание материалов способствует проникновению света в месте его прохождения, увеличивая тем самым контрастность. По другому варианту осуществления повышения контрастности можно добиться с помощью плакированного пучка оптоволокна.
Источником света может быть обычная лампа накаливания, лазер, лазерный диод и т.п. При использовании неколимированных источников света желательно применять толстую или многослойную маску для предотвращения рассеивания света на субстрате. В некоторых случаях целесообразно далее для контроля синтеза использовать группы, чувствительные к различным длинам волн. Так, например, при использовании групп, чувствительных к различным длинам волн, можно выбирать различные положения при синтезе полимеров или отказываться от отдельных стадий маскирования. Некоторое реакционноспособные группы и соответствующие длины волн, при которых происходит их отщепление, приведены в табл. 1.
Хотя изобретение и иллюстрируется, в первую очередь, примерами использования техники маскирования для облучения определенных участков субстрата, однако для этой цели можно использовать и другие способы. Так, например, для обучения субстрата можно использовать модулированный лазер или светодиод. Такие способы описаны, например, в патенте США 4719615 (Feyrer и др.), который включен в список цитируемых источников. По другому варианту осуществления для этой цели используется лазерное гальванометрическое сканирующее устройство. По другому варианту синтез может осуществляться в контакте с обычным жидким кристаллом (в дальнейшем называемым "световым модулятором") или оптоволоконными источниками света. С помощью соответствующим образом модулированных жидких кристаллов можно осуществлять селективный контроль света таким образом, чтобы обеспечить контактирование его с определенными участками субстрата. По другому варианту осуществления синтез может происходить на конце ряда оптических волокон, через которые пропускается свет определенной длины волны. Для специалиста в данной области очевидно, что для контроля локализации экспонирования светом можно использовать и другие средства.
Облучаемый субстрат может контактировать или не контактировать с раствором (не показан). Предпочтительно облучать субстрат, контактирующий с раствором. Для того, чтобы элиминировать мешающее действие образующихся при облучении побочных продуктов на синтез полимера, раствор в случае некоторых вариантов осуществления может содержать определенные реагенты. Такими побочными продуктами могут быть, например, диоксид углерода, нитрозокарбонильные соединения, производные стирола, производные индола и продукты их фотохимических реакций. По другому варианту раствор может содержать реагенты, используемые для обеспечения согласования с показателем преломления субстрата. Реагенты, добавляемые к раствору, могут включать далее кислые или основные буферы, тиолы, замещенные гидразины и гидроксиламины, могут взаимодействовать с определенным функциональными группами (например, арилнитрозо + глиоксиловая кислота _→ арилформгидроксамат + CO).
Одновременно или после облучения мостиковые молекулы промывают или иным образом осуществляют контактирование с первым мономером, как это изображено символом "A" на участках 12a и 12b на фиг. 2. Первый мономер взаимодействует с активированными функциональными группами мостиковых молекул, которые были подвергнуты действию света. Первый мономер, которым предпочтительно является аминокислота, также имеет фотозащитную группу. Эта фотозащитная группа в мономере может быть такой же, как и в мостиковых молекулах, или отличаться от нее. По своей природе это может быть любая из вышеперечисленных защитных групп. По одному из вариантов осуществления защитные группы для мономера A выбирают из групп NBOC и NVOC.
Как видно из фиг. 3, процесс облучения затем повторяется при новом положении маски, а именно при таком, при котором происходит удаление связанных защитных групп и экспонирование функциональных групп на участках 14a и 14b, которые, как это показано на фиг. 3, были защищены на предыдущей стадии маскирования. Вместо перемещения первой маски в новое положение можно, как это делается в ряде случаев, использовать вторую маску. По другому варианту осуществления некоторые стадии можно осуществлять для облучения общей области на последующих стадиях. Как показано на фиг. 3, может оказаться нецелесообразным осуществлять разделение облучаемых областей. Так, например, расстояние примерно в 1 - 5 мкм может оказаться достаточным для допустимого совмещения.
Как видно из фиг. 4, субстрат затем подвергают взаимодействию с вторым защищенным мономером "B", в результате чего образуются B-области 16a и 16b. После этого на субстрат снова наносят маску для удаления защитных групп и экспонирования реакционноспособных групп A на участке 12a и B на участке 16b. Субстрат снова подвергают взаимодействию с мономером B в результате чего образуется структура, показанная на фиг. 6. На субстрате при этом образуются димеры B-A и B-B.
Последующая серия нанесения масок и стадии контролирования с A, осуществляемые вышеописанным образом (не показаны), приводит к получению структуры, изображенной на фиг. 7. Описанный процесс позволяет получить все возможные димеры B и A, а именно: B-A, A-B, A-A и B-B.
Субстрат, участок синтеза и участки синтеза каждого из полимеров могут быть любого размера и иметь любую форму. Так, например, они могут иметь форму квадрата, эллипса, прямоугольника, треугольника, окружности или их частей, а также иметь неправильную форму. Для запаса на одном субстрате можно проводить по два синтеза какой-либо одной последовательности.
По одному из вариантов осуществления площадь участков 12 и 16 на субстрате находится в пределах примерно от 1 до 10-10 см2. В некоторых случаях площади участков 12 и 16 составляют примерно менее 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 10-7, 10-8 или 10-10 см2. По предпочтительному варианту осуществления участки 12 и 16 имеют размеры примерно 10х10 и 500х500 мкм.
В некоторых случаях на одном субстрате синтезируется примерно более 10, предпочтительно примерно более 100 различных полимерных последовательностей, хотя возможны варианты, когда на одном субстрате создается примерно более 103, 104, 105, 106, 107 или 108 различных последовательностей. Естественно, что в пределах области субстрата, в которой синтезируется полимерная последовательность, предпочтительно, чтобы такая последовательность была практически чистой. В соответствии с отдельными вариантами осуществления области субстрата содержат полимерные последовательности, имеющие степень чистоты по меньшей мере примерно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в одной области специально синтезируют несколько последовательностей для возможности осуществления начального скрининга на биологическую активность, после которого проводят дальнейшее изучение материалов в областях, в которых было обнаружено существенное связывание.
4. Подробное описание одного из вариантов осуществления реакторной системы.
На фиг. 8 приведено схематическое изображение предпочтительного варианта осуществления реакторной системы 100 для синтеза полимеров на подготовленном субстрате в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения. Реакторная система включает корпус 102 с полостью 104 на его поверхности. По предпочтительному варианту осуществления глубина полости равна примерно 50 - 1000, наиболее предпочтительно примерно 500 мкм.
На дне полости по предпочтительному варианту осуществления имеется ряд выступов 106, проходящих в направлении, перпендикулярном плоскости рисунка, и направлении, параллельном ей. Выступы предпочтительно имеют высоту 50 - 200 мкм и расположены на расстоянии примерно 2 - 3 мм друг от друга. Назначение этих выступов состоит в турбулизации потока для улучшения перемешивания. Для предупреждения отражения падающего света предпочтительно, чтобы поверхность дна полости отражала свет.
Субстрат 112 располагается над полостью 104. На нижней поверхности 114 субстрата имеются фотоотщепляющие защитные группы, например NVOC, с расположенными между ними и поверхностью мостиковыми молекулами или без них. Предпочтительно, чтобы субстрат был прозрачным для широкого спектра длин волн облучающего света. Однако в случае некоторых вариантов осуществления он прозрачен лишь для той длины волны света, при которой может быть удалена защитная группа (например, УФ для NBOC). В случае некоторых вариантов осуществления субстратом служит обычное стеклянное предметное стекло для микроскопа или покровное стекло. Предпочтительно, чтобы субстрат был как можно тоньше. Обеспечивая в то же время надежную физическую опору. Предпочтительно, чтобы толщина его была меньше примерно 1, предпочтительнее меньше 0,5, более предпочтительно меньше 0,1, наиболее предпочтительно меньше 0,05 мм. В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления субстрат выполняется из кварца или кремния.
