АНАЛИЗЫ И СПОСОБЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОМАРКЕРОВ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/68 

Родственные заявки

По настоящей заявке по п.119(e) испрашивается приоритет предварительной заявки США номер 60/599425, поданной 6 августа 2004 г., полное содержание которой приведено здесь в качестве ссылки.

Область изобретения

Описанное здесь изобретение относится к способам и анализам для детекции биомаркеров, прогнозирующих чувствительность клеток млекопитающих к Apo2L/TRAIL и/или антителам - агонистам рецептора смерти.

Предпосылки изобретения

В данной области идентифицированы различные лиганды и рецепторы, принадлежащие к суперсемейству факторов некроза опухоли (TNF). Такие лиганды включают фактор некроза опухоли-альфа («TNF-альфа»), фактор некроза опухоли-бета («TNF-бета» или «лимфотоксин-альфа»), лимфотоксин-бета («LT-бета»), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд OX-40, лиганд 4-1BB, LIGHT, лиганд Apo-1 (обозначенный также как лиганд Fas или лиганд CD95), лиганд Apo-2 (обозначенный также как Apo2L или TRAIL), лиганд Apo-3 (обозначенный также как TWEAK), APRIL, лиганд OPG (обозначенный также как лиганд RANK, ODF или TRANCE) и TALL-1 (обозначенный также как BlyS, BAFF или THANK) (см., например, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992); WO 97/01633, опубликованная 16 января 1997 г.; WO 97/25428, опубликованная 17 июля 1997 г.; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO 98/28426, опубликованная 2 июля 1998 г.; WO 98/46751, опубликованная 22 октября 1998; WO 98/18921, опубликованная 7 мая 1998 г.; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

Индукция различных клеточных ответов, опосредованная такими лигандами семейства TNF, обычно инициирована их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Некоторые, но не все, лиганды семейства TNF связываются с «рецепторами смерти» на поверхности клетки и индуцируют через них различную биологическую активность для активации каспаз или ферментов, которые осуществляют гибель клеток или апоптотический путь (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)). Идентифицированные к настоящему времени члены суперсемейства рецептора TNF включают TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (обозначенный также как Apo-1 или CD95), DR4 (обозначенный также как TRAIL-R1), DR5 (обозначенный также как Apo-2 или TRAIL-R2), DcR1, DcR2, остеопротегерин (OPG), RANK и Apo-3 (обозначенный также как DR3 или TRAMP) (см., например, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, стр. 377-411; Locksley et al. Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417563, опубликованную 20 марта 1991 г.; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)).

Большинство из этих членов семейства рецепторов TNF разделяют обычную структуру рецепторов клеточной поверхности, включая внеклеточную, трансмембранную и внутриклеточную области, в то время как другие обнаружены в природе как растворимые белки с отсутствующим трансмембранным и внутриклеточным доменом. Внеклеточная часть типичных TNFR содержит повторяющийся образец аминокислотной последовательности множественных богатых цистеином доменов (CRD), начиная от N-конца.

Лиганд, обозначенный как Apo-2L или TRAIL, идентифицировали несколько лет назад как члена семейства цитокинов TNF (см., например, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; патент США 5763223, опубликованный 9 июня 1998 г.; патент США 6284236, опубликованный 4 сентября 2001 г.). Полноразмерная природная последовательность полипептида человека Apo2L/TRAIL представляет собой трансмембранный белок типа II длиной 281 аминокислот. Некоторые клетки могут продуцировать природную растворимую форму полипептида благодаря ферментативному отщеплению внеклеточной области полипептида (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Кристаллографическими исследованиями растворимых форм Apo2L/TRAIL выявили гомотримерную структуру, сходную со структурами TNF и других родственных белков (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Однако обнаружили, что, в отличие от других членов семейства TNF, Apo2L/TRAIL обладает тем уникальным структурным свойством, что три остатка цистеина (в положении 230 каждой субъединицы в гомотримере) вместе координируют атом цинка и что связывание цинка является важным для стабильности тримера и биологической активности (Hymowitz et al., выше, Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).

В литературе сообщалось, что Apo2L/TRAIL может играть роль в модуляции иммунной системы, включая аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит (см., например, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)).

Опубликовано также, что растворимые формы Apo2L/TRAIL индуцируют апоптоз в ряде раковых клеток, включая опухоли толстой кишки, легкого, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки, яичника и мозга, так же как меланому, лейкоз и множественную миелому (см., например, Wiley et al., выше; Pitti et al., выше; патент США 6030945, опубликованный 29 февраля 2000 г.; патент США 6746668, опубликованный 8 июня 2004 г.; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Исследования in vivo на моделях опухолей у мышей позволяют далее предполагать, что Apo2L/TRAIL, отдельно или в сочетании с химиотерапией или радиотерапией, может оказывать существенные противоопухолевые эффекты (см., например, Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., выше; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); патентную заявку PCT US/00/15512; патентную заявку PCT US/0l/23691). В отличие от многих типов раковых клеток, большинство нормальных типов клеток человека, по-видимому, являются устойчивыми к индукции апоптоза конкретными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше). Jo et al. опубликовали, что меченная полигистидином растворимая форма Apo2L/TRAIL индуцирует апоптоз in vitro в нормальных выделенных гепатоцитах человека, в отличие от не относящихся к человеку (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); см. также Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Считают, что конкретные препараты рекомбинантных Apo2L/TRAIL могут различаться в отношении биохимических свойств и биологических активностей для клеток, пораженных заболеванием, в отличие от нормальных клеток, в зависимости, например, от присутствия или отсутствия молекулы метки, содержания цинка и % содержания тримера (см. Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

Обнаружено, что Apo2L/TRAIL связывается по меньшей мере с пятью различными рецепторами. По меньшей мере два из рецепторов, связывающих Apo2L/TRAIL, содержат функциональный, цитоплазматический домен смерти. Один из таких рецепторов обозначен «DR4» (и альтернативно, как TR4 или TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); см. также WO 98/32856, опубликованную 30 июля 1998; WO 99/37684, опубликованную 29 июля 1999 г.; WO 00/73349, опубликованную 7 декабря 2000 г.; US 6433147, опубликованную 13 августа 2002 г.; US 6461823, опубликованную 8 октября 2002 г. и US 6342383, опубликованную 29 января 2002 г.).

Другой такой рецептор для Apo2L/TRAIL обозначен DR5 (его альтернативно обозначают также как Apo-2; TRAIL-R или TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER) (см., например, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), WO 98/51793, опубликованную 19 ноября 1998 г.; WO 98/41629, опубликованную 24 сентября 1998 г.; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованную 20 августа 1998 г.; EP 870827, опубликованную 14 октября 1998 г.; WO 98/46643, опубликованную 22 октября 1998 г.; WO 99/02653, опубликованную 21 января 1999 г.; WO 99/09165, опубликованную 25 февраля 1999 г.; WO 99/11791, опубликованную 11 марта 1999 г.; US 2002/0072091, опубликованную 13 августа 2002 г.; US 2002/0098550, опубликованную 7 декабря 2001 г.; US 6313269, опубликованную 6 декабря 2001 г.; US 2001/0010924, опубликованную 2 августа 2001 г.; US 2003/01255540, опубликованную 3 июля 2003 г.; US 2002/0160446, опубликованную 31 октября 2002 г., US 2002/0048785, опубликованную 25 апреля 2002 г.; US 6342369, опубликованную в феврале 2002 г.; US 6569642, опубликованную 27 мая 2003 г., US 6072047, опубликованную 6 июня 2000 г., US 6642358, опубликованную 4 ноября 2003 г.; US 6743625, опубликованную 1 июня 2004 г.). Опубликовано, что, подобно DR4, DR5 содержит цитоплазматический домен смерти и способен подавать сигнал апоптоза при связывании лиганда (или при связывании молекулы, такой как антитело-агонист, которое мимикрирует активность лиганда). Кристаллическая структура комплекса, сформированного между Apo-2L/TRAIL и DR5, описана в Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

При связывании лиганда как DR4, так и DR5 могут независимо запускать апоптоз посредством привлечения и активации инициатора апоптоза, каспазы-8, через содержащую домен смерти адапторную молекулу, обозначенную FADD/Mort1 (Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)).

Опубликовано, что Apo2L/TRAIL также связывает такие рецепторы, обозначенные DcR1, DcR2 и OPG, которые, как полагают, функционируют как ингибиторы, а не передатчики сигнала (см., например, DCR1 (обозначенный также как TRID, LIT или TRAIL-R3) (Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); и Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)); DCR2 (называемый также TRUNDD или TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)), OPG (Simonet et al., выше). В отличие от DR4 и DR5, рецепторы DcR1 и DcR2 не передают сигнал апоптоза.

Конкретные антитела, связывающие рецепторы DR4 и/или DR5, опубликованы в литературе. Например, анти-DR4 антитела, направленные против рецептора DR4 и обладающие агонистической или апоптической активностью в конкретных клетках млекопитающих, описаны, например, в WO 99/37684, опубликованной 29 июля 1999 г.; WO 00/73349, опубликованной 12 июля 2000 г.; WO 03/066661, опубликованной 14 августа 2003 г. См. также, например, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); WO 02/097033, опубликованную 2 декабря 2002 г.; WO 03/042367, опубликованную 22 мая 2003; WO 03/038043, опубликованную 8 мая 2003 г.; WO 03/037913, опубликованную 8 мая 2003 г. Подобным образом были описаны конкретные анти-DR5 антитела, см., например, WO 98/51793, опубликованную 8 ноября 1998 г.; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada; WO 03/038043, опубликованную 8 мая 2003 г.; WO 03/037913, опубликованную 8 мая 2003 г. Кроме того, были описаны некоторые антитела, обладающие перекрестной реактивностью как к рецептору DR4, так и к рецептору DR5 (см., например, патент США 6252050, опубликованный 26 июня 2001 г.).

Неопластическая трансформация некоторых клеток млекопитающих в определенных случаях связана с характерными изменениями в экспрессии антигенов сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X. Относительно высокие количества сиалил-Льюис A/X присутствуют, например, в некоторых аденокарциномах толстой кишки, поджелудочной железы и желудка человека, и анализы с применением антител, направленных против углеводных структур данных антигенов, применяют в качестве средств для детекции злокачественных опухолей поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта (см., например, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002)). Уровень экспрессии данных углеводных маркеров опухоли коррелирует также с клиническим исходом, временем выживания пациента и признаками метастазирования.

Показано, что как сиалил-Льюис A, так и сиалил-Льюис X связываются с семейством углевод-связывающих белков, вовлеченных в экстравазацию клеток из кровотока, называемых селектинами. Некоторые сообщения позволяют предполагать, что сиалил-Льюис A и X являются лигандами для E-селектина и могут являться ответственными за адгезию клеток опухоли человека на эндотелии. Сиалированные структуры Льюиса, присутствующие на поверхности раковых клеток, несут углеводные цепи гликопротеинов и гликолипидов и связывают E-селектин, присутствующий на эндотелиальных клетках. Селектины и их углеводные лиганды соответственно могут играть важную роль в избирательном хоминге опухолевых клеток во время метастазирования.

Считают, что биосинтез сиалил-Льюис A и X зависит от конечного добавления фукозы из гуанозиндифосфат-фукозы (GDP- Fuc) в альфа (1,3) и альфа (1,4) связь сиалированных предшественников специфическими для типа клеток и стадии развития ферментами, стадии, катализируемой альфа-1,3/1,4-фукозилтрансферазами (альфа 1,3/1,4 Fuc-T, FUT).

К настоящему времени клонировали и охарактеризовали несколько генов фукозилтрансферазы человека. Экспрессия данных генов (FUT 3-7) и их ферментативные продукты (Fuc-TIII-VII), по-видимому, являются тканеспецифическими. Ферменты, кодируемые пятью генами, обозначены FUTIII, FUTIV, FUTV, FUTVI и FUTVII. Три гена, кодирующие FUTIII, FUTV и FUTVI, локализованы в физически близких положениях на хромосоме 19pl3.3. Биохимические исследования и молекулярное клонирование позволяют предполагать, что линиеспецифическую экспрессию молекулы сиалил-Льюис A/X определяет линиеспецифическая экспрессия генов альфа-1,3-фукозилтрансферазы, ферментативные продукты которых действуют на конститутивно экспрессирующиеся олигосахаридные предшественники для получения локализованных на поверхности детерминант сиалил-Льюис A/X. Фукозилтрансферазами человека, ответственными за активность в эпителиальных тканях, являются FUT3 и FUT6. Транскрипты FUT3 (называемого также геном Льюис альфа(1,3/1,4)фукозилтрансферазы) и FUT6 (гена альфа(1,3)фукозилтрансферазы плазмы) присутствуют как в нормальных, так и в трансформированных тканях. Транскрипты фукозилтрансферазы распространены также в многочисленных линиях клеток аденокарциномы, с заметно повышенной экспрессией FUT3 и 6 в карциноме толстой кишки (см., например, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:303-311 (2002); Nakamori et al., Dis. Colon Rectum., 40:420-431 (1997); Takada et al., Cancer Res., 53:354-361 (1993); Ichikawa et al., J. Surg. Oncol., 75:98-102 (2000); Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res., 2002 Mar; 21(1):107-13; Matsumoto et al., Br J Cancer. 2002 Jan 21; 86(2):161-7; Ito et al., J Gastroenterol. 2001 Dec; 36(12):823-9; Nakagoe et al., Cancer Detect Prev. 2001; 25(3):299-308; Kumamoto et al., Cancer Res. 2001 Jun 1; 61 (11:4620-7; Murata et al., Dis Colon Rectum. 2001 Apr; 44 (4):A2-A4; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2001 Mar; 20(1):85-90; Nakagoe et al., J Gastroenterol. 2001 Mar; 36(3):166-72; Nakagoe et al., Tumour Biol. 2001 Mar-Apr; 22(2):115-22; Nakagoe et al., Can J Gastroenterol. 2000 Oct; 14(9):753-60; Izawa et al., Cancer Res. 2000 Mar 1; 60(5):1410-6; Tanaka et al., Hepatogastroenterology. 1999 Mar-Apr; 46(26):875-82; Matsushita et al., Cancer Lett. 1998 Nov 27; 133 (2):151-60; Sato et al., Anticancer Res. 1997 Sep-Oct; 17 (5A):3505-11; Yamada et al., Br J Cancer. 1997; 76(5):582-7; Nakamori et al., Dis Colon Rectum. 1997 Apr; 40(4):420-31; Srinivas et al., Scand J Immunol. 1996 Sep; 44(3):197-203; Matsushita et al., Lab Invest. 1990 Dec; 63(6):780-91; Ashizawa et al., J Exp Clin Cancer Res. 2003 Mar; 22 (1):91-8; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2002 Sep; 21(3):363-9; Nakagoe et al., Anticancer Res. 2002 Jan-Feb; 22(1A):451-8; Nakagoe et al., J Clin Gastroenterol. 2002 Apr; 34(4):408-15; Nakagoe et al., Cancer Lett. 2002 Jan 25; 175(2):213-21; Tatsumi et al., Clin Exp Metastasis. 1998 Nov; 16(8):743-50; Ikeda et al., J Surg Oncol. 1996 Jul; 62(3):171-6; Ikeda et al., Eur J Surg Oncol. 1995 Apr; 21 (2):168-75; Togayachi et al., Int J Cancer. 1999 Sep 24; 83 (1):70-9; Satoh et al., Clin Cancer Res. 1997 Apr; 3(4):495-9; Satoh et al., Respiration. 1998; 65(4):295-8; Satoh et al., Anticancer Res. 1998 Jul-Aug; 18(4B):2865-8; Fukuoka et al., Lung Cancer. 1998 May; 20(2):109-16; Fujiwara et al., Anticanefer Res. 1998 Mar-Apr; 18(2A):1043-6; Ogawa et al., Int J Cancer. 1997 Apr 22; 74 (2):189-92; Ogawa et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 1994 Aug; 108(2):329-36; Asao et al., Cancer. 1989 Dec 15; 64 (12):2541-5; Narita et al., Breast Cancer. 1996 Mar 29; 3(1):19-23; Yamaguchi et al., Oncology. 1998 Jul-Aug; 55(4):357-62; Sikut et al., Int J Cancer. 1996 May 29; 66 (5):617-23; Saito et al., Anticancer Res. 2003 Jul-Aug; 23(4):3441-6; Fujii et al., Urol Int. 2000; 64 (3):129-33; Idikio et al., Glycoconj J. 1997 Nov; 14 (7):875-7; Inoue et al., Obstet Gynecol. 1992 Mar; 79(3):434-40; Yamashita et al., Eur J Cancer. 2000 Jan; 36(1):113-20; Hamanaka et al., Pancreas. 1996 Aug; 13(2):160-5; Ho et al., Cancer Res. 1995 Aug 15; 55(16):3659-63).

Сущность изобретения

Описанное здесь изобретение относится к способам и анализам для исследования экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце ткани или клеток млекопитающего, где экспрессия одного или нескольких таких биомаркеров является показателем того, будет ли образец ткани или клеток чувствительным к апоптоз-индуцирующим веществам, таким как Apo2L/TRAIL и антителам-агонистам анти-DR5. В различных вариантах осуществления изобретения этими способами и анализами исследуют экспрессию таких биомаркеров, как конкретные фукозилтрансферазы, в частности фукозилтрансфераза 3 (FUT3) и/или фукозилтрансфераза 6 (FUT6), так же как антигены сиалил-Льюис A и/или X.

Как обсуждают выше, большинство нормальных типов клеток человека, по-видимому, являются устойчивыми к индукции апоптоза конкретными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше, Walzcak et al., выше). Обнаружили также, что некоторые популяции пораженных заболеванием типов клеток человека (такие, как конкретные популяции раковых клеток) устойчивы к индукции апоптоза конкретными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, выше; Walczak et al., Nature Med., 1999, выше). Следовательно, при исследовании посредством анализа экспрессии конкретных биомаркеров в образце ткани или клеток млекопитающего можно удобно и эффективно получить информацию, применимую в определении подходящей или эффективной терапии для лечения пациентов. Например, информация, полученная из анализа для детекции экспрессии FUT3 или FUT6 в образце ткани или клеток млекопитающего, может предоставить терапевтам полезные данные, которые можно применять для определения оптимального терапевтического режима (с применением Apo2L/TRAIL или антител-агонистов рецептора смерти) для пациентов, страдающих нарушением, таким как злокачественная опухоль.

