СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОДЕЙТЕРИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ Российский патент 1998 года по МПК C12P19/30 C12P19/38 C12N1/20 

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и касается способа получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов.

Нуклеозиды и нуклеотиды широко используются в медицине для лечения ряда заболеваний, связанных с нарушениями в деятельности сердца, печени, клеточного метаболизма. Так, лекарственный препарат рибоксин, созданный на основе препарата инозина, оказывает стимулирующее действие на окислительно-восстановительные процессы в клетке, улучшает ее энергетический баланс (Европ. пат. N 0 423 617, Европ. пат. N 0 423 618, патент ГДР N 296 687).

Дейтериймеченные аналоги этих соединений необходимы для разнопрофильных биохимических, фармакокинетических и других исследований, в частности для структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот методами ЯМР. Для данных целей применяют препараты нуклеозидов и нуклеотидов, в которых не менее половины атомов водорода в молекуле должны быть замещены на дейтерий. Поскольку высокодейтерированные нуклеозиды и нуклеотиды используют при получении меченных диагностических лекарственных препаратов (АМФ, АТФ и др.), то разработка путей наиболее экономичного получения этих соединений в препаративных количествах является весьма актуальной задачей.

К настоящему времени меченные стабильными изотопами нуклеозиды и нуклеотиды получают химическими многостадийными методами (Европ. пат. N 0 203 696, Авт. свид. СССР N 1251509). Из биотехнологических методов получения таких соединений следует отметить метод, основанный на гидролизе и химической трансформации компонентов ДНК биомассы микроводорослей, например, Chlorela vulgaris, выращиваемых в жидких средах с тяжелой водой с уровнем дейтерирования до 9,9% (Заявка N 62-6793, Япония, Европ. пат. N 0 220 951). Поскольку присутствие высоких концентраций оксида дейтерия в среде ингибирует рост и развитие большинства видов микроорганизмов, концентрации целевых продуктов в биологическом материале очень низкие.

С дальнейшим развитием вида биотехнологических подходов появилась возможность усовершенствовать стандартные методы для получения меченных нуклеозидов и нуклеотидов, однако эти методы применяли для получения меченных радиоактивных тритием соединений. Так, в патентной литературе описаны химико-ферментационные методы получения тритилированных нуклеозидов с помощью экстрактов клеток и самих клеток микроорганизмов, обладающих ферментационной активностью (Авт. свид. Чехословакии N 267 846).

В ряде патентов сообщают о методах получения сайт-специфично меченных тритием полидезоксинуклеотидов (Междунар. заявка N 89/09780). Особенности ныне существующих методов состоят в том, что получение этих соединений почти всегда производят в несколько химико-ферментационных стадий из рибозо-1-фосфатов и других исходных субстратов, специфически меченных радиоактивным тритием в водной среде в присутствии иммобилизованных в полиакридном геле ферментных препаратов, выделяемых из бактерий, например, Esherichia alcalescens и др.

Заслуживают упоминания также методы получения нуклеотидов, меченных отличными от трития нерадиоактивными дейтериевыми метками (Междунар. заявка N 92/00989, Междунар. заявка N 91/13902, патент ГДР N 295 855). Согласно этим запатентованным способам включение метки в рибонуклеозиды не превышает 40% и таким образом нужные продукты не удовлетворяют требованиям по содержанию метки.

Основной стратегией биосинтеза дейтерий-меченных продуктов является использование для биотехнологических целей не обычных продуцентов, а заранее адаптированных к высокому содержанию требуемого изотопа форм микроорганизмов.

Настоящее изобретение позволяет упростить процедуру получения высокодейтерированных нуклеозидов, в частности инозина и тимидина.

Процесс получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов заключается в том, что штамм-продуцент нуклеотида рода Bacillus культивируют в полностью дейтерированной среде.

В качестве полностью дейтерированных компонентов среды могут быть использованы гидролизаты выращенной на дейтероводе и дейтерометаноле биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum.

В качестве полноценной дейтерированной среды может быть также использован гидролизат биомассы штамма-продуцента, выращенного на дейтерированной среде.

Штаммы-продуцент нуклеозида или нуклеотида являются специальными генетически сконструированными штаммами, которые способны продуцировать и секретировать нуклеозиды и нуклеотиды в ферментационную среду.

Культивирование этих штаммов в полностью дейтерированной среде приводит к образованию высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов.

Так, например, для получения высокодейтерированного инозина может быть использован штамм вида Bacillus subtilis, а для получения меченного тимидина - штамма вида Bacillus amyloliguefaciens,
Преимущество предлагаемого метода получения высокодейтерированных нуклеозидов заключается в том, что генетически сконструированные штаммы B. subtilis и B. amyloliquefaciens способны к росту на средах, содержащих максимальные концентрации оксида дейтерия.

Способ позволяет заменить глюкозу и необходимые аминокислоты на гидролизаты дейтерий-меченной биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum или на гидролизаты дейтерий-меченной биомассы Bacillus subtilis, содержащие в своем составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых факторов.

Способ характеризуется отсутствием большого количества отходов: согласно схеме дейтерия-меченная биомасса базовых штаммов, предварительно гидролизованная в DCl, возвращается в цикл в качестве ростовых факторов.