Субстрат и корпус служат для герметизации полости за исключением ее входной 108 и выходной 110 частей. В случае некоторых вариантов осуществления корпус и субстрат могут соединяться через одну или несколько прокладок. По предпочтительному варианту осуществления в корпусе имеется две концентрические прокладки, а в промежуточном пространстве для обеспечения соединения субстрата с прокладками создается вакуум.
Жидкость подается в полость через входное отверстие с помощью насоса 116, например, модели B-120-S (Eldex Laboratories). Подаваемые этим насосом в полость определенные жидкости проходят через нее и выходят через выходное отверстие, после чего возвращаются для циркуляции или удаляются. В случае некоторых вариантов осуществления для улучшения перемешивания реактор подвергают воздействию ультразвуковой обработки и/или нагревают.
Над субстратом 112 смонтирована линза 120, например двухдюймовая сплавная линза, из диоксида кремния с фокусным расстоянием 100 мм. Для компактности в состав устройства может входить отражательное зеркало 122 для направления света от источника света 124 на субстрат. В качестве источника 124 может использоваться, например, Xe(Hg), модель N 66024, выпускаемая Oriel. В комбинации с линзой 120 может быть смонтирована вторая линза 126, предназначенная для проектирования изображения маски на субстрат. Такая разновидность литографии в дальнейшем будет называться проекционной литографией. Как будет видно из дальнейшего, в некоторых случаях возможно также использование фотолитографии с микрозазорами др. способов.
Излучаемый свет, благодаря наличию маски 128, попадает только на определенные участки субстрата. Маской 128 может служить, например, стеклянное предметное стекло с хромированным фотошаблоном на нем. По одному из вариантов осуществления на маске имеется сетка из прозрачных и непрозрачных участков. Такого типа маски изготавливает, например, фирма Photo Science, Inc. Свет свободно проходит через прозрачные участки маски, но отражается или поглощается в других областях. Поэтому действию света подвергаются только определенные участки субстрата.
Как уже отмечалось, помимо обычных масок для селективного экспонирования определенных участков субстрата можно использовать световые модуляторы (LCD'S) 7. По другому варианту для увеличения контрастности маски или в качестве собственно средства для ограничения области, подвергаемой воздействию света, можно использовать оптоволоконные планшайбы, например, выпускаемые фирмой Schott Glass, Inc. Такие план-шайбы размещают непосредственно над или на субстрате в реакторе, изображенном на фиг. 8. Помимо перечисленных устройств для увеличения контрастности можно использовать также фасеточные объективы, конусные оптоволоконные план-шайбы и т.п.
Для облучения участков, меньших по размеру, чем длина волны света, можно использовать более сложные устройства. Например, по одному из предпочтительных вариантов осуществления свет на субстрат направляют с помощью молекулярных микрокристаллов на кончик, например, микропипетки. Такие устройства описаны в работе Lieberman и др. "A Light Source smaller han the Optical wavelength: Science (1990) 247: 59-61, включенной в перечень ссылок к настоящей заявке.
В процессе работы субстрат помещают на полость и осуществляют герметизацию. Все операции, связанные с получением субстрата, выполняются при освещении помещения (главным образом или полностью) светом, длина волны которого находится вне интервала длин волн, при которых удаляются защитные группы. Так, например, в случае NVOC помещение необходимо освещать обычным светом камеры-обскуры, не содержащим или содержащим в небольшом количестве УФ-излучение. Все операции предпочтительно проводить при комнатной температуре.
Вначале осуществляют циркуляцию через полость жидкости для отщепления защитных групп (без мономера). В качестве такой жидкости предпочтительно используют 5 мМ раствор серной кислоты в диоксане, благодаря контактированию с которым аминные группы продолжают оставаться в протонированном состоянии и который снижает их реакционную способность, не давая им тем самым взаимодействовать с побочными продуктами фотолиза. Используемая для отщепления защитных групп жидкость может, кроме того, содержать материалы, обладающие абсорбционной способностью, например N,N-диметиламино-2,4-динитробензол-, служащие для поглощения света и для предотвращения его отражения и нежелательного фотолиза.
После этого предметное стекло помещают в пучок света после прохождения последнего через маску таким образом, чтобы облучению светом подвергались первые локализации и в результате происходило отщепление защитных групп. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления субстрат облучают в течение примерно 1-15 мин, наиболее предпочтительно в течение примерно 10 мин потоком света 10-20 мВт/см2 с длиной волны 365 нм. После фотолиза предметные стекла нейтрализуют (а именно, доводят pH примерно до 7) с помощью, например, раствора диизопропилэтиламина (DIEA) в метиленхлориде в течение примерно 5 мин.
Затем первый мономер размещают в первых локализациях субстрата. После облучения предметное стекло удаляют, обрабатывают в объеме и снова помещают в проточную ячейку. По другому варианту осуществляют циркуляцию жидкости, содержащей первый мономер (предпочтительно также защищенный защитной группой), через полость с помощью насоса 116. Если например, хотят ввести аминокислоту Y в первые локализации субстрата, то осуществляют циркуляцию этой кислоты ( α -азот которой защищен защитной группой) вместе с реагентами, используемыми для поддержания мономера в реакционноспособном состоянии и/или с носителем с помощью насоса из емкости 118 через полость.
Раствор носителя мономера по предпочтительному варианту осуществления получают путем смещения первого раствора (обозначаемого далее раствор "A") и второго раствора (обозначаемого далее раствор "B").
Ниже приведен состав смеси, которая может использоваться в качестве раствора "A".
Пример раствора носителя мономера "A":
100 мг аминокислоты, амино-группа которой защищена NVOC;
37 мг HOBT (1-оксибензотриазола);
250 мкл ДМФ (диметилформамида);
86 DIEA (диизопропилэтиламина).
Пример раствора носителя мономера "B":
111 мг BOP (бензотриазолил-н-окси-трис(диметиламино)-фосфоний- гексафторфосфата)
Растворы A и B смешивают и осуществляют их взаимодействие при комнатной температуре в течение примерно 8 мин, после чего разбавляют 2 мл ДМФ и 500 мкл смеси наносят на поверхность предметного стекла или осуществляют циркуляцию раствора через реакторную систему для взаимодействия в течение примерно 2 ч при комнатной температуре. Предметное стекло промывают затем ДМФ, метиленхлоридом и этанолом.
При циркуляции раствора, содержащего подлежащий соединению с субстратом мономер, через полость аминокислота или другой мономер реагирует своими концевыми карбоксильными группами с аминогруппами в тех областях субстрата, в которых были удалены защитные группы. В данном случае настоящее изобретение иллюстрируется примером циркуляции мономера через полость. Само собой разумеется однако, что такой же результат может быть достигнут и при удалении предметного стекла из реактора и погружении его в соответствующий раствор мономера.
После добавления первого мономера раствор, содержащий первую аминокислоту, удаляют из системы. После циркуляции ДМФ/метиленхлорида в количестве, достаточном для надежного удаления аминокислоты (например в количестве, равном примерно 50-кратному объему полости и соединительных трубопроводов), маску или субстрат устанавливают в новое положение (или используют новую маску) таким образом, чтобы экспонировались вторые области субстрата, и включают источник света 124 для второго облучения. В результате происходит отщепление защитных групп во вторых областях субстрата, процесс повторяют до тех пор, пока не будут синтезированы нужные полимерные последовательности.
После этого осуществляют контактирование всего дериватизированного субстрата с исследуемым рецептором, предпочтительно меченным, например, флуоресцентной меткой, путем циркуляции раствора или суспензии рецептора через полость или путем контактирования поверхности предметного стекла в объеме. Рецептор преимущественно связывается с теми областями субстрата, в которых содержатся комплементарные последовательности.
