КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES, PSEUDOMONAS PSEUDOALKALIGENES, CORYNEBACTERIUM SPECIES, РАЗЛАГАЮЩИЙ ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ НЕФТИ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/38 C12R1/15 

Изобретение относится к промышленной микробиологии и может быть использовано в биотехнологической, нефтеперерабытывающей, химической, лакокрасочной промышленности, а также окрасочных производствах и представляет новый промышленный консорциум непатогенных штаммов бактерий Pseudomonas species-ВКПМ В6782, Pseudomonas pseudoalkaligines-BK M B6783, Corinebacterium species-КВПМ В6784, деструктор продуктов нефтепереработки, характеризующийся высокой эффективностью утилизации уайт-спирта, ксилолов, метилацетата, этилацетата и смеси этих продуктов.

Эффективность утилизации загрязнений в газовоздушных и водных потоках в значительной степени определяется свойствами промышленных штаммов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas species-Y13, выделенный по способности расти на о-ксилоле (см. И. Б. Уткин, М. М. Якимов и др. Деградация бензола, толуола и о-ксилола культурой Pseudomongas sp.Y13. Прикладная биохимия и микробиология. 1992. 28. N3, c. 367 370).

Недостатком этого штамма является его неспособность утилизировать м- и п-ксилол, а сольвент, являющийся одним из основных компонентов загрязнений газовоздушных выбросов и водных потоков лакокрасочной промышленности, состоит из смеси о-, м-, п-ксилола.

Известен консорциум микроорганизмов MKS₄, утилизирующий толуол, бензол и ксилол (см. Development of BioReVOC technology for tne avatement of air toxics: Keystone Symp. Mol. and Cell Biol. "Environ. Bioremediat. and Biodngradat. Lake Tahoe, Calif. March 6-12, 1993./Srivastava Kailash.//J. Cell Biocem. 1993. Suppl. C. p. 200).

Основным недостатком этого консорциума является низкая степень утилизации.

Наиболее близким аналогом предлагаемого консорциума является консорциум штаммов бактерий Pseudomonas sp. и Methylobacillus methanolovorus, разлагающий метилацетат.

Консорциум штаммов бактерий Pseudomonas sp. ВКМ-В1735Д и Methylobacillus methanolovorus ВКМ В-1447Д выращивали в периодических условиях культивирования на метилацетате с концентрацией 0,1 5,0 г/л в течение 9 50 ч, при этом степень деградации метилацетата составляла 1 100
При концентрации метилацетата 5,0 г/л оптимальное время культивирования 36 ч, когда достигается степень утилизации 100
Недостатком этого консорциума является низкая скорость роста для доcтижения полной утилизации метилацетата, кроме того, периодический режим культивирования представляет меньший интерес для промышленной реализации, чем непрерывный.

В настоящее время актуальной проблемой является снижение валовых выбросов загрязнений в окружающую среду.

Задача изобретения новый консорциум непатогенных штаммов бактерий, активно утилизирующий продукты нефтепереработки сольвент (смесь ксилолов), уайт-спирит, метилацетат, этилацетат.

Технический результат заключается в повышении степени утилизации продуктов нефтепереработки, утилизации высоких концентраций загрязнений водных и газо-воздушных потоков при непрерывном процессе биоочистки, способности к деструкции уайт-спирта, ксилолов, метилацетата, этилацетата и смеси этих продуктов.

Реализация биотехнологического способа очистки позволит резко сократить валовые выбросы загрязнений в окружающую среду при низких материальных затратах.