Изобретение относится к способам предсказания чувствительности образца ткани или клеток (такого, как раковая клетка) млекопитающего к Apo2L/TRAIL или антителу-агонисту рецептора смерти. В конкретных вариантах осуществления способы включают получение образца ткани или клеток млекопитающего и проверку в ткани или клетке экспрессии фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6. Способы могут включать также проверку в ткани или клетке экспрессии другого биомаркера, такого как антиген(ы) сиалил-Льюис A и/или X. Способы можно осуществлять во множестве форматов анализа, включая анализы, детектирующие экспрессию мРНК, ферментативные анализы, детектирующие присутствие ферментативной активности, иммуногистохимические анализы и другие, обсуждаемые здесь. Определение экспрессии таких биомаркеров в указанных тканях или клетках будет показателем того, что такие ткани или клетки будут чувствительными к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL или антитела-агониста рецептора смерти. В необязательных вариантах осуществления в тканях или клетках можно исследовать также экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2.

Дополнительные способы по изобретению включают способы индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающие стадии получения образца ткани или клеток млекопитающего, исследования в ткани или клетке экспрессии одного или нескольких биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3, фукозилтрансфераза 6, антиген(ы) сиалил-Льюис A и/или X, и при определении того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует один или несколько указанных биомаркеров, воздействия на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством Apo2L/TRAIL или антитела-агониста рецептора смерти. Стадии в способах для проверки экспрессии одного или нескольких биомаркеров можно проводить во множестве форматов анализа, включая анализы, детектирующие экспрессию мРНК, ферментативные анализы, детектирующие присутствие ферментативной активности, и иммуногистохимические анализы. В необязательных вариантах осуществления способы также включают проверку в образце ткани или клеток экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2. Необязательно, образец ткани или клеток содержит раковые ткань или клетки.

Дополнительные способы по изобретению включают способы лечения у млекопитающего нарушения, такого как связанное с иммунитетом нарушение или злокачественная опухоль, включающие стадии получения образца ткани или клеток от млекопитающего, проверку в ткани или клетках экспрессии одного или нескольких биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3, фукозилтрансфераза 6, антиген(ы) сиалил-Льюис A и/или X, и при определении того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует один или несколько указанных биомаркеров, введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL или антитела-агониста рецептора смерти. Стадии в способах для проверки экспрессии одного или нескольких биомаркеров можно проводить во множестве форматов анализа, включая анализы, детектирующие экспрессию мРНК, ферментативные анализы, детектирующие присутствие ферментативной активности, и иммуногистохимические анализы. В необязательных вариантах осуществления способы также включают проверку в образце ткани или клеток экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2.

Дополнительно, способы предусматривают лечение злокачественной опухоли у млекопитающего. Дополнительно, способы включают, кроме введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL и/или антитела-агониста рецептора смерти, введение химиотерапевтического средства (средств) или радиотерапию.

Дополнительные варианты осуществления более подробно описаны в следующей формуле изобретения.

1. Способ предсказания чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего к Apo2L/TRAIL, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, где экспрессия одного или нескольких указанных биомаркеров является показателем того, что указанный образец ткани или клеток является чувствительным к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL.

2. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют детекцией экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

3. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X.

4. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

5. Способ по п.1, где образец ткани или клеток содержит ткань или клетки злокачественной опухоли.

6. Способ по п.5, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

7. Способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров воздействия на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством Apo2L/TRAIL.

8. Способ по п.7, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют тестированием экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

9. Способ по п.7, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена(антигенов) сиалил-Льюис A и/или X.

10. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

11. Способ по п.7, где указанный образец ткани или клеток содержит ткань или клетки злокачественной опухоли.

12. Способ по п.11, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

13. Способ по п.7, где на указанные клетки воздействуют эффективным количеством полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 фиг.1.

14. Способ лечения у млекопитающего нарушения, такого как связанное с иммунитетом нарушение или злокачественная опухоль, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток от указанного млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

15. Способ по п.14, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют детекцией экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

16. Способ по п.14, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X.

17. Способ по п.14, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанной ткани или клетке.

18. Способ по п.14, где образец ткани или клеток содержит ткань или клетки злокачественной опухоли.

19. Способ по п.18, где указанные клетки или ткань злокачественной опухоли содержат злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

20. Способ по п.14, где указанному млекопитающему вводят эффективное количество полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 фиг.1.

21. Способ по п.14, где указанное млекопитающее также получает химиотерапевтическое средство (средства) или радиотерапию.

22. Способ по п.14, где указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксическое средство или ингибирующее рост средство.

23. Способ по п.7, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

24. Способ по п.14, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

25. Способ по п.6, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки толстой кишки или колоректальные.

26. Способ по п.1, где указанный Apo2L/TRAIL представляет собой полипептид, содержащий аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1), или его биологически активный фрагмент.

27. Способ по п.26, где указанный Apo2L/TRAIL представляет собой полипептид, содержащий аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

28. Способ по п.12, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки толстой кишки или колоректальные.

29. Способ по п.20, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL состоит из аминокислот 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

30. Способ предсказания чувствительности клеток злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных, к Apo2L/TRAIL, включающий стадии:

получения клеток злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных;

исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, где экспрессия одного или нескольких указанных биомаркеров является показателем того, что указанные клетки злокачественной опухоли являются чувствительными к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL.

31. Способ индукции апоптоза в клетках злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных, включающий стадии:

получения клеток злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных;

исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров воздействия на указанные клетки злокачественной опухоли эффективным количеством полипептида Apo2L/TRAIL.

32. Способ по п.31, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1) или их фрагмент, обладающий апоптотической активностью.

33. Способ по п.32, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

34. Способ по п.32, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

35. Способ лечения у млекопитающего злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальной, включающий стадии:

получения образца клеток злокачественной опухоли указанного млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных;

исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

36. Способ по п.35, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1) или их фрагмент, обладающий апоптотической активностью.

37. Способ по п.36, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

38. Способ по п.36, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

Краткое описание фигур

На фиг.1 показана нуклеотидная последовательность кДНК лиганда Apo-2 человека (SEQ ID NO:2) и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1). «N» в положении нуклеотида 447 использован, чтобы указать, что нуклеотидное основание может представлять собой «T» или «G».

На фиг.2A и 2B показана нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) для полноразмерного DR4 человека и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности DR4 человека опубликованы также в Pan et al., Science, 276:111 (1997).

На фиг.3A показана последовательность DR5 человека из 411 аминокислот (SEQ ID NO:5), как опубликовано в WO 98/51793 19 ноября 1998 г. В данной области известен вариант транскрипционного сплайсинга DR5 человека. Этот вариант сплайсинга кодирует последовательность DR5 человека из 440 аминокислот (SEQ ID NO:6), показанную на фиг.3B и 3C, как опубликовано в WO 98/35986 20 августа 1998 г.

На фиг.3D показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:7) для полноразмерного DcRl человека и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DcRl человека (и его конкретных доменов) показаны и описаны также в WO 98/58062.

На фиг.3E показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:9) для полноразмерного DcR2 человека и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DcR2 человека (и его конкретных доменов) показаны и описаны в WO 99/10484.

На фиг.4 показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:11) для полноразмерной (1,3/1,4) фукозилтрансферазы (FUT3) человека и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12). Данные последовательности соответствуют инвентарному номеру в GenBank HSU27328 и описаны, например, в Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Aug; 4 (8):1288-303.

На фиг.5 показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:13) полноразмерной альфа (1,3) фукозилтрансферазы (FUT6) человека и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14). Данные последовательности соответствуют инвентарному номеру в GenBank HSU27333 и описаны, например, в Koszdin and Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31; 187 (1):152-7.

На фиг.6 показана обобщенная таблица данных, полученных при анализе 28 линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по чувствительности или устойчивости к апоптотической активности Apo2L (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки «FBS» или 10% FBS) или моноклонального антитела к DR5 «mab», перекрестно-сшитого «XL» или не перекрестно-сшитого (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки «FBS» или 10% FBS) и по экспрессии FUT 3, FUT 6, сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X.

На фиг.7 показано сравнение чувствительности различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, к антителу к DR5 и экспрессии FUT 3, как измерено количественной ПЦР.

На фиг.8 показано сравнение чувствительности различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по чувствительности или устойчивости к антителу к DR5 (плюс перекрестносшивающее средство) и экспрессии сиалил-Льюис X или A, как определено FACS.

На фиг.9A показан коэффициент ранговой корреляции Спирмэна при анализе чувствительности или устойчивости различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, и корреляции с экспрессией FUT3.

На фиг.9B показаны результаты точного теста Фишера для анализа чувствительности («чувств.») или устойчивости («уст.») различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, и статистическая значимость между экспрессией FUT 3 и сиалил-Льюис A/X и чувствительностью соответствующих линий клеток к апоптотической активности антитела к DR5.

На фиг.10 показано сравнение различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по экспрессии рецепторов DcRl или DcR2 (как определено количественной ПЦР) и статус (чувствительные или устойчивые) конкретных линий клеток по отношению к Apo2L или антителу к DR5.

На фиг.11 показано сравнение различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по экспрессии рецепторов DcRl или DcR2 (как определено FACS) и статус (чувствительные или устойчивые) конкретных линий клеток по отношению к Apo2L или антителу к DR5.

На фиг.12 показано иммуногистохимическое окрашивание сиалил-Льюис A и X в четырех линиях раковых колоректальных клеток, CaCo2, SW 1417, DLD-1 и Colo 205, и его корреляция с экспрессией сиалил-Льюис A и X, как измерено FACS, и ее корреляция с чувствительностью к Apo2L.

На фиг.13 показаны обобщенные результаты IHC экспериментов, демонстрирующие экспрессию сиалил-Льюис A и X в образцах ткани нормальной слизистой толстой кишки, нормальной ткани печени, первичного рака толстой кишки и метастазов рака толстой кишки.

Подробное описание изобретения

Способы и процедуры, описанные или приведенные в ссылках здесь, как правило, хорошо понятны специалистам в данной области и обычно выполнимы ими с применением общепринятой методологии, такой как, например, широко применяемые методологии молекулярного клонирования, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. В соответствующих случаях процедуры, предусматривающие применение коммерчески доступных наборов и реагентов, обычно проводят в соответствии с определенными производителем протоколами и/или параметрами, если не указано иначе.

Перед описанием настоящих способов и анализов следует понимать, что настоящее изобретение не является ограниченным конкретными описанными методологией, протоколами, линиями клеток, видами или родами животных конструкциями и реагентами, так как их, конечно можно изменять. Следует понимать также, что применяемая здесь терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Следует заметить, что, как применяют здесь и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не требует другого. Так, например, ссылка на «генетическое изменение» включает множество таких изменений, а ссылка на «зонд» включает ссылку на один или несколько зондов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее.

Все упомянутые здесь публикации приведены здесь в качестве ссылки, чтобы раскрывать и описывать способы и/или материалы, в связи с которыми процитированы публикации. Процитированные здесь публикации включены сюда для их описания перед датой подачи настоящей заявки. Ничего здесь не следует истолковывать как признание, что авторы настоящего изобретения не имеют права называть дату публикаций задним числом на основании более ранней даты приоритета или перед датой изобретения. В дальнейшем фактические даты опубликования могут отличаться от указанных и требовать независимой проверки.

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термины «Apo2L/TRAIL», «Apo-2L» и «TRAIL» применяют здесь, чтобы обозначать последовательность полипептида, содержащую аминокислотные остатки 114-281, включительно, 95-281, включительно, остатки 92-281, включительно, остатки 91-281, включительно, остатки 41-281, включительно, остатки 15-281, включительно, или остатки 1-281, включительно, аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, так же как биологически активные фрагменты, делеционные, инсерционные или замещенные варианты вышеуказанных последовательностей. В одном из вариантов осуществления последовательность полипептида содержит остатки 114-281 фиг.1 и, необязательно, состоит из остатков 114-281 фиг.1. Необязательно, последовательность полипептида содержит остатки 92-281 или остатки 91-281 фиг.1. Полипептиды Apo-2L может кодировать природная нуклеотидная последовательность, показанная на фиг.1. Необязательно, кодон, кодирующий остаток Proll9 (фиг.1), может представлять собой «CCT» или «CCG». В других вариантах осуществления фрагменты или варианты являются биологически активными и обладают по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности и, даже более предпочтительно, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с любой из перечисленных выше последовательностей Apo2L/TRAIL. Необязательно, полипептид Apo2L/TRAIL кодирует нуклеотидная последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с кодирующей полинуклеотидной последовательностью, представленной на фиг.1. Определение охватывает замещенные варианты Apo2L/TRAIL, в которых по меньшей мере одна из его природных аминокислот заменена остатком аланина. Конкретные замещенные варианты Apo2L/TRAIL включают те, в которых по меньшей мере одна аминокислота замещена остатком аланина. Данные замещенные варианты включают, например, обозначенные как «D203A»; «D218A» и «D269A». Эту номенклатуру применяют для обозначения вариантов Apo2L/TRAIL, где остатки аспарагиновой кислоты в положениях 203, 218 и/или 269 (с использованием нумерации, показанной на фиг.1) замещают на остатки аланина. Необязательно, варианты Apo2L могут содержать одну или несколько аланиновых замен, перечисленных в таблице I или опубликованной заявке PCT WO 01/00832. Замещенные варианты включают одну или несколько замен остатков, перечисленных в таблице I или WO 01/00832, опубликованной 4 января 2001 г. Определение охватывает также природную последовательнoсть Apo2L/TRAIL, выделенную из источника Apo2L/TRAIL или полученную рекомбинантными или синтетическими способами. Apo2L/TRAIL по изобретению включает полипептиды, обозначенные как Apo2L/TRAIL или TRAIL, описанные в публикациях PCT WO 97/01633 и WO 97/25428. Термины «Apo2L/TRAIL» или «Apo2L» применяют, чтобы обозначать в общем смысле формы Apo2L/TRAIL, включающие мономерную, димерную или тримерную формы полипептида. Для всей нумерации аминокислотных остатков, обозначенных на последовательности Apo2L, используют нумерацию согласно фиг.1, если конкретно не указано иначе. Например, «D203» или «Asp203» относится к остатку аспарагиновой кислоты в положении 203 в последовательности, приведенной на фиг.1.

Термин «внеклеточный домен Apo2L/TRAIL» или «Apo2L/TRAIL ECD» относится к форме Apo2L/TRAIL, которая является по существу свободной от трансмембранного и цитоплазматического доменов. Обычно ECD будет обладать менее чем 1% таких трансмембранного и цитоплазматического доменов и, предпочтительно, будет обладать менее чем 0,5% таких доменов. Будет понятно, что любой трансмембранный домен(ы), идентифицированный для полипептидов по настоящему изобретению, идентифицирован согласно критериям, обычно применяемым в данной области для идентификации гидрофобных доменов такого типа. Точные границы трансмембранного домена могут варьировать, но, наиболее вероятно, не более чем приблизительно на 5 аминокислот на любом конце домена, как идентифицировали первоначально. В предпочтительных вариантах осуществления ECD будет состоять из последовательности растворимого внеклеточного домена полипептида, свободного от трансмембранного и цитоплазматического или внутриклеточного доменов (и не связанного с мембраной). Конкретные последовательности внеклеточного домена Apo-2L/TRAIL описаны в публикациях PCT WO 97/01633 и WO 97/25428.

Термин «мономер Apo2L/TRAIL» или «мономер Apo2L» относится к последовательности ковалентной цепи внеклеточного домена Apo2L.

Термин «димер Apo2L/TRAIL» или «димер Apo2L» относится к двум мономерам Apo-2L, соединенным ковалентной связью через дисульфидную связь. Термин, как применяют здесь, включает свободно располагающиеся димеры Apo2L и димеры Apo2L, находящиеся внутри тримерных форм Apo2L (т.е. связанные с другим, третьим мономером Apo2L).

Термин «тример Apo2L/TRAIL» или «тример Apo2L» относится к трем мономерам Apo2L, связанным нековалентно.

Термин «агрегат Apo2L/TRAIL» применяют для обозначения самоассоциированных высших олигомерных форм Apo2L/TRAIL, таких как тримеры Apo2L/TRAIL, которые формируют, например, гексамерные и наномерные формы Apo2L/TRAIL. Определение присутствия и количества мономера, димера или тримера (или других агрегатов) Apo2L/TRAIL можно выполнять с применением способов и анализов, известных в данной области (и с применением коммерчески доступных материалов), таких как нативная эксклюзионная ВЭЖХ («SEC»), денатурирующая эксклюзионная с применением додецилсульфата натрия («SDS-SEC»), обращеннофазовая ВЭЖХ и капиллярный электрофорез.