Антитела, как правило, суспендируют в жидкости, обычно называемой "суперсыворотка", которой может быть, например, раствор примерно 1% BSA (альбумин бычьей сыворотки), 0,5% Tween в PBS (буферированный фосфатным буфером раствор соли). Антитела разбавляют в буферной суперсыворотке до конечной концентрации, например, примерно 0,1-4 мкг/мл.
На фиг. 9 показан другой предпочтительный вариант осуществления реактора, изображенного на фиг. 8. В соответствии с этим вариантом осуществления маска 128 непосредственно контактирует с субстратом. Предпочтительно она помещается на субстрат травленной стороной для того, чтобы уменьшить эффект рассеивания света. При таком варианте осуществления в линзах 120 и 126 нет необходимости, поскольку маска находится в непосредственной близости от субстрата.
Для увеличения соотношения сигнал-шум в случае некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения осуществляют контактирование субстрата с первым меченым или немеченым рецептором, а затем контактирование его с меченым вторым рецептором (например, антителом), который связывается с многочисленными центрами первого рецептора. Если, например, первым рецептором является антитело, полученное из животного первого вида, то вторым рецептором является антитело, полученное из животного второго вида и являющееся эпитопом, ассоциирующимся с антителом первого вида. В случае мышиного антитела для связывания на его многочисленных центрах можно использовать, например, козье антитело или сыворотку с флуоресцентной меткой, являющиеся антимышиными. В результате флуоресценция возрастает в несколько раз по сравнению с тем случаем, когда с каждым центром связывания соединяется лишь одно мышиное антитело. Этот процесс может быть повторен еще раз с дополнительными антителами (например, козьими-мышиными - козьими и т.п.) для еще большего усиления сигнала.
По предпочтительным вариантам осуществления используется определенная последовательность масок. В некоторых случаях для синтеза всех возможных полимеров из определенного набора мономеров оказывается возможным использовать одну единственную маску.
Если, например, хотят синтезировать все 16 динулесьидов из четырех исходных блоков, площадь синтеза в 1 см2 условно разделяют на 16 камер шириной 0,25 см каждая. Обозначим четыре мономерных блока буквами A, B, C и D. Первые реакции проводят в четырех вертикальных колонках шириной 0,25 см каждая. С помощью первой маски экспонируется крайняя левая колонка камер, где происходит связывание A. С помощью второй маски экспонируется следующая колонка, где происходит связывание B. Ее сменяет третья маска для колонки C и, наконец, с помощью последней маски экспонируется крайняя правая колонка для D. Функцию первой, второй, третьей и четвертой масок может выполнять одна единственная маска, перемещаемая в разные локализации.
Описанный процесс повторяют в горизонтальном направлении для второго блока димера. На этот раз с помощью масок осуществляют экспонирование по рядам, также шириной 0,25 см A, B, C и D последовательно связывают с помощью масок, которыми экспонируются четвертые части реакционной площади. Получаемый в результате субстрат содержит все 16 динуклеотидов, синтезированных из четырех исходных блоков.
Восемь масок, используемых для синтеза вышеуказанных динуклеотидов, могут быть заменены одной маской со смещением или вращением последней. Действительно, одну маску можно использовать на всех восьми стадиях при соответствующих ее поворотах и смещении. Так, например, в случае вышеописанного процесса маску с одной прозрачной областью можно поочередно использовать для экспонирования каждой из четырех вертикальных колонок, затем сместить ее на 90o и провести последовательное экспонирование по горизонтальным рядам.
В табл. 2 представлена простая компьютерная программа на быстром бейсике для планирования программы маскирования и дан пример выходных данных соответственно для синтеза полимерного звена из трех мономеров (остатков) с тремя разными мономерами на первом, четырьмя разными мономерами на втором и пятью разными мономерами на третьем уровнях с полосчатым изображением. Выходными данными программы являются количество ячеек, количество полос (светлых областей) в каждой маске и количество смещений, необходимых для каждого экспонирования маски.
Выходные данные для программы маскирования
Количество остатков - 3
Остаток 1 - 3 исходных блока.
Остаток 2 - 4 исходных блока.
Остаток 3 - 5 исходных блоков.
Количество ячеек 60.
Маска для остатка 1.
Количество полос 1.
Ширина каждой полосы 20.
Полоса 1 начинается в локализации 1 и заканчивается в локализации 20.
Для каждого из 3 исходных блоков смещать маску на 20 ячеек.
Маска для остатка 2.
Количество полос 3.
Ширина каждой полосы 5.
Полоса 1 начинается в локализации 1 и заканчивается в локализации 5.
Полоса 2 начинается в локализации 21 и заканчивается в локализации 25.
Полоса 3 начинается в локализации 41 и заканчивается в локализации 45.
Для каждого из 4 исходных блоков смешать маску на 5 ячеек.
Маска для остатка 3.
Количество полос 12.
Ширина каждой полосы 1.
Полоса 1 начинается в локализации 1 и заканчивается в локализации 1.
Полоса 2 начинается в локализации 6 и заканчивается в локализации 6.
Полоса 3 начинается в локализации 11 и заканчивается в локализации 11.
Полоса 4 начинается в локализации 16 и заканчивается в локализации 16.
Полоса 5 начинается в локализации 21 и заканчивается в локализации 21.
Полоса 6 начинается в локализации 26 и заканчивается в локализации 26.
Полоса 7 начинается в локализации 31 и заканчивается в локализации 31.
Полоса 8 начинается в локализации 36 и заканчивается в локализации 36.
Полоса 9 начинается в локализации 41 и заканчивается в локализации 41.
Полоса 10 начинается в локализации 46 и заканчивается в локализации 46.
Полоса 11 начинается в локализации 51 и заканчивается в локализации 51.
Полоса 12 начинается в локализации 56 и заканчивается в локализации 56.
Для каждого из 5 исходных блоков смещать маску на 1 ячейку Copyright 1990, Affymax
5. Подробное описание одного из вариантов осуществления флуоресцентного детекторного устройства.
На фиг. 10 показано детекторное устройство для детектирования рецепторов с флуоресцентной меткой на субстрате. Субстрат 112 помещают на трансляционный координантный стол 202. По предпочтительному варианту осуществления в качестве такого стола используют модель N PM500-A1, выпускаемую фирмой Newport Corporation. Этот координантный стол управляется по соответствующей программе, соединенной с ним и соответствующим образом запрограммированной ЭВМ, в качестве которой может использоваться, например, IBM PC/AT или AT-совместимый компьютер. Естественно, что вместо AT-компьютера, приведенного в настоящей заявке в качестве примера, можно использовать и другие компьютерные системы, аппаратные средства специального назначения и т.п. Нижеописанное программное обеспечение для трансляции и первичной обработки информации может быть создано на основе существующего программного обеспечения, включая, например, "Zab Windows", выпускаемое по лицензии National Jnstruments и включенное в перечень ссылок к настоящей заявке.
Субстрат и координатный стол помещают под микроскоп 206 с одним или несколькими объективами 208. Свет (с длиной волны примерно 488 нм) от лазера 210, в качестве которого в случае некоторых вариантов осуществления используется аргонный ионный лазер модели N 2020-06, выпускаемой фирмой Spectraphysics, направляется на субстрат с помощью дихроичного зеркала 207, пропускающего свет длин волн более 520 нм, но отражающее свет с длиной волны 488 нм. Дихроичным зеркалом 207 может быть, например, модель N FT510, выпускаемая фирмой Carl Zeiss. Свет, отраженный зеркалом, попадает в микроскоп 206, в качестве которого можно, например, использовать модель Axioscop 20, выпускаемую фирмой Carl Zeiss. Меченные флуоресцеином материалы на субстрате генерируют флуоресцирующее излучение с длиной волны более 488 нм, которое собирается микроскопом и проходит через зеркало. Флуоресцентное излучение субстрата проходит затем через волновой фильтр 209 и диафрагму 211. В качестве волнового фильтра 209 можно, например, использовать модель N OG530, выпускаемую фирмой Melles Griot, а в качестве диафрагмы 211, например, модель N 477352/477380, выпускаемую фирмой Carl Zeiss.