Предлагаемые новые штаммы бактерий выделены из промышленных стоков и селекционированы в лабораторных и камеральных условиях лабораторией "Технология промышленного биосинтеза" ГосНИИСинтезбелок. Для этого промышленные стоки, содержащие продукты нефтепереработки с концентрацией 0,5 - 1,0 вносили в качалочные колбы, содержащие жидкую минеральную среду следующего состава (среда 1):
(NH₄)H₂PO₄ 1 4 г/л
(NH₄)₂H₂PO₄ 0,5 2 г/л
K₂SO₄ 0,1 1 г/л
MgSO₄ 0,1 1 г/л
MnSO₄•5H₂O 10 100 мг/л
(NH₄)₂MoO₄ 10 100 мг/л
Температура 25 35^oC;
pH 5-8;
Время выращивания 4 12 сут
Число оборотов качалки 180 200 об/мин
После шести пассажей в новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой (сусло + 0,1 0,2 продуктов нефтепереработки) и отбирали изолированные колонии (изоляты). Полученные таким образом 5 изолятов были исследованы в условиях проточного культивирования в аэробных условиях с интенсивным массообменом на минеральной среде 1 с продуктами нефтепереработки при их концентрации 1,0 1,5 при скорости протока 0,15 - 0,25 ч^-1, что позволило выделить три штамма бактерий, обозначенных в музейной коллекции института под номерами ВСБ-9; ВСБ-10; ВСБ-11.

Определение систематического положения отобранных штаммов ВСБ-9; ВСБ-10; ВСБ-11, проведенное в соответствии с определителем бактерий Берги (Bergey's Manual of Systematic Bacteriologi//9-th. e Baltimore, London, Los Angeles. Sydney Vol. 1. 1984; vol. 2, 1986; vol. 3. 1989; vol. 4. 1989), их принадлежность к Pseudomonas species- ВСБ-9, Pzeudomonas pseudoalkaligrines- ВСБ-10, Corinebacterium species- ВСБ-11.

Проведенные исследования патогенности селекционированных штаммов ВСЕ-9; ВСБ-10; ВСБ-11 подтвердили отсутствие их патогенности.

Морфологические признаки Pseudomonas srecies ВСБ-9.

Клетки трехсуточной культуры, выращенной на МПА, имеют вид прямых палочек одиночных или парных, длиной 1,0 3,0 мкм, шириной 0,8 мкм, подвижные, один жгутик, расположенный полярно.

Морфологические признаки Pseudomonas pseudoalkaligines ВСБ-10.

Клетки трехсуточной культуры, выращенной на МПА, имеют вид прямых палочек одиночных или парных, длиной 2,5 4,0 мкм, шириной 0,5 мкм, подвижные, один жгутик, расположенный полярно.

Морфологические признаки Corinebasterum species ВСБ-11.

Клетки трехсуточной культуры, выращенной на МПА, имеют вид слегка изогнутых одиночных палочек длиной 2,5 4,5 мкм, шириной 0,6 мкм, имеется "угловое" расположение клеток по отношению друг к другу, эндоспоры не образует, клеточная стенка содержит мезо-ДАБ, арабинозу, миколовые кислоты.

Культуральные признаки Pseudomonas species ВСБ-9.

Штамм образует округлые колонии размером 2 9 мм, выпуклого профиля, гладкие, блестящие, белые с гладким краем, однородной структурой, мягкой консистенцией.

Культуральные признаки Pseudomonas pseudoalkaligines ВСБ-10.

Штамм образует округлые колонии размером 3 8 мм, выпуклого профиля, гладкие, блестящие, светло-коричневые с гладким краем, однородной структурой, мягкой консистенцией.

Культуральные признаки Corinebacterum srecies ВСБ-11.

Штамм образует округлые, с фестончатым краем, колонии размером 2 5 мм, бугристого профиля, морщинистой поверхностью, матовые с блеском по краю, белые, край волнистый, структура однородная, консистенция тягучая.

Физико-биохимические признаки Psecdomonas species BCE-9.

Грамм-отрицательный аэроб, тип метаболизма-дыхательный, обладает каталазной и оксидазной активностью, не обладает нитрогеназной активностью, не использует метан в качестве единственного источника углерода, не окисляет этанол до уксусной кислоты, отсутствует потребность в NaCl и в факторах роста, не выделяет при росте H₂S, отсутствует подавление роста хлористым тетразолием в концентрации 0,1
Физиолого-биохимические признаки Pseudomonas psedoalkaligines ВСБ-10.