«Рецептор лиганда Apo-2» включает рецепторы, обозначенные в данной области как «DR4» и «DR5», полинуклеотидные и полипептидные последовательности которых показаны на фиг.2 и 3 соответственно. Pan et al. описали член семейства рецепторов TNF, обозначенный как «DR4» (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); см. также WO 98/32856, опубликованную 30 июля 1998 г.; WO 99/37684, опубликованную 29 июля 1999 г.; WO 00/73349, опубликованную 7 декабря 2000 г.; US 6433147, опубликованную 13 августа 2002; US 6461823, опубликованную 8 октября 2002 г., и US 6342383, опубликованную 29 января 2002 г.). Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) и Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) описали другой рецептор для Apo2L/TRAIL (см. также WO 98/51793, опубликованную 19 ноября 1998 г.; WO 98/41629, опубликованную 24 сентября 1998 г.). Данный рецептор обозначили как DR5 (рецептор альтернативно обозначили также как Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованную 20 августа 1998 г.; EP 870827, опубликованную 14 октября 1998; WO 98/46643, опубликованную 22 октября 1998 г.; WO 99/02653, опубликованную 21 января 1999 г.; WO 99/09165, опубликованную 25 февраля 1999 г.; WO 99/11791, опубликованную 11 марта 1999 г.; US 2002/0072091, опубликованную 13 августа 2002 г.; US 2002/0098550, опубликованную 7 декабря 2001 г.; US 6313269, опубликованную 6 декабря 2001 г.; US 2001/0010924, опубликованную 2 августа 2001 г.; US 2003/01255540, опубликованную 3 июля 2003 г.; US 2002/0160446, опубликованную 31 октября 2002 г., US 2002/0048785, опубликованную 25 апреля 2002 г.; US 6569642, опубликованную 27 мая 2003 г., US 6072047, опубликованную 6 июня 2000 г., US 6642358, опубликованную 4 ноября 2003 г.). Как описано выше, другие рецепторы для Apo-2L включают DcRl, DcR2 и OPG (см. Sheridan et al., выше; Marsters et al., выше; и Simonet et al., выше). Термин «рецептор Apo-2L», когда применен здесь, охватывает природную последовательность рецептора и варианты рецептора. Данные термины охватывают рецептор Apo-2L, экспрессирующийся у множества млекопитающих, включая людей. Рецептор Apo-2L может являться эндогенно экспрессированным, как естественно происходит во множестве линий тканей человека, или может являться экспрессированным рекомбинантными или синтетическими способами. «Природная последовательность рецептора Apo-2L» содержит полипептид, обладающий такой же аминокислотной последовательностью, как рецептор Apo-2L, обнаруженный в природе. Таким образом, природная последовательность рецептора Apo-2L может обладать аминокислотной последовательностью встречающегося в природе рецептора Apo-2L любого млекопитающего. Такую природную последовательность рецептора Apo-2L можно выделить из природного источника или можно получить рекомбинантными или синтетическими способами. Термин «природная последовательность рецептора Apo-2L» конкретно охватывает встречающиеся в природе усеченные или секретируемые формы рецептора (например, растворимую форму, содержащую, например, последовательность внеклеточного домена), встречающиеся в природе формы вариантов (например, формы альтернативного сплайсинга) и встречающиеся в природе аллельные варианты. Варианты рецептора могут включать фрагменты или делеционные мутанты природной последовательности рецептора Apo-2L. На фиг.3A показана последовательность DR5 человека из 411 аминокислот, как опубликовано в WO 98/51793 19 ноября 1998 г. В данной области известен вариант транскрипционного сплайсинга DR5 человека. Этот вариант сплайсинга DR5 кодирует последовательность DR5 человека из 440 аминокислот, показанную на фиг.3B и 3C, как опубликовано в WO 98/35986 20 августа 1998 г.

«Антитело к рецептору смерти» используют здесь, чтобы обозначать в общем смысле антитело или антитела, направленные против рецептора из суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей, содержащего домен смерти, способный передавать сигнал апоптоза, и такие антитела включают антитело к DR5 и антитело к DR4.

«Антитело к рецептору DR5», «антитело к DR5» или «анти-DR5 антитело» используют в широком смысле для обозначения антител, которые связываются по меньшей мере с одной формой рецептора DR5 или его внеклеточного домена. Необязательно, антитело к DR5 слито или связано с гетерологичной последовательностью или молекулой. Гетерологичная последовательность предпочтительно позволяет или помогает антителу формировать олигомерные комплексы или комплексы высшего порядка. Антитело к DR5, необязательно, связывается с рецептором DR5, но не связывается или перекрестно не реагирует с каким-либо дополнительным рецептором Apo-2L (например, DR4, DcRl или DcR2). Антитело, необязательно, является агонистом сигнальной активности DR5.

Антитело к DR5 по изобретению, необязательно, связывает рецептор DR5 в диапазоне концентраций от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 20 мМ, как измеряют анализом связывания BIAcore. Для антител к DR5 по изобретению, необязательно, показывают значение IC₅₀ от приблизительно 0,6 нМ до приблизительно 18 мМ, как измеряют анализом связывания BIAcore.

«Антитело к рецептору DR4», «антитело к DR4» или «анти -DR4 антитело» используют в широком смысле для обозначения антител, которые связываются по меньшей мере с одной формой рецептора DR4 или его внеклеточного домена. Необязательно, антитело к DR4 слито или связано с гетерологичной последовательностью или молекулой. Гетерологичная последовательность предпочтительно позволяет или помогает антителу формировать олигомерные комплексы или комплексы высшего порядка. Антитело к DR4, необязательно, связывается с рецептором DR4, но не связывается или перекрестно не реагирует с каким-либо дополнительным рецептором Apo-2L (например, DR5, DcR1 или DcR2). Антитело, необязательно, является агонистом сигнальной активности DR4.

Антитело к DR4 по изобретению, необязательно, связывает рецептор DR4 в диапазоне концентраций от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 20 мМ, как измеряют анализом связывания BIAcore. Для антител к DR4 по изобретению, необязательно, показывают значение IC₅₀ от приблизительно 0,6 нМ до приблизительно 18 мМ, как измеряют анализом связывания BIAcore.

Термин «агонист» применен здесь в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая частично или полностью усиливает, стимулирует или активирует одну или несколько биологических активностей Apo2L/TRAIL, DR4 или DR5 in vitro, in situ или in vivo. Примеры такого биологического действия связывания Apo2L/TRAIL с DR4 или DR5 включают апоптоз, так же как активности, дополнительно описанные в литературе. Агонист может функционировать прямым или опосредованным образом. Например, агонист может действовать, чтобы частично или полностью улучшать, стимулировать или активировать одну или несколько биологических активностей DR4 или DR5, in vitro, in situ или in vivo в результате непосредственного связывания с DR4 или DR5, что приводит к активации рецептора или передачи сигнала. Агонист может действовать также опосредованно, чтобы частично или полностью улучшать, стимулировать или активировать одну или несколько биологических активностей DR4 или DR5, in vitro, in situ или in vivo в результате, например, стимуляции другой эффекторной молекулы, что затем приводит к активации передачи сигнала DR4 или DR5. Предполагают, что агонист может действовать как молекула-энхансер, которая действует опосредованно, чтобы усиливать или увеличивать активацию или активность DR4 или DR5. Например, агонист может усиливать активность эндогенного Apo-2L у млекопитающего. Это можно осуществить, например, предварительным образованием комплексов DR4 или DR5 или стабилизацией комплексов соответствующего лиганда с рецептором DR4 или DR5 (такой, как стабилизация нативного комплекса, сформированного между Apo-2L и DR4 или DR5).

Термин «биомаркер», как применяют в настоящей заявке, как правило, обозначает молекулу, включая ген, белок, углеводную структуру или гликолипид, экспрессию которых в или на ткани или клетке млекопитающего можно детектировать стандартными способами (или способами, описанными здесь), и она является показателем для определения чувствительности клетки или ткани млекопитающего к Apo2L/TRAIL или антителу к рецептору смерти. Такие биомаркеры, рассматриваемые в настоящем изобретении, включают в качестве неограничивающих примеров «(1,3/1,4)фукозилтрансферазу» или «FUT3», «альфа(1,3)фукозилтрансферазу» или «FUT6», «сиалил-Льюис A» и «сиалил-Льюис X». Необязательно, определяют, что экспрессия такого биомаркера является более высокой, чем наблюдают в контрольном образце ткани или клеток. Необязательно, например, в анализе ПЦР или FACS будут определять, что экспрессия такого биомаркера является по меньшей мере в 50 раз или предпочтительно по меньшей мере в 100 раз более высокой, чем наблюдают для контрольного образца ткани или клеток. Необязательно, экспрессию такого биомаркера будут определять в анализе IHC баллом интенсивности окрашивания по меньшей мере 2 или выше.

«(1,3/1,4)фукозилтрансферазу» или «FUT3» используют здесь для обозначения молекулы, обладающей структурными свойствами, описанными здесь, и, необязательно, катализирующей перенос остатка фукозы от донорного субстрата, GDP-фукозы, к акцепторному субстрату на α3- или α4- связь GlcNAc (FUT III-VII и IX). Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность FUT3 человека представлены на фиг.4. Данные последовательности соответствуют инвентарному номеру в GenBank HSU27328 и описаны, например, в Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Aug; 4(8):1288-303. FUT, как правило, представляют собой трансмембранные гликопротеины, находящиеся в пузырьках Гольджи, и обычно состоят из N-концевого цитоплазматического хвоста, трансмембранной области и каталитического домена, обращенного в просвет в аппарате Гольджи. Между трансмембранной областью и каталитическим доменом присутствует область, называемая стеблем (Paulson and Colley, J. Biol. Chem., 264:17615-17618 (1989)).

«Альфа (1,3) фукозилтрансферазу» или «FUT6» используют здесь для обозначения молекулы, структурно родственной, например, последовательности ДНК и аминокислотной последовательности FUT6 человека, приведенной на фиг.5. Данные последовательности соответствуют инвентарному номеру в GenBank HSU27333 и описаны, например, в Koszdin and Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31;187 (1):152-7. FUT 6 обычно экспрессирована в эпителиальных клетках, в печени, почках и желудочно-кишечных тканях, конкретно, желудка, тонкой кишки и толстой кишки (и обычно минимально экспрессирована в селезенке, легких и шейке матки). FUT 6 обычно не обнаруживают в мозге, коре надпочечников или лейкоцитах периферической крови.

«Сиалил-Льюис A» используют здесь для обозначения тетрасахаридной углеводной структуры или антигена, обладающего следующей последовательностью или структурой, который может присутствовать в мембраносвязанной или в растворимой форме, циркулирующей, например, в сыворотке:

NeuAcα2-->3Galβl-->3[Fucαl-->4]GlcNAcβl-->R (NeuAcα2-->3Galβl-->3 (Fucαl-->4)GlcNAcβl-->R)

«Сиалил-Льюис X» используют здесь для обозначения тетрасахаридной углеводной структуры или антигена, обладающего следующей последовательностью или структурой, который может присутствовать в мембраносвязанной или в растворимой форме, циркулирующей, например, в сыворотке:

NeuAcα2-->3Galβl-->4[Fucαl-->3]GlcNAcβl-->R (NeuAcα2-->3Galβl-->4 (Fucαl-->3)GlcNAcβl-->R)

Под «субъектом» или «пациентом» понимают любого отдельного субъекта, для которого желательна терапия, включая людей, крупный рогатый скот, собак, морских свинок, кроликов, цыплят, насекомых и т.д. Для включения в качестве субъектов предназначены также любые субъекты, вовлеченные в клинические исследования, не обладающие какими-либо клиническими признаками заболевания, или субъекты, вовлеченные в эпидемиологические исследования, или субъекты, используемые в качестве контролей.

Термин «млекопитающее», как применяют здесь, обозначает любое млекопитающее, классифицируемое как млекопитающее, включая людей, коров, лошадей, собак и кошек. В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека.

Под «образцом ткани или клеток» понимают набор одинаковых клеток, полученных из ткани субъекта или пациента. Источником образца ткани или клеток может являться плотная ткань, как, например, из свежего, замороженного и/или фиксированного органа или образца ткани, или биопсия, или аспират; кровь или любые компоненты крови; физиологические жидкости, такие как спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость; клетки любого периода беременности или развития субъекта. Образец ткани может также представлять собой первичные или культивируемые клетки или линии клеток. Образец ткани или клеток, необязательно, получают из первичной или метастатической опухоли. Образец ткани может содержать компоненты, естественно не смешанные с тканью в природе, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксаторы, питательные вещества, антибиотики или подобные.

Для целей здесь «срез» образца ткани обозначает отдельную часть или кусок образца ткани, например тонкий срез ткани или клеток, срезанный с образца ткани. Понятно, что можно взять множество секций образцов ткани и подвергнуть анализу по настоящему изобретению, при условии, что понятно, что настоящее изобретение относится к способу, в котором ту же самую секцию образца ткани анализируют как на морфологическом, так и на молекулярном уровнях, или анализируют в отношении как белка, так и нуклеиновой кислоты.

Под «коррелировать» или «корреляцией» понимают сравнение, любым способом, выхода и/или результатов первого анализа или протокола с выходом и/или результатами второго анализа или протокола. Например, можно использовать результаты первого анализа или протокола в выполнении вторичных протоколов и/или можно использовать результаты первого анализа или протокола, чтобы определить, следует ли выполнять второй анализ или протокол. Что касается осуществления иммуногистохимического анализа или протокола, можно использовать результаты IHC, чтобы определить, следует ли выполнять конкретный лечебный режим.

Термин «нуклеиновая кислота» предназначен, чтобы включать любую ДНК или РНК, например хромосомную, митохондриальную, вирусную и/или бактериальную нуклеиновую кислоту, присутствующую в образце ткани. Термин «нуклеиновая кислота» охватывает любую из двух или обе цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты и включает любой фрагмент или часть интактной молекулы нуклеиновой кислоты.

Под «геном» понимают любую последовательность нуклеиновой кислоты или ее часть, функциональной ролью которой является кодирование или транскрипция белка или регуляция экспрессии другого гена. Ген может полностью состоять из нуклеиновых кислот, ответственных за кодирование функционального белка, или только частично из нуклеиновых кислот, ответственных за кодирование или экспрессию белка. Последовательность нуклеиновой кислоты может содержать генетическую аномальность в экзонах, интронах, областях инициации или терминации, промоторных последовательностях, других регуляторных последовательностях или уникальных смежных с геном областях.

Слово «метка» при применении здесь относится к соединению или композиции, конъюгированным или слитым непосредственно или опосредованно с реагентом, таким как нуклеиновая кислота - зонд или антитело, и облегчающим детекцию реагента, с которым они конъюгированы или слиты. Метка может являться детектируемой как таковая (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение состава субстрата или композиции, которое является детектируемым.

Термин «антитело» используют здесь в самом широком смысле и конкретно распространяют на интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), сформированные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антитела, пока они обладают желаемой биологической активностью.

«Фрагменты антитела» содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; димерные антитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антитела; и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антитела.

«Нативные антитела» обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины около 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как число дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулинов различно. Каждая тяжелая и легкая цепь обладает также регулярно расположенными дисульфидными мостиками внутри цепи. Каждая тяжелая цепь на одном конце содержит вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (V_L) на одном конце и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи соединен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи соединен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считают, что границу раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи формируют конкретные аминокислотные остатки.

Термин «вариабельный» означает тот факт, что конкретные части вариабельных доменов значительно отличаются по последовательности между антителами и используются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном. Однако вариабельность не распределена равномерно на всем протяжении вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех участках, называемых гипервариабельными или определяющими комплементарность областями в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высоко консервативные части вариабельных доменов называют каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов природных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в значительной степени принимающие конфигурацию β-листа, соединенные тремя гипервариабельными областями, формирующими соединяющие петли и в некоторых случаях формирующими часть структуры β-листа. Гипервариабельные области каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости к FR и, вместе с гипервариабельными областями из другой цепи, участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антитела (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

Расщеплением антитела папаином получают два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, названных «Fab»-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим участком, и оставшийся «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработкой пепсином получают F(ab')₂-фрагмент, обладающий двумя антигенсвязывающими участками и еще способный перекрестно связывать антиген.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный узнающий антиген и антигенсвязывающий участок. Данная область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в тесной, нековалентной связи. То есть в данной конфигурации три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий участок на поверхности димера V_H-V_L. Совместно, шесть гипервариабельных областей сообщают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже отдельный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных области, специфичные к антигену) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя с более низкой аффинностью, чем полный участок связывания.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на C-конце тяжелой цепи домена CH1, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH здесь обозначает Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. F(ab')₂-фрагменты антитела первоначально были получены как пары Fab'-фрагментов с шарнирными цистеинами между ними. Известны также другие химические присоединения фрагментов антитела.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) из любых видов позвоночных можно отнести к одному из двух четко различимых типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, антитела можно отнести к различным классам. Существует пять главных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно далее разделить на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам антител, обозначены α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структура субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антитела содержат V_H и V_L домены антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет scFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор scFv см. у Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин «димерные антитела» обозначает малые фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H - V_L). Применением линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание между двумя доменами в одной и той же цепи, домены вынуждают спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих участка. Димерные антитела более полно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Термин «моноклональное антитело», как применяют здесь, обозначает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, являясь направленными против одного антигенного участка. Кроме того, в отличие от общепринятых (поликлональных) препаратов антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против отдельной детерминанты антигена. Помимо их специфичности, моноклональные антитела являются предпочтительными тем, что их синтезируют в культуре гибридомы, не загрязненной другими иммуноглобулинами. Определение «моноклональное» указывает на характеристику антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует рассматривать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получить способом гибридомы, первоначально описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или можно получить способами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» можно выделить также из фаговых библиотек антител с применением способов, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела здесь конкретно включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остаток цепи (цепей) является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям антител, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, пока они обладают желаемой биологической активностью (патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, рассматриваемые здесь, включают «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные из не относящегося к человеку примата (например, обезьяны Старого Света, такой как бабуин, макак-резус или макак-крабоед), и последовательности константных областей человека (патент США № 5693780).

«Гуманизированные» формы не относящихся к человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку иммуноглобулина. Большей частью, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменяют остатками из гипервариабельной области не относящихся к человеку видов (антитело-донор), таких как мышь, крыса, кролик или не относящийся к человеку примат, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В ряде случаев, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не относящимися к человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не обнаруженные в антителе-рецепторе или антителе-доноре. Данные модификации выполнены для дальнейшего улучшения функционирования антитела. Вообще, гуманизированное антитело будет содержать в основном все или по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или в основном все гипервариабельные петли соответствуют петлям не относящегося к человеку иммуноглобулина, и все или в основном все FR являются FR с последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело, необязательно, также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно из иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности см. в Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Термин «гипервариабельная область» при применении здесь обозначает аминокислотные остатки антитела, ответственные за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или такие остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). «Каркасные» или «FR» остатки представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено здесь.

Антитело, «связывающее» интересующий антиген, представляет собой антитело, способное связывать этот антиген с достаточной аффинностью и/или авидностью, так что данное антитело является применимым в качестве терапевтического или диагностического средства для нацеливания на клетку, экспрессирующую антиген.