Флоуресцентное излучение попадает затем в фотоумножитель 212, в качестве которого в случае некоторых примеров осуществления используется модель N R943-02, выпускаемая фирмой Hamamatsu. Сигнал усиливается предусилителем 214, и число фотонов подсчитывается счетчиком фотонов 216. Подсчитанное количество фотонов фиксируется в компьютере 204 как функция локализации. В качестве предусилителя 214 можно использовать, например, модель N SR 440, выпускаемую фирмой Stanford Research Systems, а в качестве счетчика фотонов 216 - модель N SR 400, выпускаемую этой же фирмой. Субстрат затем перемещают в следующее положение и весь процесс повторяют. В соотношении с предпочтительными вариантами осуществления таким образом получают данные для каждых I-100 мкм субстрата при диаметре исследуемого участка примерно 0,8-10 мкм. В случае некоторых вариантов осуществления при достаточно интенсивной флуоресценции используются ПОС-детектор с широкой полосой облучения.
Зная количество фотонов, генерируемых в данной области субстрата под действием лазерного излучения, можно определить местонахождение на субстрате молекул с флуоресцентной меткой. Следовательно, в случае предметного стекла, использовавшегося в качестве матрицы полипептидов, например, синтезированных на его поверхности, можно определить, какие именно полипептиды комплементарны рецептору с флоуресцентной меткой.
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения интенсивность и продолжительность облучения субстрата светом контролируется путем изменения мощности лазера и скорости сканирования, улучшение соотношения сигнал-шум - путем максимального увеличения флуоресцентного излучения и сведения к минимуму фоновых шумов.
Хотя детекторное устройство и описано в первую очередь на примере детектирования меченых рецепторов, изобретение может найти применение и в других областях. Так, например, описанное детекторное устройство может использоваться при изучении катализа для скрининга ДНК или белковых гелей и т.п.
6. Определение относительной прочности связывания рецепторов.
Соотношение сигнал-шум в случае настоящего изобретения является достаточно высоким, чтобы можно было не только установить наличие или отсутствие рецептора на лиганде, но и определить относительную прочность связывания рецепторов с различными последовательностями.
На практике было установлено, что рецептор может образовывать связи с различными пептидными последовательностями, однако прочность связывания его соседними последовательностями будет больше, чем с другими. В рамках настоящего изобретения прочность связывания характеризуется величиной флуоресцентного или радиографического сигнала, поскольку в области образования прочной связи с лигандом будет связываться большое количество молекул рецептора. И наоборот, слабое сродство будет характеризоваться слабым флуоресцентным или радиографическим сигналом, вследствие того, что в определенной области субстрат, в которой находится лиганд, обладающий слабым сродством к конкретному рецептору, с ним будет связываться небольшое количество молекул этого рецептора. Таким образом, становится возможным определять относительную прочность связывания (или сродство в случае одновалентных взаимодействий) интересующего лиганда по интенсивности флуоресцентного или радиографического сигнала в области субстрата, содержащей этот лиганд.
Варьируя условия промывки и концентрации рецептора, можно также получить полуколичественные данные по степени сродства. Это можно сделать путем, например, сравнения известных пар лиганд-рецептор.
8. Примеры
Эффективность описанного изобретения иллюстрируется нижеприведенными примерами. Все операции, если это не оговорено, проводились примерно при комнатной температуре и нормальном давлении.
А. Получение предметных стекол
Перед введением реакционноспособных групп субстрат, в качестве которого по предпочтительному варианту осуществления используют стеклянный материал, в частности предметные или покровные стекла для микроскопа, целесообразно очистить. В соответствии с одним из вариантов осуществления предметного стекла для этого погружают на 12 ч в щелочную ванну, состоящую, например, из 1 л 95 %-ного этанола, 120 мл воды и 120 г гидроксида натрия. После этого стекла промывают проточной водой, высушивают на воздухе и промывают 95%-ным этанолом.
Для введения аминных групп, которые связываются со стеклянной поверхностью через мостиковые молекулы, промытые предметные стекла аминируют путем взаимодействия их, например, с аминопропилтриэтоксисиланом, хотя для этой цели можно использовать также любой силан с функциональной группой в омега-положении. По одному из вариантов осуществления используют 0,1 %-ный раствор аминопропилтриэтоксисилана, хотя можно использовать и растворы с концентрацией 10-7-10%. Предпочтительно, чтобы концентрация находилась в пределах примерно 10-3-2 %. 0,1 %-ную смесь получают путем добавления к 100 мл смеси 95 % этанола и 5 % воды, 100 мкл аминопропилтриэтоксисилана. Смесь перемешивают на вращающемся встряхивающем аппарате при температуре, близкой к температуре окружающей среды, в течение примерно 5 мин. 500 мкл этой смеси наносят затем с одной стороны на поверхность очищенных предметных стекол. Через 5 мин стекла отделяют от раствора декантацией и трижды промывают, например, 100%-ным этанолом путем окунания.
После того, как стекла высохнут, их помещают в вакуумную печь и выдерживают при 110-120oC в течение примерно 20 мин, а затем проводят выдержку при комнатной температуре в течение примерно 12 ч в атмосфере аргона. После этого их окунают в раствор ДМФ (диметилформамида) и тщательно промывают метиленхлоридом.
Аминированную поверхность предметных стекол подвергают затем воздействию примерно 500 мкл, например, 30 миллимолярного (мМ) раствора NVOC-CABA (гамма-аминомасляной кислоты) NHS (N-оксисукцинимида) в ДМФ, в результате чего NVOC-GABA соединяется с аминогруппами.
После этого поверхность промывают, например, ДМФ-метиленхлоридом и этанолом.
Находящийся на поверхности непрореагировавший аминопропилсилан, т.е. аминогруппы, не связанные с NVOC-GABA, копируют ацетильными группами (для предотвращения дальнейшего реагирования) путем контактирования со смесью уксусного ангидрида и пиридина (1:3) в течение 1 ч. Для такого кэпирования можно использовать и другие материалы, включая ангидрид трифторуксусной кислоты, смешанный ангидрид муравьиной и уксусной кислот или другие реакционноспособные ацилирующие агенты. И, наконец, обработанные вышеописанным образом предметные стекла снова промывают ДМФ, метиленхлоридом и этанолом.
В. Синтез восьми тримеров "A" и "B"
На фиг. 11 приведен вариант синтеза восьми тримеров из двух наборов мономеров: gly, phe (обозначенных соответственно "A" и "B"). Готовят в качестве субстрата стеклянное предметное стекло с аминовыми группами, заканчивающимися 6-нитровератрилоксикарбоксамидными (NVOC-NH) остатками. В качестве реагентов используют активные эфиры (пентафторфениловые, OBt b n/l/) gly и phe, аминогруппы которых защищены NVOC. Следует отметить (хотя к данному примеру это и не относится), что в том случае, если в наборе мономеров необходимо защищать боковую цепь, то используемые для этой цели защитные группы не должны быть фотореакционноспособными при длине волны света, используемой для защиты главной цепи.
В случае набора из n мономеров, чтобы синтезировать все возможные последовательности длины l, необходимо n•l циклов.
Каждый цикл состоит из:
- облучения через соответствующую маску для экспонирования аминогрупп в тех местах, в которых должен быть введен следующий остаток, и соответствующей промывки для удаления образующихся при отщеплении защитных групп побочных продуктов и
- добавления активированного и защищенного (удаляемой фотохимически защитной группой той же природы) мономера, который будет взаимодействовать с центрами, предусмотренными для стадии I, и соответствующей промывки для удаления с поверхности избытка реагента.