Способ также характеризуется высокой степенью изотопного обогащения дейтерий-меченных нуклеозидов (62,5% атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий) и высокими выходами целевых продуктов.

Пример 1.

Готовится жидкая посевная среда следующего состава, мас.%:
Глюкоза техническая - 2,0;
Источник ростовых факторов - белково-витаминный концентрат (БВК) - 1,0;
Пептон - 1,0,
NaCl - 0,25,
Тяжелая вода - 100.

Посевной материал выращивают в колбах емкостью 250 мл, содержащих 20 мл среды на качалке, дающей 240 - 260 об/мин при 34^oC в течение 24 ч. Посевной материал в количестве 4% переносят в ферментационную среду следующего состава, мас.%:
Глюкоза техническая - 12,0;
Источник ростовых факторов - автолизованная при 0,8 атм (в D₂O) дейтерий-меченная биомасса метилотрофных бактерий - 2,5,
NH₄NO₃ - 3,0,
MgSO₄ - 0,5,
Мел - 2,0,
Тяжелая вода - 100.

Доводят pH среды 7,0 - 7,2 с помощью 2N раствора KOH (в D₂O) перед стерилизацией и стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин.

Клетки штамма B.subtilis N B3157 засевают в титре 2•10⁷ клеток. мл. Процесс ферментации осуществляют в колбах емкостью 750 мл, содержащих 50 мл среды на качалке, дающей 240 - 260 об/мин, что соответствует скорости растворения кислорода 4,0-O₂ л/ч при 34^oC. После 7 суток ферментации в культуральной жидкости накапливается 8,2 г/л инозина, не менее 60% водорода (связи C-H), в котором замещены на дейтерий (данные ЯМР и МС).

По завершении ферментации клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 20 мин), культуральную жидкость, содержащую дейтерий-меченный инозин упаривают до объема в два раза меньше исходного. Белковые примеси удаляют, осаждая их 2-кратным избытком ацетона, удаляют ацетон упариванием в вакууме при 10 мм рт.ст. Осветление культуральной жидкости проводят адсорбцией на 5 г активированного угля. Затем осветленную культуральную жидкость упаривают в вакууме при 10 мм рт.ст. до сухого остатка. Инозин в виде кристаллов выделяют, осаждая его из насыщенного метанола.

Пример 2.

Культура, состав агаризованной среды, количество посевного материала и условия ферментации и выделение инозина из культуральной жидкости те же, что в примере 1. Отличие состоит в составе ферментационной среды, а именно дейтерий-меченная биомасса метилотрофных бактерий заменена на биомассу самого штамма-продуцента B. subtilis, полученную после ферментации на средах, максимально насыщенных оксидом дейтерия. Выход инозина после 7 суток ферментации такой же, как в примере 2.

Пример 3.

Состав агаризованной среды, количество посевного материала и условия ферментации те же, что и в примере 1. Отличие состоит в использовании в качестве продуцента тимидина штамма Bacillus amyloliquefaciens N B6843. При культивировании штамма B. amyloliquefaciens на такой среде образуется 3,0 г/л тимидина, меченного дейтерием, с содержанием D не менее 60%.

Таким образом, заявленный способ позволяет:
упростить процедуру получения дейтерий-меченных нуклеозидов и нуклеотидов, в том числе инозина и тимидина, сведя ее к ферментации и к непосредственному выделению нуклеозидов из среды;
сделать способ получения целевых продуктов экологически более чистым и радиационно безопасным за счет исключения радиоактивных изотопов, в частности трития.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов, заключающийся в том, что культивируют штаммы-продуценты нуклеозидов и нуклеотидов вида Bacillus subtilis и вида Bacillus amyloliquefaciens в полностью дейтерированной среде (D₂O). В качестве полностью дейтерированной среды используют гидролизаты выращенной на дейтероводе и дейтерометаноле биомассы штамма-продуцента нуклеозида, после отделения целевого продукта. Для производства D-меченного инозина используют штамм вила Bacillus subtilis, а для производства D-меченного тимидина используют штамм вида Bacillus amyloliquefaciens. Способ позволяет получать высокодейтерированные нуклеозиды, при этом 62,5% атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий. В.subtilis и В. amyloliquefaciens способны продуцировать и секретировать в ферментационную среду инозин и тимидин. Использование способа позволяет упростить процедуру получения дейтерий-меченных нуклеозидов, сведя ее к одной ферментации, а также сделать процесс получения конечных продуктов экологически более чистым за счет исключения ряда реакций с использованием вредных веществ и радиоактивных изотопов. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов, отличающийся тем, что культивируют штаммы-продуценты нуклеозидов и нуклеотидов вида Bacillus subtilis и вида Bacillus amyloliquefaciens в полностью дейтерированной среде (D₂O). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полностью дейтерированной среды используют гидролизаты выращенной на дейтероводе и дейтерометаноле биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полностью дейтерированной среды используют гидролизаты биомассы штамма-продуцента нуклеозида после отделения целевого продукта. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для производства D-меченного инозина используют штамм вида Bacillus subtilis NB3157. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для производства D-меченного тимидина используют штамм вида Bacillus amyloliquefaciens N В6843.