Для целей здесь, «иммунотерапия» будет обозначать способ лечения млекопитающего (предпочтительно, пациента - человека) антителом, где антитело может являться неконъюгированным или «голым» антителом или антитело может являться конъюгированным или слитым с гетерологичной молекулой (молекулами) или средством (средствами), такими как одно или несколько цитотоксических средств, таким образом, получая «иммуноконъюгат».

«Выделенное» антитело представляет собой то, которое идентифицировали и отделили или извлекли из его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой вещества, которые будут мешать диагностическим или терапевтическим применениям антагониста или антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворы. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будут очищать (1) до более чем 95% по массе антитела, как определяют способом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем до 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения аминокислотной последовательности по меньшей мере 15 остатков, с N-конца или внутренних, с использованием секвенатора с вращающейся чашей, или (3) до гомогенности в SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием окраски Кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, с тех пор как перестает присутствовать по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела. Однако обычно выделенное антитело будут получать посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

Выражение «эффективное количество» обозначает количество вещества (например, Apo2L/TRAIL, анти-DR4 или антитела к DR5 и т.д.), которое является эффективным для предупреждения, облегчения или лечения интересующего заболевания или состояния.

Термины «обработка», «лечение» и «терапия», как применяют здесь, обозначают излечивающую терапию, профилактическую терапию и предупреждающую терапию. Последовательное лечение или введение означает обработку по меньшей мере на ежесуточной основе без перерыва в обработке на одни или несколько суток. Периодическое лечение или введение, или лечение или введение периодическим образом, означает лечение, которое не является последовательным, однако достаточно циклично по характеру.

Термин «цитокин» представляет собой общий термин для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку как межклеточные медиаторы. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и общепринятые полипептидные гормоны. В число цитокинов включают гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионил гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухолей-α и -β; мюллерова ингибирующая субстанция; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; ингибин; активин, фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофаг-CSF (M-CSF); гранулоцит-макрофаг-CSF (GM-CSF) и гранулоцит-CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; и другие полипептидные факторы, включая LIF и лиганд kit (KL). Как применяют здесь, термин «цитокин» включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с природной последовательностью.

Термин «цитотоксическое средство», как применяют здесь, обозначает вещество, ингибирующее или предупреждающее функционирование клеток и/или вызывающее разрушение клеток. Термин предназначен, чтобы включать радиоактивные изотопы (например, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ и Re¹⁸⁶), химиотерапевтические средства и токсины, такие как ферментативно активные токсины из бактерий, грибов, растений или животных, или их фрагменты.

«Химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, используемое в лечении злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихимицин, особенно калихимицин гaммa1I и калихимицин фиI1, см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); динемицин, включая динемицин A; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеиновых энедииновых антибиотиков), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (Adriamycin™) (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функцию коры надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидaмол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гaцитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин (Gemzar®); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин (Navelbine™); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного. Также включены в данное определение антигормональные средства, которые действуют, чтобы регулировать или ингибировать действие гормона на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая Nolvadex™), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Fareston™); ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которая регулирует выработку эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, ацетат мегестрола (Megace™), экземестан, форместан, фадрозол, ворозол (Rivisor™), летрозол (Femara™) и анастрозол (Arimidex™); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически пригодные соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного.

«Ингибирующее рост средство» при применении здесь обозначает соединение или композицию, ингибирующее рост клетки, особенно раковой клетки, сверхэкспрессирующей любой из генов, названных здесь, или in vitro, или in vivo. Таким образом, ингибирующее рост средство представляет собой то, которое значительно уменьшает процент клеток, сверхэкспрессирующих эти гены, в S-фазе. Примеры ингибирующих рост средств включают средства, блокирующие прохождение клеточного цикла (в точке, отличной от S-фазы), такие как средства, индуцирующие Gl-арест и арест в M-фазе. Классические блокаторы M-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксол и ингибиторы топо II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те средства, которые блокируют G1, распространяются также на остановку S-фазы, например ДНК-алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и аrа-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно p.13.

Термины «апоптоз» и «апоптотическая активность» использованы в широком смысле и обозначают упорядоченную или контролируемую форму гибели клеток у млекопитающих, обычно сопровождающуюся одним или несколькими характерными изменениями клеток, включая конденсацию цитоплазмы, потерю микроворсинок плазматической мембраны, фрагментацию ядра, деградацию хромосомной ДНК или потерю митохондриальной функции. Данную активность можно определить и измерить, например, анализом жизнеспособности клеток (таким, как анализ Alamar blue или MTT), анализ FACS, по активации каспазы, по фрагментации ДНК (см., например, Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991)), и анализы расщепления поли-(АДФ-рибоза)полимеразы «PARP», известные в данной области.

Как применяют здесь, термин «нарушение» в общем относится к любому состоянию, которое будет улучшаться от лечения композициями, описанными здесь, включая любое заболевание или состояние, которое можно лечить эффективными количествами Apo2L/TRAIL или анти-DR4 антителом и/или анти-DR5 антителом. Он включает хронические и острые нарушения, так же как такие патологические состояния, которые провоцируют у млекопитающего интересующее нарушение. Нарушения, подлежащие лечению, здесь включают в качестве неограничивающих примеров доброкачественные и злокачественные опухоли; воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения, аутоиммунные нарушения, артрит (включая ревматоидный артрит), рассеянный склероз и HIV/СПИД.

Термины «злокачественная опухоль», «раковый» или «злокачественный» обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Злокачественные опухоли включают в качестве неограничивающих примеров карциному, лимфому, лейкоз, бластому и саркому. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают плоскоклеточную карциному, миелому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, глиому, гастроинтестинальный рак (желудочно-кишечного тракта), ренальный рак, рак яичника, рак печени, лимфобластный лейкоз, лимфолейкоз, рак кишечника, эндометриальный рак, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак поджелудочной железы, мультиформную глиому, рак шейки матки, рак мозга, рак желудка, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, карциному толстой кишки и рак головы и шеи.

Термин «связанное с иммунитетом заболевание» означает заболевание, при котором компонент иммунной системы вызывает, опосредует или иначе вносит вклад в заболеваемость млекопитающего. Также сюда включены заболевания, при которых стимуляция иммунного ответа или вмешательство в него оказывает облегчающий эффект на прогрессирование заболевания. В этот термин включены аутоиммунные заболевания, иммуноопосредованные воспалительные заболевания, неиммуноопосредованные воспалительные заболевания, инфекционные заболевания и иммунодефицитные заболевания. Примеры связанных с иммунитетом и воспалительных заболеваний, некоторые из которых являются иммунными или опосредованными T-клетками, которые можно лечить по настоящему изобретению, включают системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, спондилоартропатии, системный склероз (склеродермию), идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена, системный васкулит, саркоидоз, аутоиммунную гемолитическую анемию (иммунную панцитопению, пароксизмальную ночную гемоглобинурию), аутоиммунную тромбоцитопению (идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, иммуноопосредованную тромбоцитопению), тиреоидит (диффузный токсический зоб, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, иммуноопосредованное ренальное заболевание (гломерулонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит), демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, такие как рассеянный склероз, идиопатическая демиелинизирующая полиневропатия или синдром Гийена-Барре, хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, гепатобилиарные заболевания, такие как инфекционный гепатит (гепатит A, B, C, D, E и другие, негепатотропные, вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный биллиарный цирроз, гранулематозный гепатит и склерозирующий холангит, воспалительные и фиброзные заболевания легких, воспалительные заболевания кишечника (язвенный колит: болезнь Крона), глютензависимая энтеропатия и заболевание Уиппла, аутоиммунные или иммуноопосредованные заболевания кожи, включая буллезное кожное заболевание, полиморфную эритему и контактный дерматит, псориаз, аллергические заболевания, такие как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, гиперчувствительность к пище и уртикарию, иммунологические заболевания легких, такие как эозинофильные пневмонии, идиопатический фиброз легких и гиперчувствительный пневмонит, заболевания, связанные с трансплантацией, включая отторжение трансплантата и реакцию трансплантат против хозяина. Инфекционные заболевания включают СПИД (инфекцию HIV), гепатит A, B, C, D и E, бактериальную инфекцию, грибковую инфекцию, протозойную инфекцию и паразитарную инфекцию.

«Аутоиммунное заболевание» применяют здесь в широком, общем смысле для обозначения заболеваний или состояний у млекопитающих, при которых возникает разрушение нормальной или здоровой ткани из-за гуморального или клеточного иммунных ответов индивидуального млекопитающего на его или ее собственные компоненты ткани. Они включают в качестве неограничивающих примеров красную волчанку, тиреоидит, ревматоидный артрит, псориаз, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет и воспалительное заболевание кишечника (IBD).

Термин «меченый» при применении здесь обозначает химерную молекулу, содержащую антитело или полипептид, слитый с «полипептидом-меткой». Полипептид-метка содержит достаточно остатков, чтобы предоставить эпитоп, против которого можно получить антитело, или чтобы предоставить какую-либо другую функцию, такую как способность олигомеризоваться (например, как это происходит с пептидами, обладающими доменами лейциновых молний), однако является достаточно коротким, так что, как правило, не мешает активности антитела или полипептида. Полипептид-метка предпочтительно является достаточно уникальной, так что антитело, специфическое к метке, в основном не реагирует перекрестно с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки, как правило, обладают по меньшей мере шестью аминокислотными остатками, а обычно между приблизительно 8 и приблизительно 50 аминокислотными остатками (предпочтительно, между приблизительно 10 и приблизительно 20 остатками).

Термин «двухвалентный ион металла» обозначает ион металла, обладающий двумя положительными зарядами. Двухвалентные ионы металла включают в качестве неограничивающих примеров цинк, кобальт, никель, кадмий, магний и марганец. Конкретные формы таких металлов, которые можно использовать, включают формы соли (например, фармацевтически пригодные формы соли), такие как формы хлорида, ацетата, карбоната, цитрата и сульфата вышеупомянутых двухвалентных ионов металла. Двухвалентный ион металла для применения по настоящему изобретению, необязательно, представляет собой цинк и, предпочтительно, в форме соли, сульфата цинка или хлорида цинка.

«Выделенный» при применении для описания различных пептидов или белков, описанных здесь, означает пептид или белок, который идентифицировали и отделили и/или извлекли из компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой вещества, которые обычно будут мешать диагностическим или терапевтическим применениям пептида или белка, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворы. В предпочтительных вариантах осуществления пептид или белок будут очищать (1) до степени, достаточной для получения аминокислотной последовательности по меньшей мере 15 остатков, с N-конца или внутренних, с использованием секвенатора с вращающейся чашей, или (2) до гомогенности в SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием окраски Кумасси синим или, предпочтительно, серебром, или (3) до гомогенности по способам масс-спектроскопии или пептидного картирования. Выделенное вещество включает пептид или белок in situ внутри рекомбинантных клеток, с тех пор как перестает присутствовать по меньшей мере один компонент его естественного окружения. Однако, обычно, выделенный пептид или белок будут получать посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к последовательностям, указанным здесь, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, являющихся идентичными аминокислотным остаткам в контрольной последовательности после выравнивания последовательностей и введения пропусков, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, доступными специалистам в данной области, которые могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая задание алгоритмов, необходимых для достижения максимального выравнивания по полноразмерным сравниваемым последовательностям. Для целей здесь, значения процентной идентичности аминокислот можно получить с применением компьютерной программы для сравнения последовательностей, ALIGN-2, которая разработана Genentech, Inc. и исходный код которой был подан с пользовательской документацией в ведомство по охране авторских прав США, Washington, DC, 20559, зарегистрирован под № TXU510087 регистрации авторского права США. Программа ALIGN-2 публично доступна в Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не изменялись.

«Строгость» реакций гибридизации является легко определяемой обычным специалистом в данной области, как правило, эмпирическим вычислением, в зависимости от длины зонда, температуры отмывки и концентрации соли. Вообще, более длинные зонды требуют для правильного отжига более высоких температур, тогда как более короткие зонды требуют более низких температур. Гибридизация, в общем, зависит от способности денатурированной ДНК повторно гибридизироваться, когда комплементарные цепи присутствуют в среде при температуре ниже температуры их плавления. Чем выше степень желаемой идентичности между зондом и гибридизующейся последовательностью, тем выше относительная температура, которую можно использовать. В результате из этого следует, что более высокие относительные температуры имеют тенденцию делать условия реакции более строгими, в то время как более низкие температуры - менее строгими. Дополнительные подробности и объяснение строгости реакций гибридизации см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

«Условиями высокой строгости», как определено здесь, обозначают те, при которых: (1) применяют низкую ионную силу и высокую температуру для отмывки; 0,015 М хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) применяют денатурирующее средство во время гибридизации; 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фиколлом/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ буфером фосфатом натрия при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) применяют 50% формамид, 5 × SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 × раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстран сульфат при 42°C, с промывками при 42°C в 0,2 × SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C, с последующей промывкой высокой строгости, состоящей из 0,1 × SSC, содержащего EDTA, при 55°C.

«Умеренно строгие условия» могут быть обозначены так, как описано у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и включают инкубацию в течение ночи при 37°C в растворе, содержащем: 20% формамид, 5 × SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ трицитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5 × раствор Денхардта, 10% декстран сульфат и 20 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося с последующей промывкой фильтров в 1 × SSC при приблизительно 37-50°C. Специалисту в данной области будет понятно, как отрегулировать температуру, ионную силу и т.д., по мере необходимости, чтобы приспособить к таким факторам, как длина зонда и т.п.

Термин «праймер» или «праймеры» означает олигонуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с комплементарным полинуклеотидом РНК или ДНК-мишенью и служат исходными точками для ступенчатого синтеза полинуклеотида из мононуклеотидов посредством действия нуклеотидилтрансферазы, как происходит, например, при полимеразной цепной реакции.

Термин «контрольные последовательности» обозначает последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контрольные последовательности, подходящие, например, для прокариот, включают промотор, необязательно, последовательность оператора и участок связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда ее приводят в функциональное взаимодействие с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера является функционально связанной с ДНК для полипептида, если он экспрессируется как пребелок, участвующий в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы способствовать трансляции. В общем, «функционально связанные» означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторного лидера, непрерывными и в фазе считывания. Однако энхансеры не должны являться непрерывными. Связывание осуществляют лигированием по подходящим участкам рестрикции. Если таких участков не существует, используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

«Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и «ADCC» обозначает клеточно-опосредованную реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, клетки - натуральные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), узнают связавшееся антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на стр.464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Чтобы оценивать активность интересующей молекулы в ADCC, можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как описан в патенте США № 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и клетки - натуральные киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, активность интересующей молекулы в ADCC можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, такой как описана в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют функцию эффектора ADCC. Примеры лейкоцитов человека, опосредующих ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), клетки - натуральные киллеры (NK), моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы; где PBMC и NK-клетки являются предпочтительными.

Термины «Fc-рецептор» или «FcR» применяют для описания рецептора, связывающегося с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с природной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является такой, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), обладающие сходными аминокислотными последовательностями, которые различаются главным образом в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в цитоплазматическом домене активирующий мотив иммунoрецептора (ITAM) на основе тирозина. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в цитоплазматическом домене ингибирующий мотив иммунoрецептора (ITIM) на основе тирозина (см. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор FcR дан в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Термин «FcR» здесь охватывает другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем. Термин включает также неонатальный рецептор, FcRn, ответственный за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). FcR здесь включают полиморфизмы, такие как генетический диморфизм в гене, кодирующем FcγRIIIa, приводящий к фенилаланину (F) или валину (V) в положении аминокислоты 158, локализованной в области рецептора, связывающейся с IgG1. Показано, что гомозиготный по валину FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V) обладает более высокой аффинностью для IgGl человека и способствует увеличенной ADCC in vitro по сравнению с гомозиготным по фенилаланину FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) или гетерозиготным (FcγRIIIa-158F/V) рецепторами.

«Комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» означает способность молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образовывающей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

II. ТИПИЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

Методы и анализы, описанные здесь, направлены на исследование экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце ткани или клеток млекопитающего, где определение такой экспрессии одного или нескольких таких биомаркеров является показателем того, будет ли образец ткани или клеток чувствительным к апоптоз-индуцирующим средствам, таким как Apo2L/TRAIL и антитела-агонисты анти-DR5. Способы и анализы включают исследующие экспрессию биомаркеров, таких как конкретные фукозилтрансферазы, в частности фукозилтрансфераза 3 (FUT3) и/или фукозилтрансфераза 6 (FUT6), так же как антигены сиалил-Льюис A и/или X.

Как обсуждали выше, существуют некоторые популяции пораженных заболеванием типов клеток человека (такие, как конкретные популяции раковых клеток), являющиеся устойчивыми к индукции апоптоза. Поэтому полагают, что описанные способы и анализы могут предоставить подходящие, эффективные и потенциально экономически выгодные способы получения данных и информации, применимых для определения подходящей или эффективной терапии для лечения пациентов. Например, пациенту, для которого диагностировали рак или связанное с иммунитетом состояние, можно провести биопсию для получения образца ткани или клеток и образец можно исследовать путем различных анализов in vitro, чтобы определить, будут ли клетки пациента чувствительными к лекарственному средству, такому как Apo2L/TRAIL или антитело к рецептору смерти.

Изобретение относится к способам для предсказания чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего (такого, как раковая клетка) к Apo2L/TRAIL или к антителу-агонисту рецептора смерти. В этих способах получают образец ткани или клеток млекопитающего и исследуют по экспрессии одного или нескольких биомаркеров. Способы можно осуществлять во множестве форматов анализа, включая анализы, детектирующие экспрессию мРНК, ферментативные анализы, детектирующие присутствие ферментативной активности, и иммуногистохимические анализы. Определение экспрессии таких биомаркеров в указанных тканях или клетках будет предсказывать, что такие ткани или клетки будут чувствительными к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL и/или антитела к рецептору смерти. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что экспрессия данных конкретных биомаркеров коррелирует с чувствительностью таких тканей и клеток к апоптоз-индуцирующим средствам, таким как Apo2L/TRAIL и антитела-агонисты рецептора смерти.