По одному из вариантов осуществления указанный цикл повторяют для каждого члена набора мономеров до тех пор, пока каждая локализация не будет занята одним остатком. По другим вариантам осуществления несколько остатков последовательно вводят в одну локализацию, после чего переходят к следующей локализации. Продолжительность циклов, как правило, лимитируется скоростью реакции связывания и в настоящее время в автоматизированных синтезаторах пептидов составляет 20 мин. После этой стадии для стабилизации полученного множества для последующего тестирования может быть введена защитная группа. В случае некоторых типов полимеров (например, пептидов) может оказаться необходимым удаление защитных групп со всей поверхности (удаление фотозащитных групп боковых цепей).
В случае конкретного варианта осуществления предметное стекло 20, как это показано на фиг. 11A, разделено на области 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 и 36. Области 30, 32, 34 и 36 закрывают маской, как это показано на фиг. 11B, и стекло облучают светом, после чего осуществляют контактирование его с реагентом, содержащим "A" (например, gly). В результате образуется структура, показанная на фиг. 11C. После этого маской закрывают области 22, 24, 26 и 28, стекло облучают (см. фиг. 11D) и осуществляют контактирование его с реагентом, содержащим "B" (например phe). В результате образуется структура, показанная на фиг. 11E. Процесс продолжают, последовательно осуществляя маскирование и экспонирование соответствующих участков до тех пор, пока не получают структуру, показанную на фиг. 11M. После этого стекло облучают и концевые группы при желании кэпируют путем ацетилирования. Как видно из рисунка, в результате получают все возможные тримеры gly и phe.
В данном случае в удалении защитных групп боковых цепей нет необходимости. В тех же случаях, когда это нужно, удаление защитных групп боковых цепей может быть осуществлено путем обработки этандитиолом и трифторуксусной кислотой.
Как правило, количество стадий, необходимых для получения конкретной полимерной цепи, определяется выражением:
n•l,
в котором n означает количество мономеров в исходном наборе мономеров, а l - количество мономерных звеньев в полимерной цепи.
И, наоборот, количество синтезированных последовательностей длиной l будет равно:
nl
Естественно, большее количество последовательностей может быть получено, если маскирование проводить по программе, включающей синтез полимеров с длиной менее l. Если взять крайний случай, когда хотят получить все полимеры длиной менее или равной l, то количество синтезированных полимеров будет равняться:
nl + nl-1 +...+ n1 (3)
Максимальное число необходимых литографических стадий обычно равно n для каждого слоя мономеров, т.е. общее количество масок (а, следовательно, и число литографических стадий) будет равно n•l. Размер прозрачных областей маски будет меняться в зависимости от площади субстрата, на которой протекает синтез, и количества синтезируемых последовательностей. В общем случае площадь синтеза может быть определена по формуле:
Площадь синтеза = (A) / (S),
где
A-площадь (вся), а S - количество последовательностей, которые хотят синтезировать на этой площади.
Для специалиста в данной области из вышесказанного ясно, что с помощью вышеуказанного способа, используя описанную технику литографии, можно без труда получать на субстрате тысячи или миллионы олигомеров. Благодаря этому предлагаемый способ представляет возможность практически испытывать большие количества ди-, три-, тетра-, пента-, гекса-, гепта-, окта-, додекапептиды или более длинные полипептиды (соответственно полинуклеотиды).
Вышеприведенный пример иллюстрирует способ в его "ручном" варианте, однако, он может осуществляться автоматически или полуавтоматически. Для этого субстрат необходимо помесить в проточную ячейку для возможности автоматического добавления или удаления реагентов, сведения к минимуму их расхода и более строгого контроля условий протекания реакций. Смена масок может осуществляться вручную или автоматически.
С. Синтез димера аминопропильной и флуоресцентной групп.
Для синтеза димера аминопропильной и флуоресцентной групп в качестве субстрата использовали durapore мембрану с функциональными группами. Durapore мембрана была выполнена из поливинилидин-дифторида с аминопропильными группами. Последние были защищены DDZ - группами путем взаимодействия карбонилхлорида с аминогруппами. Эта реакция хорошо известна специалистам в данной области. Субстрат с этими группами на его поверхности помещали в раствор тетрагидрофурана и осуществляли контактирование его с чередующимися в шахматном порядке прозрачными и непрозрачными областями с длиной стороны 1 мм. Маску облучали ультрафиолетовым светом с нижним пределом длины волны как минимум примерно 280 нм. Облучение проводили в течение примерно 5 мин при температуре окружающей среды, хотя для различных вариантов осуществления изобретения возможен широкий интервал времени облучения и температуры. Так, например, по одному из вариантов осуществления продолжительность облучения может находиться в пределах примерно 1-5000 c, а температура (-70)-(+50)oC.
По одному из предпочтительных вариантов осуществления облучение проводят в течение примерно 1-500 c при примерно атмосферном давлении. По другим предпочтительным вариантам осуществления для предотвращения испарения процесс проводят при повышенном давлении.
Поверхность мембраны затем промывают в течение примерно часа флуоресцентной меткой, включающей реакционноспособный эфир, связанный с хелатом лиганда. Продолжительность промывки может варьироваться в широких пределах, от примерно нескольких минут до нескольких часов. Указанные материалы флуоресцируют в красной и зеленой видимой областях. После окончания реакции реакционноспособного эфира в флуорофоре места, в которых происходит связывание флуорофора, могут быть сделаны видимыми, если облучить их ультрафиолетовым светом, и обнаружены по испускаемому или красному и зеленому свечению. Было установлено, что дериватизированные области субстрата строго соответствуют рисунку маски.
D. Демонстрация чувствительности детектирования сигнала.
Чувствительность детектирования сигнала была продемонстрирована с помощью стандартного набора флуоресцентного бисера с низким уровнем модели N 824, выпускаемой фирмой Flow Cytometry standard. Набор состоит из бисеринок диаметром 5,8 мкм с нанесенным на них путем пропитки известным количеством молекул флуоресцеина.
Бисеринку из такого набора помещали на координатный стол, как это показано на фиг. 10, в освещаемое поле в районе лазерного пятна, которое вначале экранировали. После этого включали устройство для детектирования фотонов, деблокировали лазерный пучок, который взаимодействовал с бисеринкой, в результате чего последняя начинала флуоресцировать. Кривые флоуресцентного излучения бисеринок, содержащих 7 и 29000 молекул флуоресцеина, приведены на фиг. 12 и 13 соответственно. На обоих рисунках приведены также кривые для бисеринок без молекул флуоресцеина. Эксперименты проводились при длине волны возбуждающего света 488 нм и выходной мощности лазера 100 мкВт. Свет фокусировали с помощью 40-кратного 0,7 NA-объектива.
Во всех случаях интенсивность флуоресценции вначале была высокой и затем уменьшалась по экспоненциальному закону. Такое снижение интенсивности объясняется фотообесцвечиванием молекул флуоресцеина. Кривые излучения бисеринок без молекул флуоресцеина использовались для вычитания фона. Интегрирование кривой, представляющей собой разность начальных участков экспоненциальных кривых спада меченных и немеченных бисеринок, давало общее количество зафиксированных фотонов, которое относили к числу молекул флуоресцеина в бисеринках. Зная эту величину, можно было определить количество фотонов, испускаемых одной молекулой флуоресцеина, которое можно было зафиксировать. В случае кривых, изображенных на фиг. 1, приведенные описанным образом расчеты свидетельствуют о том, что предлагаемое устройство позволяет фиксировать излучение интенсивностью примерно 40-50 фотонов на молекулу флуоресцеина.