Грамм-отрицательный аэроб, тип метаболизма-дыхательный, обладает каталазной и оксидазной активностью, не использует для роста глюкозу, фруктозу, сорбит, лактозу, сахарозу, арабинозу, не гидролизует крахмал, слабо гидролизует желатину, не образует флуоресцирующий пигмент, не способна накапливать в клетках поли-бета-гидрооксибутират, не способна осуществлять процесс денитрификации.

Физико-биохимические признаки Corinebacterium species ВСБ-11.

Грамм-положительный, аэроб, типа метаболизма-дыхательный, обладает каталазной активностью, не образует кислоты из глюкозы.

Кариологические, генотаксономические и маркерные признаки штаммов бактерий Pseudomonas species ВСБ-9, Pseudomonas pseudoalkaligines ВСБ-10, Corinebacterium species ВСБ-11 не излучались.

Штамм Pseudomonas species ВСБ-9 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером ВКПМ -6782.

Штамм Pseudomona pseudoalkaligines ВСБ-10 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером ВКПМ В-6783.

Штамм Corinebacterium species ВСБ-11 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером ВКПМ В-6784.

Получение консорциума.

Консорциум состоит из клеток, относящихся к трем следующим видам бактерий Pseudomonas species, Pseudomonas pseudoalkaliganes, Corinebacterium species, выделенных из технологических стоков лакокрасочного производства в Украинской республике, адаптированных и селекционированных в лабораторных и камеральных условиях на минеральной среде 1 с 0,8 1,0 об./об. продуктов переработки нефти.

Доминирующим компонентом консорциума является Pseudomonas species, тип взаимодействия между штаммами в консорциуме симбиотический.

Консорциум может быть составлен из суспензии клеток при равной плотности суспензии при соотношении 3 1 1 соответственно.

Условия хранения консорциума и составляющих его штаммов.

Консорциум хранят на жидкой синтетической среде 1 при температуре 4^oC, производя пересев один раз в три недели. Лабораторные культы поддерживаются на косяках МПА с 0,5 об./об. продуктов переработки нефти и пересеваются раз в два месяца.

Штаммы бактерий Pseudomonas species-ВКПМ В 6782, Pseudomonas pseudoalkaligines-ВКПМ В 6783, Corinebacterium species-ВКПМ В 6784 хранятся лиофильно высушенными в коллекции института ГосНИИсинтезбелок, свойства штаммов при этом устойчивы.

Предлагаемый консорциум штаммов бактерий был испытан в камеральных условиях при непрерывном режиме в ферментере объемом 10 л на минеральной среде 1, в которой источником углерода служили продукты переработки нефти - сольвент, уайт-спиринт, этилацетат, метилацетат.

Температура выращивания 25 35^oC
pH среды 6,5 7,0
Скорость потока 0,25 ч^-1
Обороты мешалки 1000 об/мин
Расход воздуха 1 об./об. мин
Получение засевной биомассы.

Засевную биомассу готовили, выращивая консорциум бактерий в качалочных колбах на минеральной среде 1 в течение двух суток, источником углерода служила смесь продуктов переработки нефти в равных соотношениях с концентрацией 1
Для сравнительной оценки были проведены исследования с известным консорциумом бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobacillus methanolovorus ВКМ В-1447Д. Культивирование проводили в непрерывном режиме в ферментере 10 л при следующих условиях:
Температура выращивания 28 32^oC
pH среды 6,8 7,2
Скорость протока 0,25 ч^-1
Обороты мешалки 1000 об/мин
Расход воздуха 1 об./об. мин
На среде следующего состава, г/л:
(NH₄)H₂PO₄ 1,0
K₂HPO₄ 1,0
MgSO₄•7H₂O 0,2
FeSO₄•7H₂O 0,004
NaCl 5,0 г/л (среда "Д").

В качестве источника углерода служил метилацетат, сольвент, уайт-спирит. Результаты исследований представлены в таблице.