Как обсуждают ниже, экспрессию различных биомаркеров в образце можно анализировать посредством ряда методологий, многие из которых известны в данной области и понятны специалисту, включая в качестве неограничивающих примеров иммуногистохимический и/или Вестерн-анализы, количественные анализы крови (как, например, ELISA сыворотки) (для исследования, например, уровней экспрессии белка), биохимические анализы ферментативной активности, гибридизацию in situ, Нозерн-анализ и/или анилиз ПЦР мРНК и геномный анализ по Саузерну (для исследования, например, делеции или амплификации гена), так же как любой из широкого множества анализов, которые можно проводить посредством анализа гена и/или ткани на биочипе. Типичные протоколы для определения состояния генов и продуктов генов найдены, например, в Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (ПЦР Analysis).

Протоколы ниже, относящиеся к детекции в образце конкретных биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3 (FUT3), фукозилтрансфераза 6 (FUT6), сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X, приведены ниже в целях иллюстрации.

Необязательные способы по изобретению включают протоколы для исследования или тестирования присутствия белков сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X в образце ткани или клеток млекопитающего. Можно применять и включать множество способов детекции белков, родственных сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X, например иммуногистохимический анализ, иммунопреципитацию, анализ Вестерн-блоттингом, анализы молекулярного связывания, ELISA, ELIFA, флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) и т.п. Например, необязательный способ детекции экспрессии белка, родственного сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X в ткани или образце, включает приведение образца в контакт с антителом к сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X, с его фрагментом, реагирующим с сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X, или с рекомбинантным белком, содержащим антигенсвязывающую область антитела к сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X; и затем детекцию в образце связывания белка, родственного сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X.

В конкретных вариантах осуществления по изобретению экспрессию в образце белков сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X исследовали с применением протоколов иммуногистохимии и окрашивания. Показано, что иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани является надежным способом оценки или детекции присутствия белков в образце. В способах иммуногистохимии («IHC») используют антитело в качестве зонда и для визуализации клеточных антигенов in situ, как правило, хромогенными или флуоресцентными способами.

Для получения образца можно использовать образец ткани или клеток млекопитающего (обычно пациента-человека). Образцы включают в качестве неограничивающих примеров клетки злокачественной опухоли, такие как раковые клетки толстой кишки, молочной железы, предстательной железы, яичника, легкого, желудка, поджелудочной железы, лимфомы и лейкоза. Образец можно получить множеством способов, известных в данной области, включающих в качестве неограничивающих примеров хирургическое иссечение, аспирацию или биопсию. Ткань может являться свежей или замороженной. В одном из вариантов осуществления образец является фиксированным и заключенным в парафин или подобным.

Образец ткани можно фиксировать (т.е. сохранять) посредством общепринятой методологии (см., например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3^rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, DC). Специалист в данной области будет признавать, что выбор фиксатора определяется целью, для которой образец следует гистологически окрашивать или иным образом анализировать. Специалист в данной области будет также принимать во внимание, что длительность фиксации зависит от размера образца ткани и используемого фиксатора. В качестве примера для фиксации образца можно использовать нейтральный забуференный формалин, Боуин или параформальдегид.

В общем, образец сначала фиксируют и затем дегидратируют сериями спиртов повышающейся концентрации, пропитывают и затапливают парафином или другой средой для срезов, так что можно получить срезы образца ткани. Альтернативно, можно нарезать ткань и фиксировать полученные срезы. В качестве примера, образец ткани можно заключать в парафин и обрабатывать в нем посредством общепринятой методологии (см., например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", выше). Парафин, который можно использовать, включает в качестве неограничивающих примеров парапласт, бролоид и Tissuemay. После заключения образца ткани образец можно нарезать на микротоме или подобном (см., например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", выше). В качестве примера, для данного способа толщина срезов может лежать в диапазоне от приблизительно трех микрон до приблизительно пяти микрон. После нарезки срезы можно прикреплять к стеклам несколькими стандартными способами. Адгезивные вещества включают в качестве неограничивающих примеров силан, желатин, поли-L-лизин и т.п. В качестве примера, заключенные в парафин срезы можно прикреплять к положительно заряженным стеклам и/или стеклам, покрытым поли-L-лизином.

Если в качестве заключающего материала используют парафин, срезы ткани, как правило, депарафинизируют и регидратируют в воде. Срезы ткани можно депарафинизировать посредством нескольких общепринятых стандартных методологий. Например, можно применять ксилолы и серии спиртов с постепенно уменьшающейся концентрацией (см., например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology",' выше). Альтернативно, можно использовать коммерчески доступные депарафинизирующие неорганические средства, такие как Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).

Необязательно, после получения образцов, срез ткани можно анализировать IHC. IHC можно проводить в сочетании с дополнительными способами, такими как морфологическое окрашивание и/или флуоресцентная гибридизация in situ. Доступны два основных способа IHC; прямой или непрямой анализы. В первом анализе связывание антитела с антигеном-мишенью (например, сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X) определяют непосредственно. В прямом анализе используют меченый реагент, такой как первичное антитело, меченное флуоресцентной меткой или ферментом, которое можно визуализировать без взаимодействия с дополнительным антителом. В типичном непрямом анализе неконъюгированное первичное антитело связывается с антигеном, и затем меченное вторичное антитело связывается с первым антителом. Где вторичное антитело является конъюгированным с ферментативной меткой, для обеспечения визуализации антигена добавляют хромогенный или флуорогенный субстрат. Происходит усиление сигнала, поскольку несколько вторичных антител могут реагировать с различными эпитопами первичного антитела.

Первичное и/или вторичное антитело, применяемое для иммуногистохимии, обычно будет меченным детектируемой группой. Доступно множество меток, которые можно в основном сгруппировать по следующим категориям.

(a) Радиоактивные изотопы, такие как ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H и ¹³¹I. Антитело можно метить радиоактивным изотопом с использованием способов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991), и радиоактивность можно измерять с использованием сцинтилляционного счета.

(b) Частицы коллоидного золота.

(c) Флуоресцентные метки, включающие в качестве неограничивающих примеров хелаты редкоземельных элементов (хелаты европия), Texas Red, родамин, флюоресцеин, дансил, лиссамин, умбеллиферон, фикокритерин, фикоцианин или коммерчески доступные флуорофоры, такие как SPECTRUM ORANGE7 и SPECTRUM GREEN7 и/или производные одного или нескольких из вышеуказанных. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителом с использованием способов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, выше. Флуоресценцию можно определять количественно с использованием флуорометра.

(d) Различные метки - субстраты для ферментов являются доступными, и обзор некоторых из них приведен в патенте США № 4275149. Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно измерять с использованием различных способов. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно измерять спектрофотометрически. Альтернативно, фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Способы количественной оценки измерения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат приобретает электронное возбуждение из-за химической реакции и может затем испускать свет, который можно измерять (например, с использованием хемилюминометра), или является донором энергии для флуоресцентного акцептора. Примеры ферментативных меток включают люциферазы (например, люциферазу светляка и бактериальную люциферазу; патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахарид-оксидазы (например, глюкозооксидазу, галактозоксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие, как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Способы конъюгации ферментов с антителами описаны в O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981).

Примеры сочетаний фермент-субстрат включают, например:

(i) пероксидазу хрена (HRPO) с перекисью водорода в качестве субстрата, где перекись водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (OPD) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидин гидрохлорид (TMB));

(ii) щелочную фосфатазу (AP) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата; и

(iii) β-D-галактозидазу (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, p-нитрофенил-β-D-галактозидазой) или флуорогенным субстратом (например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидазой).

Специалистам в данной области доступны другие сочетания фермент-субстрат. Их общий обзор см. в патентах США № 4275149 и 4318980. Иногда метку не напрямую конъюгируют с антителом. Различные способы достижения этого будут известны опытному специалисту в данной области. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, а любую из упомянутых выше четырех широких категорий меток можно конъюгировать с авидином и наоборот. Биотин избирательно связывает авидин, и так метку можно конъюгировать с антителом данным непрямым образом. Альтернативно, для достижения непрямой конъюгации метки с антителом антитело конъюгируют с малым гаптеном, и одну из различных упомянутых выше типов меток конъюгируют с антигаптеновым антителом. Таким образом можно достичь непрямой конъюгации метки с антителом.

Кроме обсуждаемых выше способов получения образца, может являться желательной дополнительная обработка среза ткани перед, во время или после IHC. Например, можно осуществлять способы демаскировки эпитопов, такие как нагревание образца ткани в цитратном буфере (см., например, Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).

После необязательной стадии блокирования срез ткани подвергают воздействию первичного антитела в течение достаточного периода времени и в подходящих условиях, так что первичное антитело связывает белковый антиген-мишень в образце ткани. Подходящие условия для достижения этого можно определить общепринятыми экспериментами. Степень связывания антитела с образцом определяют с использованием любой из детектируемых меток, обсуждаемых выше. Предпочтительно, метка представляет собой ферментативную метку (например, HRPO), катализирующую химическое изменение хромогенного субстрата, такого как 3,3'-диаминобензидиновый хромоген. Предпочтительно, ферментативную метку конъюгируют с антителом, специфически связывающимся с первичным антителом (например, первичное антитело представляет собой поликлональное антитело кролика, а вторичное антитело представляет собой антитело козы против антител кролика).

Необязательно, антитела, применяемые в анализе IHC для детекции экспрессии сиалил-Льюис A или анти-сиалил-Льюис X, представляют собой анти-сиалил-Льюис A и анти-сиалил-Льюис X антитела соответственно. Необязательно, анти-сиалил-Льюис A и анти-сиалил-Льюис X антитело представляет собой моноклональное антитело. Анти-сиалил-Льюис A и анти-сиалил-Льюис X антитела легко доступны в данной области, в том числе из различных коммерческих источников.

Препараты, полученные таким образом, можно закреплять и заклеивать покровным стеклом. Затем стекло оценивают, например, с использованием микроскопа, и можно применять критерии интенсивности окрашивания, общепринятые в данной области. Где антиген представляет собой белок сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X, критерии интенсивности окрашивания можно определять следующим образом:

Таблица 1 Характер окрашивания Балл Не обнаружено окрашивания в клетках 0 Слабое/едва заметное окрашивание обнаружено в более чем 10% клеток 1+ Окрашивание, от слабого до умеренного, обнаружено в более чем 10% клеток 2+ Окрашивание, от умеренного до сильного, обнаружено в более чем 10% клеток 3+

Обычно считают, что балл характера окрашивания приблизительно 2+ или выше в таком анализе IHC является прогностическим или указывающим на чувствительность клетки млекопитающего (такой, как раковая клетка млекопитающего) к Apo2L/TRAIL или антителу-агонисту рецептора смерти.

В альтернативных способах образец можно приводить в контакт с антителом, специфическим для указанного биомаркера в условиях, подходящих для формирования комплекса антитело-биомаркер, и затем детектировать указанный комплекс. Присутствие биомаркера можно оценивать рядом способов, таких как способы Вестерн-блоттинга и ELISA для анализа широкого ряда тканей и образцов, включая плазму или сыворотки. Доступен широкий ряд способов иммуноанализа с использованием такого формата анализа, см., например, патенты США № 4016043, 4424279 и 4018653. Они включают как одновалентный, так и двухвалентный, или «сэндвич», анализы неконкурентного типа, так же как традиционные конкурентные анализы связывания. Эти анализы включают также прямое связывание меченого антитела с биомаркером-мишенью.

Сэндвич-анализы являются одними из самых полезных и широко используемых анализов. Существует множество вариантов способа сэндвич-анализа, и все они предназначены, чтобы быть охваченными настоящим изобретением. Коротко, в типичном прямом анализе немеченое антитело иммобилизуют на твердой подложке и образец, подлежащий тестированию, приводят в контакт со связанной молекулой. После соответствующего периода инкубации, в течение периода времени, достаточного, чтобы позволить формирование комплекса антитело-антиген, затем добавляют второе антитело, специфичное к антигену, меченное репортерной молекулой, способной давать детектируемый сигнал, и инкубируют, предоставляя достаточное время для формирования другого комплекса антитело-антиген-меченое антитело. Любые непрореагировавшие вещества отмывают и присутствие антигена определяют по обнаружению сигнала, производимого репортерной молекулой. Результаты могут являться качественными, по простому наблюдению видимого сигнала, или их можно оценить количественно по сравнению с контрольным образцом, содержащим известные количества биомаркера.

Варианты прямого анализа включают одновременный анализ, в котором и образец, и меченое антитело добавляют одновременно к связанному антителу. Данные способы хорошо известны специалистам в данной области, включая любые незначительные изменения, как будет сразу очевидно. В типичном прямом сэндвич-анализе первое антитело, обладающее специфичностью для биомаркера, является ковалентно или пассивно связанным с твердой поверхностью. Твердая поверхность обычно представляет собой стекло или полимер, где наиболее часто используемыми полимерами являются целлюлоза, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен. Твердые подложки могут иметь форму пробирок, бусин, дисков или микропланшетов или любой другой поверхности, подходящей для проведения иммуноанализа. Способы связывания хорошо известны в данной области и в основном состоят из перекрестносшивающего ковалентного связывания или физической адсорбции, комплекс полимер-антитело промывают при подготовке для тестового образца. Затем к твердофазному комплексу добавляют аликвоту тестируемого образца и инкубируют в течение достаточного периода времени (например, 2-40 минут или в течение ночи, если удобнее) и в подходящих условиях (например, от комнатной температуры до 40°C, например, между 25°C и 32°C, включительно), чтобы позволить связывание с любой субъединицей, присутствующей в антителе. После периода инкубации твердую фазу с субъединицей антитела промывают, высушивают и инкубируют со вторым антителом, специфичным к части биомаркера. Второе антитело связано с репортерной молекулой, которую используют, чтобы показать связывание второго антитела с молекулярным маркером.

Альтернативный способ включает иммобилизацию биомаркеров-мишеней в образце и затем воздействие на иммобилизованную мишень специфическим антителом, которое может являться или не являться меченным репортерной молекулой. В зависимости от количества мишени и силы сигнала репортерной молекулы, может являться возможным детектировать связанную мишень прямым мечением антителом. Альтернативно, комплекс мишень-первое антитело подвергают действию второго меченого антитела, специфичного к первому антителу, для формирования тройного комплекса мишень-первое антитело-второе антитело. Комплекс детектируют по сигналу, испускаемому репортерной молекулой. Под «репортерной молекулой», как применяют в настоящем описании, понимают молекулу, которая, по своей химической природе, предоставляет сигнал, который можно аналитически идентифицировать, позволяющий детекцию связанного с антигеном антитела. Наиболее часто используемыми репортерными молекулами для данного типа анализа являются ферменты, флуорофоры или молекулы, содержащие радионуклиды (т.е. радиоактивные изотопы), и хемилюминесцентные молекулы.

В случае ферментативного иммуноанализа фермент конъюгируют со вторым антителом, обычно с использованием глутаральдегида или периодата. Как легко будет понятно, однако существует широкое множество различных способов конъюгации, легко доступных специалисту в данной области. Общеупотребительные ферменты включают, среди прочих, пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, β-галактозидазу и щелочную фосфатазу. Для использования с конкретными ферментами обычно выбирают субстраты для получения после гидролиза соответствующим ферментом детектируемого изменения цвета. Примеры подходящих ферментов включают щелочную фосфатазу и пероксидазу. Вместо указанных выше хромогенных субстратов можно также применять флуорогенные субстраты, дающие флуоресцентный продукт. Во всех случаях меченное ферментом антитело добавляют к комплексу первое антитело-молекулярный маркер, позволяют связаться и отмывают избыточный реагент. Затем к комплексу антитело-антиген-антитело добавляют раствор, содержащий подходящий субстрат. Субстрат будет реагировать с ферментом, связанным со вторым антителом, что дает качественный видимый сигнал, который можно далее оценить количественно, обычно спектрофотометрически, чтобы получить представление о количестве биомаркера, присутствующего в образце. Альтернативно, флуоресцентные соединения, такие как флюоресцеин и родамин, можно химически присоединять к антителам без изменения их связывающей способности. При активации облучением светом с определенной длиной волны меченное флуорохромом антитело поглощает энергию света с индукцией состояния возбуждения в молекуле, сопровождаемого излучением света характерного цвета, который можно визуально детектировать световым микроскопом. Как и в EIA, флуоресцентно меченному антителу позволяют связываться с комплексом антитело-молекулярный маркер. После отмывки несвязавшегося реагента оставшийся тройной комплекс затем подвергают воздействию света подходящей длины волны, наблюдаемая флуоресценция указывает на присутствие интересующего молекулярного маркера. Способы иммунoфлуоресценции и EIA оба являются общепринятыми в данной области. Однако можно применять также другие репортерные молекулы, такие как радиоизотопные, хемилюминесцентные или биолюминесцентные молекулы.

Предполагают, что вышеописанные способы можно применять также для детекции экспрессии полипептидов FUT3 или FUT 6.

Способы по настоящему изобретению дополнительно включают протоколы для исследования присутствия и/или экспрессии мРНК, таких как мРНК FUT3 и/или FUT6, в образце ткани или клеток. Способы для исследования мРНК в клетках хорошо известны и включают, например, анализы гибридизации с использованием зондов комплементарной ДНК (такие, как гибридизация in situ с использованием меченых рибопроб FUT3 и/или FUT6, Нозерн-блоттинг и родственные способы) и различные анализы амплификации нуклеиновых кислот (такие, как RT-ПЦР с использованием комплементарных праймеров, специфических для FUT3 и/или FUT6, и другие способы детекции амплификационного типа, такие как, например, разветвление ДНК, SISBA, TMA и т.п.).