E. Определение числа молекул на единицу поверхности
Полученные вышеописанными способами аминопропилированные стеклянные предметные стекла для микроскопа использовали для определения плотности их меченности. Свободные концевые аминогруппы стекол подвергали взаимодействию с FITC (флуоресцеинизоцианат), образующим с ними ковалентные связи. После этого проводили сканирование предметных стекол для определения количества испускаемых в исследуемой области фотонов. Найденное количество фотонов (40-50), приходящееся на одну флуоресцентную молекулу, позволяет рассчитать количество молекул, приходящееся на единицу поверхности.
Предметное стекло с аминопропилсиланом на поверхности погружали в 1 мМ раствор FITC в ДМФ на 1 ч при температуре, близкой к температуре окружающей среды. После окончания реакции стекло дважды промывали ДМФ, затем этанолом, водой и снова этанолом, После этого его высушивали и хранили в темноте до начала измерений.
Путем интегрирования участка экспоненциального спада кривых флуоресцентного сигнала, аналогичных кривым, изображенным на фиг. 12, определяли количество свободных аминогрупп на дериватизированной поверхности предметного стекла. Было установлено, что описанным способом можно, варьируя концентрацию аминопропилтриэтоксисилана в пределах 10-5 - 1001%, воспроизводимо получать предметные стекла с плотностью меченности 1 молекула флуоресцеина на 103•103 ≈ 2•2 нм.
F. Удаление NVOC и введение флуоресцентной метки.
NVOC-GABA-группы вводили вышеописанным образом. Всю поверхность стекла подвергали затем воздействию света для получения свободных концевых аминогрупп в гамма-аминомаслянной кислоте. Обработанные таким образом, а также необлученные предметные стекла подвергали взаимодействию с флуоресцеинизоцианатом (FITC).
На фиг. 14A показано необлученное, но находившееся в контакте с FITC предметное стекло. По оси X отложено время, а по оси y - количество зарегистрированных фотонов.
Такое же предметное стекло освещали светом длиной волны 350 нм в течение примерно 1 мин (12 мВт/см2≈350 нм), промывали и подвергали воздействию FITC. Кривая флуоресценции для его стекла показана на фиг. 14B. В этом случае наблюдали большое возрастание интенсивности флуоресценции, свидетельствующее о том, что в результате фотолиза на поверхности предметного стекла образовывалось количество аминогрупп, которые связывались с флуоресцентной меткой.
G. Использование маски для удаления NVOC.
Для нижеописанного эксперимента использовали аминопропилированное предметное стекло с концентрацией аминопропильных групп 0,1 %. Свет от Hg - Xe дуговой лампы проектировали на субстрат через полученную хромированием на стекле маску, непосредственно контактировавшую с субстратом.
Облучение проводили в течение примерно 5 мин светом длины волны 350 нм, потоком 12 мВт, после чего осуществляли контактирование субстрата с 1 мМ раствором FITC. Обработанное таким образом предметное стекло помещали на координатный стол лазерного детектора и строили график зависимости флуоресцентного излучения в виде двухмерного расположения цветных меток. Эксперимент повторяли несколько раз, используя разные маски. Флуоресцентные картины для масок 100•100, 50, 20 и 10 мкм свидетельствуют о том, что при использовании такой техники литографии рисунок маски остается различимым при размерах ячеек как минимум примерно 10 мкм2.
H. Введение YGGFL и последующее контактирование с антителом Герца и козьим антимышиным антителом.
Для выяснения возможности связывания и детектирования рецепторов конкретной полипептидной последовательности с иммобилизированным на поверхности пептидом связывали Leu энкефалин с поверхностью и осуществляли распознавание антителом. Предметное стекло дериватизировали 0,1 % аминопропилтриэтоксисиланом и защищали NVOC. Для экспонирования предметного стекла в проточной ячейке использовали маску с шахматным рисунком с размером клеток 500 мкм, нанесенную на обратную сторону стекла методом контактной фотолитографии. Leu энкефалиновую последовательность (H2N - тирозин, глицин, фенилаланин, лейцин- CO H, обозначается далее как YGGFL) соединяли через ее концевую карбоксигруппу с экспонированными аминогруппами на поверхности предметного стекла. После этого в проточную ячейку вводили пептид в виде раствора в ДМФ с сочетающими реагентами BOP/HOBT/DIEA, осуществляли циркуляцию раствора в течение 2 ч при комнатной температуре.
После этого осуществляли контактирование поверхности предметного стекла с первым антителом, известным под названием антитело Герца, при концентрации его в суперсыворотке (содержавшей 1 % B S A и 1 % яичного альбумина) 2 мкг/мл в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем добавляли второе антитело - конъюгат козьего антимышиного антитела с флуоресцеином в суперсывороточном буфере при концентрации его 2 мкг/мл и осуществляли выдержку в течение 2 ч.
Результаты этого эксперимента выражали в виде зависимости интенсивности флуоресценции от положения. Картину получали с шагом 10 мкм. Полученные результаты свидетельствуют о том, что описанный способ позволяет не только проводить отщепление защитных групп в четко определенных областях субстрата, но и (I) успешно осуществлять связывание пептидов с поверхностью субстрата, (2) получать иммобилизированные на поверхности субстрата пептиды, которые могут связываться с антителом, и (3) что чувствительность детектирующего устройства достаточна для детектирования связанного рецептора.
i. Получение "мономер к мономеру" YGGFL и последующее контактирование его с меченным антителом.
На предметном стекле осуществляли синтез YGGFL и GGFL способом "мономер к мономеру" в шахматном порядке и полученнное в результате предметное стекло подвергали взаимодействию с антителом Герца. Результаты эксперимента представлены на фиг. 15 и 16.
На фиг. 15 показано дериватизированное аминопропильными группами, защищенными в данном случае t=BOC (тертбутоксикарбонилом), предметное стекло. Для удаления t-BOC защитных групп предметное стекло обрабатывали TFA, после чего аминопропильные группы связывали с e-аминокапроновой кислотой, аминогруппа которой была защищена t-BOC. Аминокапроновая кислота в данном случае играла роль спейсера между аминопропильной группой и синтезируемым пептидом. Защитную группу концевой аминогруппы спейсера отщепляли и осуществляли взаимодействие последнего с защищенным NVOC лейцином. Все предметное стекло облучали затем светом длиной волны 325 нм при мощности потока 12 мВт, осуществляли взаимодействие его с защищенным NVOC фенилаланином и промывали. Затем все предметное стекло снова облучали, осуществляли взаимодействие его с защищенным NVOC глицином и промывали. Стекло затем снова облучали и осуществляли взаимодействие с защищенным NVOC глицином, получая в результате последовательность, изображенную в самой нижней части фиг. 15.
Как видно из фиг. 16, чередующиеся области обработанного таким образом предметного стекла облучали через полученную с помощью проекционной литографии маску с шахматным рисунком с размером клеток 500•500 мкм. Аминогруппы глицина экспонировались только на освещенных участках. Для осуществления следующей химической стадии добавляли защищенный NVOC тирозин, который связывали только на тех участках, которые были подвергнуты облучению. Затем облучали все предметное стекло для удаления всех групп NVOC. В результате получали шахматный рисунок с YGGFL на светлых и GGFL на остальных участках. После этого осуществляли контактирование предметного стекла с антителом Герца (распознающим YGGFL, но не распознающим GGFL), а затем - с конъюгатом козьевого антимышиного антитела и флуоресцеина.
На полученной при сканировании флуоресцентной картине видны темные участки, содержащие тетрапептид GGFL, не распознаваемый антителом Герца (поэтому не связывающийся с конъюгатом козьего антимышиного антитела и флуоресцеина), и участки красного цвета, на которых присутствует YGGFL. Пентапептид YGGFL распознается антителом Герца, и таким образом в освещенных областях оказывается антитело для распознавания связанного с флуоресцеином козьего антимышиного антитела.
При использовании масок с аналогичным рисунком (с размером клеток 50 мкм), непосредственно контактирующих с субстратом (установка фотолитографии с микрозазором), получали более четкую картину, причем края шахматного рисунка касались, что является следствием непосредственного контактирования маски с субстратом (результатом чего является увеличение при таком способе разрешения).
y. Синтез YGGFL и PGGFL способом "мономер к мономеру."