Пример 1. Консорциум бактерий Pseudomonas species-ВКПМ В 6732, Pseudomonas pseudoalkaligines-ВКПМ В 6783, Corinebacterium species-ВКПМ В 6784 при соотношении 3 1 1 культивировали в непрерывном режиме в ферментере объемом 10 л на среде 1 при температуре выращивания 28 30^oC; pH среды 65 7,0; скорость потока 0,25 ч^-1; обороты мешалки 1000 об/мин; расход воздуха 1 об./об. мин, субстрат-метилацетат в концентрациях 5,0 8,0 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации метилацетата составила 97 98
При тех же условиях было приведено культивирование консорциума бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobaccillus methanolovorus ВКМ В-1447Д (известный) на минеральной среде "Д", в качестве субстрата использовали метилацетат в концентрации 3,0 5,0 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации метилацетата составила 85 90
Полученные данные показывают, что консорциум (известный) в непрерывных культивированиях менее устойчив, чем предлагаемый консорциум, утилизирует более низкие концентрации метилацетата и с меньшей эффективностью.

Пример 2. Предлагаемый консорциум бактерий выращивали при тех же условиях, что в примере 1, но субстратом служил этилацетат в концентрациях 10 15 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Ступень утилизации достигла 97
Консорциум бактерий (известный) выращивали при тех же условиях, что в примере 1, но субстратом служил этилацетат в концентрациях 10 -15 г/л. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации составила 82 92
Большая эффективность и стабильность утилизации этилацетата новым консорциумом обусловлена способностью разлагать субстрат при высоких скоростях протока.

Пример 3. Предлагаемый консорциум бактерий выращивали при тех же условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали сольвент в концентрациях 10 15 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации достигала 98
Консорциум бактерий (известный) на сольвенте не растет.

Пример 4. Предлагаемый консорциум бактерий выращивали при тех условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали уайт-спирт в концентрациях 10 15 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации достигла 95 98
Консорциум бактерий (известный) на уайт-спирте не растет.

Пример 5. Предлагаемый консорциум бактерий выращивали при тех же условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали смесь продуктов нефтепереработки в равных количественных соотношениях. Концентрация смеси к протоку составляла 5,0 12,0 г/л. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации достигла 95 98
Консорциум бактерий (известный) выращивали при тех же условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали смесь продуктов нефтепереработки в равных количественных соотношениях. Концентрация смеси в протоку составляла 4,0 6,0 г/л. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации 21 23
Низкая степень утилизации по сравнению с предлагаемым консорциумом обусловлена тем, что консорциум (известный) утилизирует из смеси только этилацетат и метилацетат, а сольвент его инкубирует.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый консорциум бактерий Pseudomonas species-ВКПМ В 6782, Pseudomonas pseudoalkaligines-ВКПМ В 6783, Corinebacterium species-ВКПМ В 6784 является новым углеводассимилирующим консорциумом, характеризующимся отличительными признаками от известного консорциума бактерий Psecdomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobacillus methanolovorus ВКМ В-1447Д тем, что:
активно растет в непрерывных условиях на питательной сере с высокой концентрацией метилацетата, обеспечивая степень утилизации 98
активно растет на этилацетате, стабильно обеспечивая степень утилизации 97
активно растет на сольвенте и уайт-спирите, обеспечивая степень утилизации 95 98
активно растет на смеси углеводородов, обеспечивая степень утилизации 95 98
конкурентоспособен, доминируя в биоценозе биоабсорбера или биофильтра.

Полученный консорциум используется в процессах биоочистки вентиляционных выбросов лакокрасочного и окрасочного производства.

Использование: относится к технической микробиологии. Сущность изобретения: представляет собой новый промышленный непатогенный консорциум штаммов бактерий Pseudomonas species, Pseudomonas pseudoalaligines, Corynebacterium species, ассимилирующий продукты переработки нефти, такие как уайт-спирт, ксилолы, метилацетат, этилацетат со степенью утилизации 85 - 98 %. Предлагаемый новый консорциум выделен и селекционирован из промышленных стоков при соотношении штаммов 3 : 1 : 1. 1 табл.

Консорциум штаммов бактерий Pseudomonas species ВКПМ В-6782, Pseudomonas pseudoalkaligenes ВКПМ В-6783, Corynebacterium species ВКПМ В-6784, разлагающий продукты переработки нефти.