Образец ткани или клеток от млекопитающих можно удобно анализировать, например, по мРНК FUT3 и/или FUT6 с использованием Нозерн-, дот-блот- или ПЦР-анализов. Например, анализы RT-ПЦР, такие как количественные анализы ПЦР, хорошо известны в данной области. В иллюстративном варианте осуществления по изобретению способ детекции мРНК FUT3 и/или FUT6 в биологическом образце включает получение кДНК из образца обратной транскрипцией с использованием по меньшей мере одного праймера; амплификацию полученной таким образом кДНК с использованием полинуклеотида FUT3 и/или FUT6 в качестве смыслового и антисмыслового праймеров для амплификации там кДНК FUT3 и/или FUT6; и детекцию присутствия амплифицированной кДНК FUT3 и/или FUT6. Кроме того, такие способы могут включать одну или несколько стадий, позволяющих определять уровни мРНК FUT3 и/или FUT6 в биологическом образце (например, посредством одновременного исследования уровней сравнительной контрольной последовательности мРНК гена «домашнего хозяйства», такого как член семейства актина). Необязательно, можно определить последовательность амплифицированной кДНК FUT3 и/или FUT6.

Материалы для вариантов осуществления данного изобретения включают праймеры и пары праймеров FUT3 и/или FUT6, позволяющие специфическую амплификацию полинуклеотидов по настоящему изобретению или любой их части, и зонды, избирательно или специфически гибридизующиеся с молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению или с любой их частью. Зонды можно метить детектируемой меткой, например, такой как радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент. Такие зонды и праймеры можно применять для детекции присутствия полинуклеотидов FUT3 и/или FUT6 в образце и в качестве средств для детекции клетки, экспрессирующей белки FUT3 и/или FUT6. Как будет понятно специалисту в данной области, на основе приведенных здесь последовательностей можно получить большое количество различных праймеров и зондов и эффективно применять для амплификации, клонирования и/или определения присутствия и/или уровней мРНК FUT3 и/или FUT6.

Необязательные способы по изобретению включают протоколы для исследования или детекции мРНК, таких как мРНК FUT3 и FUT6 или мРНК других фукозилтрансфераз, в образце ткани или клеток способами микрочипов. При использовании микрочипов с нуклеиновой кислотой образцы тестовой и контрольной мРНК из тестового и контрольного образцов ткани подвергают обратной транскрипции и мечению для получения зондов кДНК. Затем зонды гибридизуют с массивом нуклеиновых кислот, иммобилизованных на твердой подложке. Массив конфигурируют так, что известны последовательность и положение каждого члена массива. Например, на твердой подложке можно получить массив подборки генов, обладающих способностью экспрессироваться при конкретных состояниях заболевания. Гибридизация меченого зонда с конкретным членом массива указывает, что образец, из которого получен зонд, экспрессирует данный ген. Анализом дифференциальной экспрессии генов в пораженных заболеванием тканях можно получить ценную информацию. В способе микрочипов используют способы гибридизации нуклеиновой кислоты и компьютерные способы для оценки профиля экспрессии мРНК тысяч генов в одном эксперименте (см., например, WO 01/75166, опубликованную 11 октября 2001 г.; (см., например, обсуждение изготовления чипов в патенте США 5700637, патенте США 5445934 и патенте США 5807522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21 (Suppl):15-19 (1999)). Микрочипы ДНК представляют собой миниатюрные массивы, содержащие фрагменты генов, или синтезированных непосредственно, или раскапанных на стекле или других подложках. В одном массиве обычно представлены тысячи генов. Типичный эксперимент с микрочипом включает следующие стадии: 1. получение флуоресцентно меченной мишени из РНК, выделенной из образца, 2. гибридизация меченой мишени с микрочипом, 3. промывка, окрашивание и сканирование массива, 4. анализ сканированного изображения и 5. получение профилей экспрессии гена. В настоящее время используют два основных типа ДНК-микрочипов: массивы олигонуклеотидов (обычно от 25 до 70 меров) и массивы для изучения экспрессии генов, содержащие продукты ПЦР, полученные из кДНК. При формировании массива олигонуклеотиды можно или изготовить заранее и раскапать на поверхности, или синтезировать непосредственно на поверхности (in situ).

Система Affymetrix GeneChip® представляет собой коммерчески доступную систему микрочипов, содержащую массивы, изготовленные прямым синтезом олигонуклеотидов на поверхности стекла. Чипы с зондами/генами: олигонуклеотиды, обычно 25-членники, синтезируют непосредственно на стеклянной пластине сочетанием способов основанной на полупроводниках фотолитографии и твердофазного химического синтеза. Каждый массив содержит вплоть до 400000 различных олигонуклеотидов, и каждый олигонуклеотид присутствует в миллионах копий. Поскольку олигонуклеотидные зонды синтезированы в известных положениях чипа, картины гибридизации и интенсивности сигнала можно интерпретировать в отношении идентичности генов и относительных уровней экспрессии посредством программного обеспечения Affymetrix Microarray Suite. Каждый ген представлен на чипе серией различных олигонуклеотидных зондов. Каждая пара зондов состоит из точно совпадающего олигонуклеотида и олигонуклеотида с несоответствиями. Точно совпадающий зонд обладает последовательностью, точно комплементарной конкретному гену, и таким образом служит для измерения экспрессии гена. Зонд с несоответствиями отличается от точно совпадающего зонда заменой одного основания в центральном положении, мешая связыванию транскрипта гена-мишени. Это помогает определить фоновую и неспецифическую гибридизацию, вносящую вклад в сигнал, измеряемый для точно совпадающего олигонуклеотида. Программное обеспечение Microarray Suite вычитает интенсивности гибридизации зондов с несоответствиями из интенсивностей гибридизации точно совпадающих зондов для определения значения абсолютной или специфической интенсивности для каждого набора зондов. Зонды выбраны на основе современной информации из Genbank и других баз данных по нуклеотидам. Считают, что последовательности узнают уникальные области на 3'-конце гена. Для проведения гибридизации вплоть до 64 чипов одновременно используют гибридизационную печь GeneChip (печь «с вертелом»). Промывку и окрашивание чипов с зондами проводят в системе для автоматической работы с жидкостями. Она является полностью автоматизированной и содержит четыре модуля, где каждый из модулей удерживает один чип с зондами. Каждый модуль контролируют независимо посредством программного обеспечения Microarray Suite с использованием предварительно запрограммированных протоколов протекания жидкости. Сканер представляет собой конфокальный флуоресцентный сканер, измеряющий интенсивность флуоресценции, испускаемой меченой кРНК, связавшейся с массивом зондов. Компьютерная рабочая станция контролирует систему для автоматической работы с жидкостями и сканер. Программное обеспечение Microarray Suite может контролировать вплоть до восьми систем для автоматической работы с жидкостями с применением предварительно запрограммированных протоколов гибридизации, отмывки и окрашивания чипа с зондами. Программное обеспечение также собирает данные по интенсивности гибридизации и конвертирует в сигнал присутствия/отсутствия для каждого гена с использованием подходящих алгоритмов. Наконец, программное обеспечение детектирует изменения в экспрессии генов между экспериментами посредством сравнительного анализа и форматирует выход в файлы с расширением.txt, которые можно использовать в другом программном обеспечении для дальнейшего анализа данных.

Экспрессию выбранного биомаркера можно оценивать также исследованием делеции гена или амплификации гена. Делецию или амплификацию гена можно измерять любым из большого разнообразия протоколов, известных в данной области, например общепринятым блоттингом по Саузерну, Нозерн-блоттингом для количественной оценки транскрипции мРНК (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), дот-блоттингом (анализ ДНК) или гибридизацией in situ (например, FISH) с использованием подходящего меченого зонда, цитогенетическими способами или способами сравнительной геномной гибридизации (CGH) с использованием подходящего меченого зонда. В качестве примера, данные способы можно применять для детекции делеции или амплификации генов FUT3 и/или FUT6.

Кроме того, можно исследовать статус метилирования биомаркера, такого как ген FUT3 и/или FUT6, в образце ткани или клеток. Аберрантное деметилирование и/или гиперметилирование CpG-островков в 5'-регуляторных областях генов часто происходит в иммортализованных и трансформированных клетках и может приводить к измененной экспрессии различных генов. Множество анализов для исследования статуса метилирования хорошо известны в данной области. Например, в способах гибридизации по Саузерну для оценки статуса метилирования CpG-островков можно использовать чувствительные к метилированию ферменты рестрикции, которые не могут расщеплять последовательности, содержащие метилированные CpG-участки. Кроме того, MSP (метил-специфической ПЦР) можно быстро получить профиль статуса метилирования всех CpG-участков, присутствующих в CpG-островке данного гена. Способ включает исходную модификацию ДНК бисульфитом натрия (который переводит все неметилированные цитозины в урацил) с последующей амплификацией с использованием праймеров, специфических для метилированной, в отличие от неметилированной, ДНК. Протоколы, вовлекающие влияние метилирования, можно также найти, например, в Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995; De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6):1985-1992 (1999); Brooks et al, Cancer Epidemiol. Биомаркеры Prev., 1998, 7:531-536; и Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6):903-908 (1998).

Экспрессию выбранного биомаркера в образце ткани или клеток можно исследовать также посредством функциональных анализов или анализов активности. Например, если биомаркер представляет собой фермент, можно проводить известные в данной области анализы для определения данной ферментативной активности в образце ткани или клеток.

Предполагают, что в способах по настоящему изобретению в образце ткани или клеток можно исследовать в образце также экспрессию Apo2L/TRAIL или рецепторов, связывающих Apo2L/TRAIL, или антитела к рецептору смерти. Как описано выше и в данной области, в настоящее время полагают, что Apo2L/TRAIL связывается по меньшей мере с пятью различными рецепторами: DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG. С применением способов, известных в данной области, включая описанные здесь, экспрессию Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2 и/или OPG можно детектировать на уровне мРНК и на уровне белка. Как показано на фиг.10 и 11, данные позволяют предполагать, что исследованием экспрессии рецепторов DcR1 и/или DcR2 в образце ткани или клеток можно получить дополнительную информацию относительно того, будет ли образец ткани или клеток чувствительным к Apo2L/TRAIL или антителу к рецептору смерти. В качестве примера, способы IHC, описанные выше, можно применять для детекции присутствия одной или нескольких таких молекул в образце. Предполагают, что в способах, в которых в ткани или образце исследуют не только присутствие маркера FUT или антигена Льюиса, но также присутствие, например, DR4, DR5 или DcR1, для одной и той же ткани или образца можно получить отдельные стекла и тестировать каждое стекло реагентом, специфическим для каждого конкретного биомаркера или рецептора. Альтернативно, для образца ткани или клеток можно получить одно стекло, и антитела, направленные против каждого биомаркера или рецептора, можно применять по протоколу многоцветного окрашивания, что позволяет визуализацию и детекцию соответствующих биомаркеров или рецепторов.

После определения, что в образце ткани или клеток экспрессирован один или несколько из биомаркеров, показывающих, что образец ткани или клеток будет чувствительным к Apo2L/TRAIL или антителу к рецептору смерти, предполагают, что эффективное количество Apo2L/TRAIL или антитела к рецептору смерти можно вводить млекопитающему для лечения расстройства, такого как рак или связанного с иммунитетом расстройства, поражающего млекопитающее. Опытный практикующий специалист может поставить у млекопитающих диагноз различных патологических состояний, описанных здесь. В данной области доступны способы диагностики, позволяющие, например, диагностику или детекцию рака или связаннного с иммунитетом заболевания у млекопитающего. Например, раки можно идентифицировать посредством способов, включающих в качестве неограничивающих примеров пальпацию, анализ крови, рентген, NMR и т.п. Связанные с иммунитетом заболевания также можно легко идентифицировать.

Apo2L/TRAIL или антитело к рецептору смерти можно вводить в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в форме болюса или непрерывное вливание в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутриспинномозговым, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным способами. Необязательно, введение можно проводить посредством вливания через мининасос с использованием различных коммерчески доступных устройств.

Эффективные дозы и расписания для введения Apo2L/TRAIL или антитела к рецептору смерти можно определить эмпирически, и проведение таких определений в компетенции специалистов в данной области. Можно применять однократные или множественные дозы. В настоящее время считают, что эффективная доза или количество Apo2L/TRAIL, применяемого самостоятельно, может лежать в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела или более в сутки. Межвидовое масштабирование дозировки можно провести способом, известным в данной области, например, как описано в Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991).

Когда применяют введение Apo2L/TRAIL in vivo, нормальные величины дозирования могут варьировать от приблизительно 10 нг/кг вплоть до 100 мг/кг массы тела млекопитающего или более в сутки, предпочтительно приблизительно 1 мкг/кг/сутки - 10 мг/кг/сутки, в зависимости от способа введения. Руководство по конкретным дозам и способам введения предоставлено в литературе; см., например, патенты США № 4657760; 5206344; 5225212. Ожидают, что различные составы будут эффективными для различных лекарственных соединений и различных заболеваний, что введение, направленное, например, на один орган или ткань, может требовать введения способом, отличным от способа для другого органа или ткани.

Предполагают, что в способах можно применять дополнительную терапию. Один или несколько других способов терапии могут включать в качестве неограничивающих примеров введение радиотерапии, цитокина (цитокинов), ингибирующего рост средства (средств), химиотерапевтического средства (средств), цитотоксического средства (средств), ингибиторов тирозинкиназы, ингибиторов ras-фарнезилтрансферазы, ингибиторов ангиогенеза и ингибиторов циклинзависимой киназы, которые известны в данной области и определены далее и особенно выше. Предполагают, что такие другие терапевтические средства можно применять в виде средства, отдельного от Apo2L/TRAIL или антитела к рецептору смерти. Кроме этого способы терапии основаны на терапевтических антителах, направленных против опухолевых антигенов, таких как Rituxan™ или Herceptin™, так же как анти-ангиогенных антителах, таких как анти-VEGF.

Можно использовать препараты и режимы дозирования для химиотерапевтических средств согласно инструкциям производителя или как эмпирически определено практикующим специалистом. Препараты и режимы дозирования для такой химиотерапии описаны также в Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Химиотерапевтическое средство можно вводить до или после введения Apo2L/TRAIL или антител к рецептору смерти или можно вводить одновременно с ними.

Может также являться желательным вводить антитела против других антигенов, таких как антитела, связывающиеся с CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) или другими членами семейства TNFR (такими, как OPG, TNFR1, TNFR2, GITR, Apo-3, TACI, BCMA, BR3). Альтернативно или дополнительно, два или более антител, связывающих один и тот же или два или более антигенов, описанных здесь, можно совместно вводить пациенту. Иногда может являться благоприятным вводить пациенту также один или несколько цитокинов. После введения обработанные in vitro клетки можно анализировать. Где присутствовало лечение in vivo, за подвергнутым лечению млекопитающим можно наблюдать различными способами, хорошо известными практикующим специалистам. Например, опухолевые клетки можно исследовать патологически для анализа некроза или можно анализировать в сыворотке ответы иммунной системы.

Для использования в применениях, описанных или предложенных выше, изобретение относится также к наборам изделий. Такие наборы могут содержать средства для перевозки, разделенные на отсеки, чтобы содержать в тесном заключении один или несколько контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., где каждый из контейнеров содержит один из раздельных элементов для применения в способе. Например, один из контейнеров может содержать зонд, меченный для детекции или который можно метить. Таким зондом может служить антитело или полинуклеотид, специфический для белка FUT3 и/или FUT6, или гена, или мРНК FUT3 и/или FUT6 соответственно. Где в наборе используют гибридизацию нуклеиновой кислоты для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, набор может содержать также контейнеры, содержащие нуклеотид(ы) для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, и/или контейнер, содержащий репортерные средства, такие как связывающий биотин белок, такой как авидин или стрептавидин, связанный с репортерной молекулой, такой как ферментативная, флуоресцентная или радиоизотопная метка.

Набор по изобретению обычно будет содержать контейнер, описанный выше, и один или несколько других контейнеров, содержащих вещества, желательные с коммерческой или пользовательской точки зрения, включая буферы, растворители, фильтры, иглы, шприцы и вложения в упаковку с инструкциями для применения. На контейнере может присутствовать этикетка, чтобы указывать, что композицию используют для конкретного терапевтического или нетерапевтического применения, и могут быть указаны также инструкции для применения in vivo или in vitro, такие как описанные выше.

Наборы по изобретению обладают рядом вариантов осуществления. Типичный вариант осуществления представляет собой набор, содержащий контейнер, этикетку на указанном контейнере и композицию, содержащуюся в указанном контейнере; где композиция содержит первичное антитело, связывающее последовательность полипептида FUT3 и/или FUT6, этикетка на указанном контейнере указывает, что композицию можно применять для оценки присутствия белков FUT3 и/или FUT6 по меньшей мере в одном типе клеток млекопитающего, и содержит инструкции по применению антитела FUT3 и/или FUT6 для оценки присутствия белков FUT3 и/или FUT6 по меньшей мере в одном типе клеток млекопитающего. Набор может дополнительно содержать набор инструкций и материалов для получения образца ткани и применения антитела и зонда к одному и тому же срезу образца ткани. Набор может содержать как первичное, так и вторичное антитело, где вторичное антитело является конъюгированным с меткой, например ферментативной меткой.

В другом варианте осуществления набор содержит контейнер, этикетку на указанном контейнере и композицию, содержащуюся в указанном контейнере; где композиция содержит полинуклеотид, который гибридизуется с комплементарным ему из полинуклеотидов FUT3 и/или FUT6 в строгих условиях, этикетка на указанном контейнере указывает, что композицию можно применять для оценки присутствия FUT3 и/или FUT6 по меньшей мере в одном типе клеток млекопитающего, и содержит инструкции по применению полинуклеотида FUT3 и/или FUT6 для оценки присутствия РНК или ДНК FUT3 и/или FUT6 по меньшей мере в одном типе клеток млекопитающего.

Другие, необязательные, компоненты набора включают один или несколько буферов (например, блокирующий буфер, промывочный буфер, буфер для субстрата и т.д.), другие реагенты, такие как субстрат (например, хромоген), который химически изменяют ферментативной меткой, раствор для демаскировки эпитопов, контрольные образцы (положительный и/или отрицательный контроли), контрольное стекло (стекла) и т.д.