Синтез осуществляли с помощью маски с шахматным рисунком с размером клеток 50 мкм, аналогичной изображенной на фиг. 15. Различие состояло в том, что на дополнительной стадии в центры субстрата с GGFL вводили P. Введение P осуществляли путем облучения защищенных GGFL светом через маску и последующего контактирования субстрата с P вышеописанным образом. В результате половина поверхности субстрата содержала YGGFL, а вторая половина - PGGFL.
Излучение флуоресцентной картины показало, что и в этом случае легко можно различить области, в которых произошло связывание.
K. Синтез YGGFL и YPGGFL способом "мономер к мономеру."
Для дополнительной иллюстрации возможностей настоящего изобретения осуществляли синтез YGGFL и YPGGFL с шахматным рисунком на субстрате аналогичным вышеописанному образом. Полученная флуоресцентная картина свидетельствовала о том, что антитело однозначно распознавало последовательность YGGFL и не связывалось в областях, в которых присутствовал YPGGFL.
L. Синтез шестнадцати различных аминокислотных последовательностей и определение относительной прочности их связывания с антителом Герца.
С помощью вышеописанного способа на каждом из двух стеклянных предметных стекол синтезировали по 16 различных аминокислотных последовательностей (опыт повторяли 4 раза). Последовательности синтезировали путем введения последовательности NVOC-GFL на всей поверхности предметного стекла. Затем с помощью нескольких масок на субстрат селективно наносили два слоя аминокислот. Каждая область имела размер 0,25 • 0,0625 см. Первое предметное стекло содержало аминокислотные последовательности, состоявшие только из L-, а второе только из D-аминокислот. На фиг. 17A и B показаны картины различных областей соответственно первого и второго предметных стекол. Картины, показанные на фиг. 17A и B, воспроизводились по четыре раза для каждого предметного стекла. После этого осуществляли контактирование предметных стекол с антителом Герца и меченым флуоресцеином козьим антимышиным антителом.
На флуоресцентной картине первого стекла, содержавшего только L-аминокислоты, присутствовали красные (свидетельствовавшие о прочном связывании, а именно на них регистрировалось 149000 или более фотонов) и темные (свидетельствовавшие об отсутствие или незначительном связывании антител Герца, регистрация 20000 или менее фотонов) участки. Последовательность YAGFL и YSGFL также хорошо распознаются этим антителом. В отличие от этого большинство остальных последовательностей или совсем не связываются с этим антителом или связываются в незначительной степени. Четыре повторных опыта показали хорошую сходимость в отношении количества связанных антител.
Флуоресцентная картина предметного стекла с D-аминокислотами показала, что наиболее прочно связывается YGGFL- последовательность. Существенное связывание было обнаружено также в случае YaGFL, YsGFL и YpGFL. Остальные последовательности связываются с указанным антителом менее прочно, а последовательность yGGFL связывается слабо.
В табл. 3 приведены различные испытания последовательности, расположенные в порядке убывания интенсивности флуоресцентного излучения, что дает информацию об относительной прочности связывания.
8. Другой вариант осуществления.
Другим аспектом настоящего изобретения являются способы связывания с поверхностью каркасного связующего элемента, каркасная форма которого обладает относительно низким сродством к другим веществам, таким как рецепторы и специфически связывающиеся соединения. Более подробно такие способы описаны в одновременно рассматриваемой заявке N 404920, поданной 8 сентября 1989 года и включенной в перечень ссылок к настоящей заявке.
В соответствии с этим другим аспектом предметом настоящего изобретения являются способы формирования на поверхности твердой подложки определенных областей, в которых возможна иммобилизация рецепторов. Суть этих способов заключается в использовании каркасных связующих элементов, что позволяет осуществлять селективную активацию определенных областей поверхности подложки. Для того, чтобы каркасные связующие элементы могли выполнять свою функцию, их выделяют в свободном виде, благодаря чему они оказываются способными связывать рецепторы после активирования определенных областей поверхности подложки. Активированные таким образом связующие элементы используют затем для иммобилизации в определенных областях поверхности подложки конкретных молекул, например, рецепторов. Вышеописанную процедуру повторяют на тех же или других участках поверхности, в результате чего получают подложку с поверхностью, разбитой на множество участков, содержащих, например, одинаковые или различные рецепторы. Если иммобилизированные таким образом рецепторы обладают различным сродством к одному или нескольким лигандам, то это дает возможность проводить скрининг и анализ лигандов в тех областях поверхности, которые содержат такие рецепторы.
Вышеуказанный альтернативный вариант осуществления изобретения позоволяет использовать новые каркасные связывающие элементы, соединенные с субстратом. Каркасные (неактивированные) элементы обладают относительно низким сродством к рецепторам веществ, специфически связывающихся с некаркасными связующими элементами, по сравнению с активированными связующими элементами. Вследствие этого такие связующие элементы не вступают в реакцию до тех пор, пока соответствующие области поверхности не будут активированы с помощью подходящего источника энергии. После такой активации каркасные группы становятся лабильными, в результате чего образуются активированные связующие элементы. Типичным источником энергии для такой активации является свет.
После активации находящихся на поверхности связующих элементов они могут соединяться с рецептором. Таким рецептором может быть моноклональное антитело, последовательность нуклеиновых кислот, рецептор лекарственного вещества и т. п. Как правило (хотя и не всегда), рецептор должен быть получен в такой форме, чтобы он мог быть связан (прямо или косвенно) со связующим элементом. Так, например, роль мостика между связующими элементами и рецепторами при желании могут играть специфически связывающиеся соединения, обладающие большим сродством к связующему элементу и к рецептору, или конъюгаты рецептора. По предлагаемому способу используются рецепторы, полученные в таком виде, что они сохраняют свою активность по отношению к конкретному лиганду.
Предпочтительно в качестве каркасного связующего элемента, связанного с поверхностью твердого субстрата, используют фотоактивирующийся биотиновый комплекс, а именно биотин, молекула которого химически модифицирована фотоактивирующимися защитными группами таким образом, что в результате она обладает значительно более низким сродством к авидину или его аналогам по сравнению с природным биотином. По предпочтительному варианту осуществления эти защитные группы, локализованные в определенной области поверхности, удаляют путем облучения этой области подходящим источником излучения, в результате чего образуются связующие элементы, а именно биотин или соединение с аналогичной функциональностью, обладающие таким же сродством к авидину или его аналогам, как и биотин.
По другому предпочтительному варианту осуществления авидин или его аналог выдерживают в контакте с активированными связующими элементами на поверхности до образования их прочной связи с авидином. Иммобилизированный таким образом на определенных участках поверхности авидин может затем выдерживаться с интересуемым рецептором или его конъюгатом. Предпочтительно, если авидин иммобилизирован на определенных участках поверхности субстрата, чтобы рецептор был биотинилирован. Им может быть, например, биотинилированное антитело. Другим предпочтительным вариантом осуществления является авидин/биотинилированный комплекс рецептора, приготовленный заранее для активации связующих элементов на поверхности.
9. Вывод.
Результатом настоящего изобретения являются значительно усовершенствованные способы и устройство для синтеза полимеров на субстрате. Следует отметить, что вышеприведенное описание служит чисто иллюстративным целям и не ограничивает объем изобретения. Для специалиста, ознакомившегося с приведенным описанием, очевидно, что возможны самые различные варианты осуществления изобретения. В данном случае изобретение описано, в первую очередь, на примере использования фотоотщепляемых защитных групп, однако для специалиста в данной области совершенно очевидно, что для этой цели может использоваться не только свет, но и другие источники излучения. Так, например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления может оказаться целесообразным использовать защитные группы, чувствительные к облучению электронным пучком, рентгеновским излучением в комбинации с электронно-лучевой или рентгеновской литографией. По другому варианту осуществления защитные группы могут быть удалены путем воздействия на них электрического тока. Поэтому объем защиты настоящего изобретения не должен ограничиваться вышеприведенным описанием, а должен определяться прилагаемой формулой изобретения с учетом всех характеризуемых ею эквивалентов.