ПРИМЕРЫ

Различные аспекты изобретения далее описаны и проиллюстрированы посредством следующих примеров, ни один из которых не предназначен для ограничения объема изобретения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток и линии клеток

Следующие линии клеток колоректальной аденокарциномы человека: HCT-8, COLO 205, HCT 116, SW403, LoVo, SW948, Caco-2, COLO 201, SW1417, DLD-1, CX-1, HCT-15, LS 180, RKO, RKO-AS45-1, SK-CO-1, SW480, SW620, SW837, CL-40, COLO-206F, COLO 320DM, COLO 320HSR, COLO-678, HT-29, KMl2, LS1034, SW1116 получили из банка ATCC (Manassas, Virginia), DSMZ (Германская коллекция микроорганизмов и культур клеток), JCRB (Японский банк клеточных ресурсов) или ECACC (Европейская коллекция культур клеток) и культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамином и 10 мМ HEPES.

Анализы цитотоксичности

Анализ MTT (нерадиоактивный анализ пролиферации клеток CellTiter 96^® от Promega), представляющий собой колориметрический анализ, основанный на способности жизнеспособных клеток восстанавливать растворимую желтую соль тетразолия (MTT) до синих кристаллов формазана, использовали для определения количества жизнеспособных клеток после обработки Apo2L/TRAIL или антителом к DR5. Анализ MTT проводили добавлением предварительно перемешанного раствора оптимизированного красителя в культуральные лунки 96-луночного планшета, содержащего различные концентрации (0-1000 нг/мл) Apo2L/TRAIL или антитела к DR5. Во время 4-часовой инкубации живые клетки переводили тетразолиевый компонент раствора красителя в формазановый продукт. Затем в лунки с культурой клеток добавляли солюбилизирующий/останавливающий раствор для растворения формазанового продукта и регистрировали оптическую плотность при 570 нм с использованием спектрофотометра для прочтения 96-луночных планшетов (SpectraMax). Показатель оптической плотности при 570 нм является прямо пропорциональным числу клеток, нормально используемых в анализах пролиферации. Хотя максимум оптической плотности для формазанового продукта составляет 570 нм и чистые растворы выглядят синими, цвет в конце анализа может не являться синим и зависит от количества присутствующего формазана относительно других компонентов культуральной среды (включая сыворотку, окисленный фенол красный и невосстановленный MTT).

Число клеток оптимизируют проведением титрования клеток для получения при анализе сигнала, близкого к верхнему значению линейного диапазона анализа. Поскольку различные типы клеток обладают различными уровнями метаболической активности, это сделано для каждой линии клеток отдельно. Для большинства исследуемых опухолевых клеток использовали от 5000 клеток на лунку до 20000 клеток на лунку. Ниже следует пошаговое описание применяемых анализов.

1. Клетки, применяемые для биологического анализа, из маточных культур.

2. Определение числа клеток и жизнеспособности с использованием трипанового синего и суспендирование клеток до конечного числа от 5000 до 20000 клеток на лунку.

3. Раскапывание по 50 мкл суспензии клеток в 96-луночный планшет.

4. Инкубация планшетов при 37°C в атмосфере увлажненного 5% CO₂ в течение ночи.

5. Добавление 50 мкл культуральной среды, содержащей различные концентрации Apo2L/TRAIL или антитела к DR5 в диапазоне от 0 до 1000 нг/мл, к образцам в 96-луночном планшете. Контролями являлись 50 мкл культуральной среды (без Apo2L/TRAIL или антитела к DR5) и 100 мкл культуральной среды (без клеток). Каждый эксперимент проводили в тройном наборе лунок и в течение трех независимых суток. Общий объем в лунках составлял 100 мкл/лунку.

6. Инкубация планшетов при 37°C в течение 72 часов в атмосфере увлажненного 5% CO₂.

7. Добавление 15 мкл раствора красителя в каждую лунку.

8. Инкубация планшетов при 37°C вплоть до 4 часов в атмосфере увлажненного 5% CO₂.

9. Добавление 100 мкл солюбилизирующего/останавливающего раствора в каждую лунку.

10. Инкубация планшетов в течение ночи при 37°C.

11. Регистрация оптической плотности при длине волны 570 нм с использованием спектрофотометра для прочтения 96-луночных планшетов. Контрольную длину волны 750 нм использовали для уменьшения фона, сообщаемого обломками клеток, отпечатками пальцев и другим неспецифическим поглощением.

12. Среднее значений оптической плотности для отрицательного контроля использовали как нулевое значение и вычитали из всех других показателей. Среднее значений оптической плотности для каждой концентрации Apo2L/TRAIL или антитела к DR5 делили на среднее значений оптической плотности положительного контроля (100% жизнеспособных клеток - необработанные) для вычисления количества жизнеспособных клеток (в %).

13. Строили график процента жизнеспособных клеток (ось Y) в зависимости от концентрации Apo2L/TRAIL или антитела к DR5 (ось X, логарифмическая шкала) и определяли значение IC₅₀ по локализации значения на оси X (нг/мл), соответствующего 50% жизнеспособных клеток.

Протокол введения метки Affymetrix

Для всех образцов получали показатели OD260/280 и обрабатывали образцы на BioAnalyzer. Использовали 5 мкг тотальной РНК высокого качества.

A. Синтез первой цепи кДНК:

1. Гибридизация праймера

DEPC-H₂O х мкл перемешать встряхиванием. Быстро отцентрифугировать.

РНК (5 мкг) y мкл инкубировать 10 минут при 70°C.

Маркер (для 5 мкг разбавить маточный раствор 1:4) 1 мкл быстро отцентрифугировать и поместить в лед.

T7-(dT)24 праймер 1 мкл

объем 12 мкл

2. Регулирование температуры

5X-буфер для 1 цепи кДНК 4 мкл

Добавить 7 мкл (из смеси слева) к каждому образцу.

0,1 М DTT 2 мкл перемешать встряхиванием. Быстро отцентрифугировать.

10 мМ смесь dNTP 1 мкл инкубировать при 42°C 2 минуты.

объем 7 мкл

3. Синтез первой цепи

Добавить 1 мкл SSII RT к каждому образцу.

SSII RT 1 мкл перемешать пипетированием вверх-вниз или легким встряхиванием.

Быстро отцентрифугировать.

Общий объем 20 мкл инкубировать при 42°C 1 час.

B. Синтез второй цепи кДНК

1. Поместить реакционные смеси для первой цепи в лед. Коротко отцентрифугировать, чтобы опустить конденсат со стенок пробирки.

2. Приготовить следующую общую реакционную смесь для второй цепи.

обработанная DEPC H₂O 91 мкл

5X-реакционный буфер для 2 цепи 30 мкл

10 мМ смесь dNTP 3 мкл

10 ед./мкл ДНК-лигаза 1 мкл

10 ед./мкл ДНК-полимераза I 4 мкл

2 ед./мкл РНКаза H 1 мкл

Общий объем 130 мкл

3. Добавить 130 мкл общей реакционной смеси для второй цепи к 20 мкл первой цепи кДНК. (Конечный объем = 150 мкл)

4. Перемешать пипетированием вверх-вниз или легким встряхиванием. Быстро отцентрифугировать.

5. Инкубировать при 16°C в течение 2 часов в охлаждаемой водяной бане.

6. Добавить 2 мкл [10 ед.] T4 ДНК-полимеразы. Перемешать пипетированием вверх-вниз или легким встряхиванием. Быстро отцентрифугировать.

7. Инкубировать 5 минут при 16°C.

8. Добавить 10 мкл 0,5 M EDTA. Легко встряхнуть. Быстро отцентрифугировать.

9. Перейти к процедуре очистки кДНК или хранить при -20°C для более позднего использования.

Очистка двухцепочечной кДНК (модуль для очистки образцов GeneChip)

1. Добавить 600 мкл буфера для связывания кДНК к 162 мкл конечного препарата синтеза двухцепочечной кДНК.

Перемешивать встряхиванием в течение 3 секунд.

2. Проверить, что цвет смеси является желтым (таким же, как у буфера для связывания кДНК без реакционной смеси для синтеза кДНК).

Если цвет смеси является оранжевым или фиолетовым, добавить 10 мкл 3 М ацетата натрия, pH 5,0, и перемешать.

Цвет смеси станет желтым.

3. Нанести 500 мкл образца на центрифугируемую колонку для очистки кДНК, вставленную в 2 мл пробирку для сбора, и центрифугировать 1 минуту при ≥8000×g (≥10000 об/мин). Выбросить проскок как опасный мусор.

4. Повторно нанести на центрифугируемую колонку оставшуюся смесь (262 мкл) и центрифугировать, как выше.

Выбросить проскок как опасный мусор и выбросить пробирку для сбора.

5. Перенести центрифугируемую колонку в новую 2 мл пробирку для сбора (предоставлена). Налить 750 мкл буфера для промывки кДНК в центрифугируемую колонку. Центрифугировать 1 минуту при >8000×g (≥10000 об/мин).

Выбросить проскок.

6. Открыть крышку центрифугируемой колонки и центрифугировать 5 минут на максимальной скорости (≤25000×g). Поместить пробирки в центрифугу с использованием каждого второго гнезда. Расположить крышки над смежными гнездами, так чтобы они были ориентированы в обратном направлении к вращению, т.е., если вращение по часовой стрелке, ориентировать крышки в направлении против часовой стрелки. Это предотвращает разрушение крышек. Выбросить проскок и пробирку для сбора.

7. Перенести центрифугируемую колонку в 1,5 мл пробирку для сбора. Нанести 10 мкл буфера для элюции кДНК непосредственно на мембрану центрифугируемой колонки. Убедиться, что буфер для элюции кДНК распределен непосредственно на мембране.

Инкубировать 1 минуту при комнатной температуре и центрифугировать 1 минуту при максимальной скорости (≤25000×g) для элюции.

Подготовка и проведение реакции IVT

Enzo: набор для высокоэффективного мечения транскриптов РНК для биочипов (Каталожный № 900182)

1. Использовать 10 мкл очищенной двухцепочечной кДНК.

2. Приготовить следующую общую реакционную смесь для IVT:

Дистиллированная или деионизированная H₂O 12 мкл

10X HY реакционный буфер 4 мкл

10x меченные биотином рибонуклеотиды 4 мкл

10X DTT 4 мкл

10Х Смесь ингибиторов РНКазы 4 мкл

20X T7 РНК-полимераза 2 мкл

Общий объем: 30 мкл

3. Добавить 30 мкл общей реакционной смеси IVT к 10 мкл двухцепочечной кДНК. (Общий объем = 40 мкл)

4. Перемешать пипетированием вверх-вниз или легким встряхиванием. Быстро отцентрифугировать.

5. Немедленно поместить пробирку в водяную баню при 37°C. Инкубировать 5 часов.

6. Хранить при -20°C, если РНК не очищают немедленно.

Очистка меченной биотином кРНК (модуль для очистки образцов GeneChip)

1. Добавить 60 мкл H₂O к реакционной смеси IVT и перемешивать встряхиванием в течение 3 секунд.

2. Добавить к образцу 350 мкл буфера для связывания IVT кРНК, перемешивать встряхиванием в течение 3 секунд.

3. Добавить к лизату 250 мкл этанола (96-100%) и хорошо перемешать пипетированием. Не центрифугировать.

4. Нанести образец (700 мкл) на центрифугируемую колонку для очистки IVT кРНК, вставленную в 2 мл пробирку для сбора.

Центрифугировать 15 секунд при ≥8000×g (≥10000 об/мин).

5. Еще раз пропустить элюат через колонку.

Центрифугировать 15 секунд при ≥8000×g (≥10000 об/мин).

Выбросить проскок как опасный мусор и выбросить пробирку для сбора.

6. Перенести центрифугируемую колонку в новую 2 мл пробирку для сбора (предоставлена).

7. Добавить 500 мкл буфера для промывки IVT кРНК и центрифугировать 15 секунд при ≥8000×g (≥10000 об/мин) для промывки.

Выбросить проскок.

8. Налить 500 мкл 80% (об./об.) этанола в центрифугируемую колонку и центрифугировать 15 секунд при ≥8000×g (≥10000 об/мин). Выбросить проскок.

9. Открыть крышку центрифугируемой колонки и центрифугировать 5 минут на максимальной скорости (≤25000×g).

Выбросить проскок и пробирку для сбора.

10. Перенести центрифугируемую колонку в новую 1,5 мл пробирку для сбора.

11. Нанести 11 мкл свободной от РНКазы воды непосредственно на мембрану центрифугируемой колонки. Дать постоять 1 минуту.

Центрифугировать 1 минуту на максимальной скорости (≤25000×g) для элюции.

12. Нанести 10 мкл свободной от РНКазы воды непосредственно на мембрану центрифугируемой колонки. Дать постоять 1 минуту.

Центрифугировать 1 минуту на максимальной скорости (≤25000×g) для элюции.

Количественная оценка кРНК (продукт IVT)

Использовать спектрофотометрический анализ для определения выхода РНК. Применить правило, что 1 OD при 260 нМ эквивалентна 40 мкг/мл РНК.

Проверить OD при 260 нМ и 280 нМ для определения концентрации и чистоты образца.

Поддерживать отношение A260/A280 близким к 2,0 для чистой РНК (отношения между 1,9 и 2,1 являются приемлемыми).

Для количественной оценки кРНК с использованием тотальной РНК в качестве исходного материала необходимо рассчитать скорректированный выход кРНК, чтобы отразить примесь немеченной тотальной РНК. С использованием оценки 100% примеси применить формулу ниже для определения скорректированного выхода кРНК:

скорректированный выход кРНК = РНКm - (тотальная РНКi) (y)

РНКm = количество кРНК, измеренное после IVT (мкг)

тотальная РНКi = исходное количество тотальной РНК (мкг)

y = фракция реакционной смеси для кДНК, использованная в IVT

Фрагментация кРНК для получения мишени

Для фрагментации использовать скорректированную концентрацию кРНК.

1. Добавить 2 мкл 5x буфера для фрагментации для каждых 8 мкл РНК плюс H₂О.

20 мкг кРНК 1-32 мкл

5X буфер для фрагментации 8 мкл

свободная от РНКазы вода до 40 мкл

Общий объем: 40 мкл

2. Инкубировать при 94°C 30 минут. Немедленно после инкубации поместить в лед.

Получение мишени для гибридизации

1. Нагревать 20X эукариотические контроли для гибридизации и олигонуклеотид B2 в течение 5 минут при 65°C.

Набор эукариотических контролей для гибридизации Affymetrix GeneChip, каталожный #900362 (для 150 реакций)

2. Легко встряхнуть, осадить центрифугированием.

3. Общая реакционная смесь (Принимая концентрацию фрагментированной кРНК, равной 0,5 мкг/мкл):

Стандартный чип (мкл) Конечная конц.

Фрагментированная кРНК 15 мкг 30 0,05 мкг/мкл

Олигонуклеотид B2 (3 нМ) 5 50 пМ

20x контрольный маркер 15 1,5, 5, 25, 100 пМ

(Bio B, C, D, Cre)

ДНК спермы лосося 3 0,1 мг/мл

Ацетилированный BSA 3 0,5 мг/мл

Hu cot-1 ДНК (1 мг/мл) 30 0,1 мг/мл

2X MES буфер для гибридизации 150 1X

H₂O 64

Конечный объем 300

4. Перенести аликвоты по 270 мкл общей реакционной смеси в пробирки и добавить в каждую 30 мкл фрагментированной кРНК. Это представляет собой смесь для гибридизации.

5. Уравновесить чипы с зондами до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

6. Заполнить чипы с зондами 1x MES буфером для гибридизации и инкубировать в печи с «вертелом» в течение 10 минут при 45°C, 60 об/мин.

7. Нагревать смесь для гибридизации в водяной бане при 99°C 5 минут.

8. Перенести смесь для гибридизации в водяную баню при 45°C на 5 минут.

9. Центрифугировать смесь для гибридизации 5 минут на максимальной скорости.

10. Удалить 1x MES буфер для гибридизации с чипов с зондами.

11. Заполнить чип с зондами до верха 200 мкл смеси для гибридизации.

12. Закрыть пленкой с выступами Tough Spots.

13. Гибридизовать чип с зондами при 45°C, 60 об/мин в течение 19 часов.

14. Промыть, окрасить и сканировать чип с зондами согласно протоколам Affymetrix.

Материалы Affymetrix

Изделие Производитель Каталожный #

T7-(dT)24 праймер Biosearch Technologies на заказ

Контрольные маркеры собственного производства

Superscript II/5X буфер для первой цепи/0,1 M DTT Invitrogen 18064-014

5X буфер для второй цепи Invitrogen 10812-014

10 мМ dNTP Invitrogen 18427-088

10 ед./мкл ДНК-лигаза E. coli Invitrogen 18052-019

10 ед./мкл ДНК-полимераза I E. coli Invitrogen 18010-025

2 ед./мкл РНКаза H Invitrogen 18021-071

10 ед./мкл T4 ДНК-полимераза Invitrogen 18005-025

0,5 M EDTA Sigma E-7889

ENZO набор для высокоэффективного мечения транскриптов РНК Affymetrix или ENZO 900182 (ENZO)

Модуль для очистки образцов GeneChip Affymetrix 900371

Ацетилированный бычий сывороточный альбумин Invitrogen 15561-020

Козьи IgG - химически чистые Sigma I-5256

Антистрептавидиновое антитело (козье), биотинилированное Vector Labs BA-0500

R-фикоэритрин-стрептавидин Molecular Probes S-866

20X SSPE BioWhittaker 51214

Набор эукариотических контролей Affymetrix 900362

Вода для молекулярной биологии Ambion 9934

ДНК человека Cot-1 Roche 1-581-074

5 М NaCl, свободный от РНКазы, свободный от ДНКазы Ambion 9760

Пеногаситель 0-30 Sigma A-8082

10% Tween-20 Pierce Chemical 28320

MES, моногидрат свободной кислоты Sigma M5287

MES, натриевая соль Sigma M3885

EDTA, динатриевая соль, 0,5 М раствор Sigma E7889

Tough Spots, Label Dots USA Scientific 9902

Печь для гибридизации GeneChip Oven 640 Affymetrix 800139 GeneChip Scanner 3000 с рабочей станцией Affymetrix 00-0074

Система для автоматической работы с жидкостями Fluidics Station Affymetrix 00-0081

Автоматическое загрузочное устройство с внешним устройством считывания штрихового кода Affymetrix 00-0129

Количественная ПЦР

Синтез кДНК:

Компонент Объем (мкл) 10 X буфер для RT 10 25 X смесь dNTP 4 10 X случайные праймеры 10 MultiScribe RT (50 ед./мкл) 5 Свободная от РНКазы H₂O 21 РНК (100 нг) 50 Конечный объем 100

Условия инкубации

25° 10 минут

37° 2 часа

Реакция TaqMan с использованием секвенирующего детектора ABI Prism 7700 Sequencing Detector:

Компонент Объем (мкл) Универсальная общая реакционная смесь для ПЦР TaqMan (2 X) 25 Зонд TaqMan (20 X) (Assays-on-Demand™) 2,5 кДНК (100 нг) 2 H₂O 20,5 Конечный объем 100

Условия термоциклирования

95° 10 минут

40 циклов: 95° 15 секунд

60° 1 минута

- зонды TaqMan: Assays-on-Demand™ (зонды TaqMan® MGB, меченные красителем FAM™)

- проводили амплификацию эндогенного контроля, GAPDH (концентрация зонда 100 нМ, концентрации прямого и обратного праймера 200 нМ) для стандартизации количества образца РНК (кДНК), добавленного в каждую реакцию.

Относительную количественную оценку проводили с использованием способа калибровочной кривой. Для количественной оценки, нормализованной по эндогенному контролю, калибровочные кривые получали и для мишени, и для эндогенного контроля. Для каждого экспериментального образца определяли количество мишени и эндогенного контроля по соответствующей калибровочной кривой. Затем количество мишени делили на количество эндогенного контроля для получения нормализованного искомого значения. Один из экспериментальных образцов служил калибратором, или 1x образцом. Затем каждое из нормализованных искомых значений делили на нормализованное искомое значение для калибратора для получения относительных уровней экспрессии.

FACS/Проточная цитометрия (Протокол окрашивания 2° антителом)

Все инкубации и центрифугирования проводили при 4°C и пробирки сохраняли во льду, если не в холодильнике.

1. Определить тип пробирок по определению используемых линий клеток, интересующих антител и любых особых условий или обработок.

a. контроли.

i. неокрашенный, 2° антитело, и корректировка, если флуорохромы обладают перекрывающимися спектрами излучения.

b. Пример:

Пробирка Линия клеток Время (мин) 1° антитело 2° антитело 1 например, COLO-205 0 - - 2 например, COLO-205 0 - анти-мышь-FITC 3 например, COLO-205 0 анти-сиалил-Льюис A анти-мышь-FITC 4 например, COLO-205 0 анти-CD15s (сиалил-Льюис X) анти-мышь-FITC

2. Маркировать пробирки для FACS.

a. BD Falcon 12×75 мм, полистироловые круглодонные, каталожный #: 352052

3. Приготовить клетки для окрашивания.

a. Обработать прикрепленные клетки аккутазой или трипсином.

i. Innovative Cell Technologies Inc., аккутаза.

ii. Gibco, Trypsin. Каталожный #: 25200-106.

b. Продолжать оставшиеся стадии, если клетки представляют собой суспензию.

4. Перенести аликвоту клеток в 15 мл или 50 мл коническую пробирку.

5. Центрифугировать клетки 5 мин, 1200 об/мин, 4°C.

6. Отобрать супернатант.

7. Ресуспендировать клетки в 5 мл буфера для FACS.

8. Центрифугировать клетки 5 мин, 1200 об/мин, 4°C.

9. Отобрать супернатант.

10. Ресуспендировать клетки в блокирующем буфере.

a. Чтобы определить объем блокирующего буфера, нужно:

i. Число пробирок на линию клеток/обработку X 100 мкл блокирующего буфера на пробирку.

ii. Требуется 1×10⁶ клеток на 100 мкл блокирующего буфера.

11. Перенести аликвоту 100 мкл клеток в подходящую пробирку.

a. Исходить из предварительно определенного типа пробирок.

12. Добавить 1° антитело в соответствующую пробирку.

a. Льюис A:

i. Использовать 10 мкл маточного раствора 0,2 мкг/мкл на пробирку.

1. Конечная концентрация составляет 2 мкг.

ii. Chemicon: анти-сиалил-Льюис A. Каталожный #: MAB2095.

b. Льюис X:

i. Использовать 5 мкл маточного раствора 0,5 мкг/мкл на пробирку.

1. Конечная концентрация составляет 2,5 мкг.

ii. BD Pharmingen: CD15s (сиалил-Льюис X). Каталожный #: 551344.

13. Инкубировать 30 мин при 4°C.

14. Добавить 1 мл буфера для FACS в каждую пробирку.

15. Центрифугировать клетки 5 мин, 1200 об/мин, 4°C.

16. Отобрать супернатант

17. Мягко встряхнуть осадок в пробирках с помощью штатива.

a. «С помощью штатива» - Провести пробирками по поверхности штатива для пробирок 12×75 мм.

18. Повторить стадии 14-17.

19. Добавить 100 мкл блокирующего буфера в каждую пробирку.

20. Добавить 2° антитело в соответствующую пробирку.

a. Использовать 10 мкл на пробирку.

b. Jackson, антитела козы против антител мыши с FITC. Каталожный #: 115-096-068.

21. Инкубировать 30 мин при 4°C.

22. Повторить стадии 14-17 дважды.

23. Ресуспендировать клетки в буфере для FACS/PI.

a. Определить необходимый объем:

i. Требуется 1 мл раствора на пробирку.

ii. PI = 1 мкл на 1 мл буфера.

b. Molecular Probes, иодид пропидия. Каталожный #: P3566.

24. Поместить пробирки в емкость со льдом или ледяной штатив для пробирок.

25. Покрыть алюминиевой фольгой и доставить в лабораторию для FACS для сбора данных и анализа образцов квалифицированным оператором.

5% блокирующий буфер:

1. FBS до 5% от общего объема.

2. Буфер для FACS.

3. Профильтровать раствор через фильтр 0,2 мкм.

Буфер для FACS:

1. 980 мл PBS.

2. 8 мл 0,25 М EDTA.

3. 20 мл FBS.

4. Профильтровать раствор через фильтр 0,2 мкм.

Иммуногистохимическая процедура: сиалил-Льюис A

Антитело: сиалил-Льюис A AB-1

Клон: 121SLE

Поставщик: NeoMarkers

Каталожный № MS-279-P

Виды Ig: мышь

Способ IHC: парафиновый

Предварительная обработка: нет

Выполнение IHC: автоматическая система для окрашивания Autostainer

Изотип: IgM мыши

Виды для процедуры: человек

Концентрация IgG: 200 мкг/мл

Обычная процедура

Депарафинизировать и гидратировать до дистиллированной воды.

Блокировать эндогенный биотин блокирующей системой Vector Avidin Biotin.

Промыть TBS: 2 смены, по 5 минут каждая.

Блокировать 10% нормальной сывороткой лошади в течение 30 минут при комнатной температуре.

Инкубировать срезы с мышиным моноклональным антителом к сиалил-Льюис A, разведенным до 5 мкг/мл 10% нормальной сывороткой лошади, 60 минут при комнатной температуре.

Использовать мышиные антитела изотипа IgM, разведенные до 5 мкг/мл 10% нормальной сывороткой лошади, в качестве отрицательного контроля.

Промыть TBS: 2 смены, по 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с биотинилированным антителом лошади против антител мыши; разведенным 1:200 в 10% нормальной сыворотке лошади, 30 минут при комнатной температуре.

Промыть TBS: 2 смены, по 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с разведенной системой Vector ABC Elite 30 минут при комнатной температуре.

Промыть TBS: 2 смены, по 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с усиленным металлом DAB от Pierce 5 минут.

Промыть в проточной водопроводной воде 5 минут.

Провести контрастное окрашивание гематоксилином Майера 1 минуту.

Промыть в проточной водопроводной воде 5 минут.

Подсинить гематоксилин подсинивающим реагентом Ричарда-Аллана 1 минуту.

Промыть в проточной водопроводной воде 2 минуты.

Дегидратировать, очистить и заключить в синтетическую заключающую среду.

Иммуногистохимическая процедура: сиалил-Льюис X

Антитело: мышиное анти-сиалил-Льюис X

Клон: KM93

Поставщик: Chemicon

Каталожный № MAB2096

Виды Ig: мышь

Способ IHC: парафиновый

Предварительная обработка: демаскировка эпитопов DAKO Target Retrieval

Выполнение IHC: автоматическая система для окрашивания Autostainer

Изотип: IgM мыши

Виды для процедуры: человек

Концентрация IgG: 100 мкг/мл

Обычная процедура

Депарафинизировать и гидратировать до дистиллированной воды.

Блокировать активность эндогенной пероксидазы блокирующим раствором KPL - развести концентрат 1:10 в dH₂O, 4 минуты при комнатной температуре;

Промыть в дистиллированной воде 5 минут.

Инкубировать в растворе для демаскировки эпитопов от DAKO (S1700), предварительно нагретом до 99 градусов, в течение 20 минут в кипящей водяной бане. Убрать из кипящей бани и позволить охлаждаться 20 минут.

Блокировать эндогенный биотин блокирующей системой Vector Avidin Biotin.

Блокировать 10% нормальной сывороткой лошади в течение 30 минут при комнатной температуре.

Инкубировать срезы с мышиным моноклональным антителом к сиалил-Льюис X, разведенным до 5 мкг/мл 10% нормальной сывороткой лошади, 60 минут при комнатной температуре.

Использовать мышиные антитела изотипа IgM, разведенные до 5 мкг/мл в 10% нормальной сыворотке лошади, в качестве отрицательного контроля.

Промыть TBS: 2 смены, по 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с биотинилированным антителом лошади против антител мыши от Vector; разведенным 1:200 в 10% нормальной сыворотке лошади, 30 минут при комнатной температуре.

Промыть TBS: 2 смены, по 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с разведенной системой Vector ABC Elite 30 минут при комнатной температуре.

Промыть TBS: 2 смены, по 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с усиленным металлом DAB от Pierce 5 минут.

Промыть в проточной водопроводной воде 5 минут.

Провести контрастное окрашивание гематоксилином Майера 1 минуту.

Промыть в проточной водопроводной воде 5 минут.

Подсинить гематоксилин подсинивающим реагентом Ричарда-Аллана 1 минуту.

Промыть в проточной водопроводной воде 2 минуты.

Дегидратировать, очистить и заключить в синтетическую заключающую среду.

Экспериментальные результаты

Эксперименты проводили с использованием материалов и методов, описанных выше. Результаты этих экспериментов проиллюстрированы на фиг.6-13, как обсуждают ниже.

На фиг.6 показана обобщенная таблица данных, полученных при анализе 28 линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по чувствительности или устойчивости к апоптотической активности Apo2L (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки «FBS» или 10% FBS) или моноклонального антитела к DR5 «mab», перекрестносшитого «XL» или неперекрестносшитого (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки «FBS» или 10% FBS) и экспрессии FUT 3, FUT 6, сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X.

На фиг.7 показано сравнение чувствительности различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, к антителу к DR5 и экспрессии FUT 3 (как измерено количественной ПЦР).

На фиг.8 показано сравнение чувствительности различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по чувствительности или устойчивости к антителу к DR5 (плюс перекрестносшивающее средство) и экспрессии сиалил-Льюис X или A, как определено FACS.

На фиг.9A показан коэффициент ранговой корреляции Спирмэна при анализе чувствительности или устойчивости различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, и корреляции с экспрессией FUT3.

На фиг.9B показаны результаты точного теста Фишера для анализа чувствительности («чувств.») или устойчивости («уст.») различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, и статистическая значимость между экспрессией FUT 3 и сиалил-Льюис A/X и чувствительностью соответствующих линий клеток к апоптотической активности антитела к DR5.

На фиг.10 показано сравнение различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по экспрессии рецепторов DcRl или DcR2 (как определено количественной ПЦР) и статус (чувствительные или устойчивые) конкретных линий клеток по отношению к Apo2L или антителу к DR5.

На фиг.11 показано сравнение различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по экспрессии рецепторов DcRl или DcR2 (как определено FACS) и статус (чувствительные или устойчивые) конкретных линий клеток по отношению к Apo2L или антителу к DR5.

На фиг.12 показано иммуногистохимическое окрашивание сиалил-Льюис A и X в четырех линиях раковых колоректальных клеток, CaCo2 (Colo 2), SW 1417, DLD-1 и Colo 205, и его корреляция с экспрессией сиалил-Льюис A и X, как измерено FACS, и ее корреляция с чувствительностью к Apo2L/TRAIL. Для линий колоректальных раковых клеток Colo 2 и SW1417 показано отсутствие окрашивания и слабое окрашивание соответственно, или при FACS они являлись соответственно отрицательными или слабо положительными по антигенам сиалил-Льюис и являлись устойчивыми к Apo2L/TRAIL. Для линий раковых колоректальных клеток DLD-1 и Colo 205 показано умеренное и сильное окрашивание соответственно, при FACS они являлись соответственно умеренно и сильно положительными по антигенам сиалил-Льюис и являлись чувствительными к Apo2L/TRAIL.

На фиг.13 показаны обобщенные результаты IHC экспериментов, демонстрирующие экспрессию сиалил-Льюис A и X в образцах ткани нормальной слизистой толстой кишки, нормальной ткани печени, первичного рака толстой кишки и метастазов рака толстой кишки. Образцы ткани нормальной толстой кишки и первичного рака толстой кишки, упорядоченные на микрочипе для тканей, тестировали в IHC эксперименте, в то время как образцы ткани нормальной печени и метастазов рака толстой кишки находились на отдельных стеклах. Распространение экспрессии сиалил-Льюис A и X и интенсивность иммуногистохимического окрашивания увеличивалась от нормальной ткани толстой кишки до первичного рака толстой кишки и до метастазов рака толстой кишки. Нормальные клетки печени не являлись окрашенными ни для одного из сиалил-Льюис A или X.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ предсказания чувствительности образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего к Apo2L/TRAIL, включающий стадии: получения образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего; исследования образца ткани или клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис А и/или X, где экспрессия одного или нескольких указанных биомаркеров является показателем того, что указанный образец ткани или клеток является чувствительным к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL. Также описан способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего. Предложен способ лечения злокачественной опухоли у млекопитающего. Изобретения позволяют использовать детекцию экспрессии одного или нескольких биомаркеров в качестве показателя того, что образец будет чувствительным к апоптоз-индуцирующим средствам, таким как Apo2L/TRAIL и антитела-агонисты против DR5. Конкретные биомаркеры, которые можно исследовать, включают фукозилтрансферазы, в частности фукозилтрансферазу 3 (FUT3) и/или фукозилтрансферазу 6 (FUT6), так же как антигены сиалил-Льюис А и/или X. 6 н. и 29 з.п. ф-лы, 23 ил., 4 табл.

1. Способ предсказания чувствительности образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего к Apo2L/TRAIL, включающий стадии:
получения образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего;
исследования образца ткани или клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X, где экспрессия одного или нескольких указанных биомаркеров является показателем того, что указанный образец ткани или клеток злокачественной опухоли является
чувствительным к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL.

2. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют детекцией экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

3. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X.

4. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcRl или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

5. Способ по п.1, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

6. Способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего, включающий стадии:
получения образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего;
исследования образца ткани или клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X, и
после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров воздействия на указанный образец ткани или клеток злокачественной опухоли эффективным количеством Apo2L/TRAIL.

7. Способ по п.6, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют тестированием экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

8. Способ по п.6, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X.

9. Способ по п.6, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcRl или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

10. Способ по п.6, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

11. Способ по п.6, где на указанные клетки воздействуют эффективным количеством полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

12. Способ лечения злокачественной опухоли у млекопитающего, включающий стадии:
получения образца ткани или клеток от указанного млекопитающего;
исследования образца ткани или клеток для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X, и
после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров
введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

13. Способ по п.12, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют детекцией экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

14. Способ по п.12, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X.

15. Способ по п.12, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанной ткани или клетке.

16. Способ по п.12, где указанные клетки или ткань злокачественной опухоли содержат злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

17. Способ по п.12, где указанному млекопитающему вводят эффективное количество полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

18. Способ по п. 12, где указанное млекопитающее также получает химиотерапевтическое средство(средства) или радиотерапию.

19. Способ по п.12, где указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксическое средство или ингибирующее рост средство.

20. Способ по п.6, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

21. Способ по п.12, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

22. Способ по п.5, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки толстой кишки или колоректальные.

23. Способ по п.1, где указанный Apo2L/TRAIL представляет собой полипептид, содержащий аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1), или его биологически активный фрагмент.

24. Способ по п.23, где указанный Apo2L/TRAIL представляет собой полипептид, содержащий аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

25. Способ по п.10, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки толстой кишки или колоректальные.

26. Способ по п.17, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL состоит из аминокислот 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

27. Способ предсказания чувствительности клеток злокачественной опухоли млекопитающего из толстой кишки или колоректальных к Apo2L/TRAIL, включающий стадии:
получения клеток злокачественной опухоли млекопитающего из толстой кишки или колоректальных;
исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X, где экспрессия одного или нескольких указанных биомаркеров является показателем того, что указанные клетки злокачественной опухоли являются чувствительными к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL.

28. Способ индукции апоптоза в клетках злокачественной опухоли
млекопитающего из толстой кишки или колоректальных, включающий стадии:
получения клеток злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных;
исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X, и
после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров воздействия на указанные клетки злокачественной опухоли эффективным количеством полипептида Apo2L/TRAIL.

29. Способ по п.28, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1) или их фрагмент, обладающий апоптотической активностью.

30. Способ по п.29, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

31. Способ по п.29, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 114-281 фиг. 1 (SEQ ID NO:1).

32. Способ лечения у млекопитающего злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальной, включающий стадии:
получения образца клеток злокачественной опухоли указанного млекопитающего из толстой кишки или колоректальных;
исследования образца клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена(антигенов) сиалил-Льюис А и/или X, и
после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

33. Способ по п.32, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1) или их фрагмент, обладающий апоптотической активностью.

34. Способ по п.33, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

35. Способ по п.33, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).