Использование: в биохимии при изучении биологических систем для выяснения взаимосвязи между строением молекул и их активностью. Сущность изобретения: способ получения аминокислотных или нуклеиновокислотных последовательностей на субстрате путем воздействия на первую область субстрата (выбран из группы, состоящей из полимеризованной пленки Лэнгмюра-Блоджетта, стекла с функциональными группами, германия, кремния, полимеров политетрафторэтилена, полистирола, арсенида, галлия и комбинаций перечисленных материалов) активатором для удаления защитных групп, воздействия на первую область первым аминокислотным или нуклеотидным мономером, воздействия на вторую область активатором для удаления защитных групп; контактирование второй области с вторым аминокислотным или нуклеотидным мономером; способ скрининга большого количества аминокислотных последовательностей на связывание их с рецептором, субстрат для скрининга на биологическую активность, содержащий в предопределенных областях 103 или более различных пептидных или нуклеиновокислотных лигандов. 6 с.п. и 26 з.п. ф-лы, 17 ил., 3 табл.
а) воздействие на первую область субстрата активатором для удаления защитных групп;
б) воздействие, по меньшей мере, на эту первую область первым аминокислотным или нуклеотидным мономером;
в) воздействие на вторую область активатором для удаления защитных групп;
г) контактирование по меньшей мере второй области с вторым аминокислотным или нуклеотидным мономером.
а) размещение маски вблизи от субстрата, причем указанная маска имеет по существу прозрачные и непрозрачные для используемой для облучения области длины волны света;
б) облучение маски светом от источника, генерирующего по меньшей мере свет указанной длины волны.
а) активирование первой области субстрата, состоящего по меньшей мере из первой и второй областей, причем эти первая и вторая области субстрата содержат защитные группы, для удаления из нее этих защитных групп;
б) контактирование первого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, причем этот первый мономер включает первую защитную группу, в результате чего первый аминокислотный или нуклеотидный мономер связывается с первой областью субстрата;
в) активирование второй области субстрата для удаления из нее защитных групп субстрата;
г) контактирование второго аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, причем этот второй мономер включает защитную группу, в результате чего второй аминокислотный или нуклеотидный мономер связывается с второй областью субстрата;
д) активирование первой области для удаления защитной группы первого мономера;
е) контактирование третьего аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате которого этот третий мономер связывается в первой области с образованием в результате первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности;
ж) активирование второй области для удаления защитной группы второго мономера;
з) контактирование четвертого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается во второй области с образованием в результате второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, отличной от первой.
а) деактивирование первой области субстрата, состоящего по меньшей мере из первой и второй областей, для получения в ней первой защитной группы;
б) контактирование первого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается во второй области;
в) удаление защитной группы в первой области;
г) деактирование второй области для получения второй защитной группы во второй области;
д) контактирование второго аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате которого этот мономер связывается в первой области;
е) удаление защитной группы во второй области;
ж) деактирование первой области для получения в ней защитных групп;
з) контактирование третьего аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается во второй области с образованием первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности;
и) удаление защитных групп в первой области;
к) контактирование четвертого аминокислотного или нуклеотидного мономера с субстратом, в результате чего этот мономер связывается в первой области с образованием второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, отличной от первой.
а) введение первой маски между субстратом и источником энергии, причем в этой маске имеются первые и вторые области, первые из которых пропускают, а вторые не пропускают энергию от указанного источника;
б) направление энергии от указанного источника на субстрат, в результате чего происходит удаление защитной группы из первой части первого аминокислотного или нуклеиновокислотного полимера, под указанными первыми областями указанной первой маски;
в) контактирование второй части первого полимера с субстратом с образованием в результате первой аминокислотной или нуклеотидной полимерной последовательности;
г) введение второй маски между субстратом и источником энергии, причем в указанной маске имеются первые и вторые области;
д) направление энергии от указанного источника на субстрат, в результате чего под воздействием энергии, проходящей через первые области второй маски, происходит удаление защитной группы из первых частей второго аминокислотного или нуклеотидного полимера и под первыми областями второй маски;
е) контактирование второй части второго аминокислотного или нуклеотидного полимера с субстратом, в результате которого эта вторая часть второго полимера связывается с первой его частью с образованием второй аминокислотной или нуклеотидной полимерной последовательности.
а) взаимодействие по меньшей мере первой поверхности стеклянной пластины, имеющей по меньшей мере одну первую поверхность, причем эта первая поверхность включает фотозащитный материал, выбранный из группы, состоящей из нитровератрилок сикарбонила и нитробензилоксикарбонила, с третбутоксикарбонилом, причем указанная стеклянная пластина является практически прозрачной по меньшей мере для ультрафиолетового света;
б) контактирование по меньшей мере первой поверхности с ТФК для удаления указанного третбутоксикарбонила;
в) помещение указанной стеклянной пластины в реактор, включающий реакционный объем, причем по меньшей мере первая поверхность пластины находится в этом реакционном объеме;
г) размещение маски на стеклянной пластине в первом положении, причем указанная маска включает первые участки и вторые участки, причем первые участки по существу прозрачны, а вторые непрозрачны по меньшей мере для ультрафиолетового света, и вторые участки включают экранирующий свет материал, размещенный на первой поверхности маски, указанная первая поверхность маски контактирует с указанной стеклянной пластиной;
д) заполнение реакционного объема реакционным раствором;
е) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности стеклянной пластины под первыми участками маски;
ж) контактирование первой поверхности с первой аминокислотой, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал, причем концевая группа этой первой аминокислоты содержит указанную фотозащитную группу;
з) помещение маски, контактирующей с указанной стеклянной пластиной, во второе положение;
и) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности стеклянной пластины под первыми участками маски;
к) контактирование по меньшей мере первой поверхности со второй аминокислотой, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал, причем концевая группа второй аминокислоты представляет собой фотозащитную группу;
л) помещение маски, контактирующей с указанной стеклянной пластиной, в третье положение;
м) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности стеклянной пластины, находящейся под первыми участками маски;
н) воздействие по меньшей мере на первую поверхность третьей аминокислоты, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал;
о) помещение маски, контактирующей с указанной стеклянной пластиной, в четвертое положение;
п) облучение маски по меньшей мере ультрафиолетовым светом, под действием которого происходит удаление указанного фотозащитного материала по меньшей мере с первой поверхности указанной стеклянной пластины, находящейся под первыми участками маски;
р) контактирование по меньшей мере первой поверхности с четвертой аминокислотой, в результате чего эта аминокислота связывается с теми областями по меньшей мере первой поверхности, из которых был удален вышеуказанный фотозащитный материал, и указанная по меньшей мере первая поверхность, включает по меньшей мере первую, вторую, третью, четвертую аминокислотные последовательности;
с) контактирование по меньшей мере первой поверхности с исследованным антителом, причем указанное антитело более прочно связывается по меньшей мере с первой, второй, третьей или четвертой из указанных аминокислотных последовательностей;
т) контактирование указанной по меньшей мере первой последовательности с рецептором, распознающим указанное исследуемое антитело и связывающимся с ним в местах его локализации, причем указанный рецептор включает флуоресцеин;
у) экспонирование указанной по меньшей мере первой поверхности светом, в результате чего она флуоресцирует по меньшей мере в той области, в которой локализована более прочно связанная аминокислотная последовательность;
ф) детектирование и регистрация интенсивности флуоресцентного излучения как функции положения, на указанной по меньшей мере первой поверхности.
