КОНСОРЦИУМ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES SPECIES И PSEUDOMONAS SPECIES, РАЗЛАГАЮЩИЙ ПРОДУКТЫ ФЕНОЛФОРМАЛЬДЕГИДНОГО РЯДА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/05 C12R1/38 

Предлагаемое изобретение относится к области промышленной микробиологии и может быть использовано в биотехнологической, нефтеперерабатывающей, химической, лакокрасочной промышленности, а также окрасочных производствах и представляет новый промышленный консорциум непатогенных штаммов бактерий Alcaligenes species-ВКПМ В-7003 и Pseudomonas species ВКПМ В-7004, деструктор продуктов фенолформальдегидного ряда, характеризующийся высокой эффективностью утилизации фенола, формальдегида, метилацетата, меркаптанов и смеси этих продуктов.

Эффективность утилизации загрязнений в газовоздушных и водных потоках в значительной степени определяется свойствами промышленных штаммов.

Известен консорциум бактерий, утилизирующий фенол и метанол (Выделение комплексов бактерий - деструкторов фенола и метанола. Н.Е. Березкина, С.П. Григорьева, Е. А. Андреевская и др. Прикладная биохимия и микробиология. 1992, 28 , N 4, с. 565 - 570).

Недостатком этого консорциума является его неспособность утилизировать меркаптаны, являющиеся одним из основных компонентов при дезодорации газовоздушных выбросов и водных потоков, а также невысокие концентрации фенола в среде при его утилизации.

Наиболее близким аналогом предлагаемого консорциума является консорциум штаммов бактерий Pseudomonas sp. и Methylobacillus methanolovorus, разлагающий метилацетат (а.с. СССР N 1687608 от 28.08.89).

Консорциум штаммов бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobacillus methanolovorus ВКМ В-1447Д (прототип) выращивали в периодических условиях культивирования на метилацетате с концентрацией 0,1 - 5,0 г/л в течение 9 - 50 ч, при этом степень деградации метилацетата составляла 0 - 100%.

При концентрации метилацетата 5,0 г/л оптимальное время культивирования - 36 ч, когда достигается степень утилизации 100%.

Недостатком этого консорциума является низкая скорость роста для достижения полной утилизации метилацетата, кроме того, периодический режим культивирования представляет меньший интерес для промышленной реализации, чем непрерывный.

В настоящее время актуальной проблемой является снижение валовых выбросов загрязнений в окружающую среду.

В связи с этим задача предлагаемого изобретения - новый консорциум непатогенных штаммов бактерий, активно утилизирующий продукты фенолформальдегидного ряда - фенол, формальдегид, меркаптаны и метилацетат.

Технический результат заключается в повышении степени утилизации продуктов фенолформальдегидного ряда, утилизации высоких концентраций загрязнений водных и газовоздушных потоков при непрерывном процессе биоочистки, способность к деструкции фенола, формальдегида, меркаптанов, метилацетата и смеси этих продуктов.

Реализация биотехнологического способа очистки позволит резко сократить валовые выбросы загрязнений в окружающую среду при низких материальных затратах.

Предлагаемые новые штаммы бактерий выделены из промышленных стоков и селекционированы в лабораторных и камеральных условиях лабораторией "Технология промышленного биосинтеза" ГосНИИсинтезбелок. Для этого промышленные стоки, содержащие продукты фенолформальдегидного ряда с концентрацией 0,5 - 1,0%, вносили в качалочные колбы, содержащие жидкую минеральную среду (среда 1) следующего состава:
(NH₄)H₂PO₄ - 1 - 4 г/л;
(NH₄)₂H₂PO₄ - 0,5 - 2 г/л;
K₂SO₄ - 0,1 - 1 г/л;
MgSО₄ - 0,1 - 1 г/л;
MnSO₄5H₂O - 10 - 100 мг/л;
(NH₄)₂MoO₄ - 10 - 100 мг/л.

Температура 25 - 35^oC; pH 5 - 8. Время выращивания 4 - 12 сут. Число оборотов качалки 180 - 200 об/мин.

После шести пассажей в новую питательную среду из культурной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой (сусло + 0,1 - 0,2% продуктов фенолформальдегидного ряда) и отбирали изолированные колонии (изоляты). Полученные таким образом 7 изолятов были исследованы в условиях проточного культивирования в аэробных условиях с интенсивном массообменом на минеральной среде 1 с продуктами фенолформальдегидного ряда при их концентрации 1,0 - 1,5% при скорости протока 0,15 - 0,25 ч^-1, что позволило выделить два штамма бактерий, обозначенных в музейной коллекции института под номерами ВСБ-13; ВСБ-14.

Определение систематического положения отобранных штаммов ВСБ-13; ВСБ-14, проведенное в соответствии с определителем бактерий Берги (Bergey s Manual of Systematic Bacteriologi//gth.ed. Baltimore, London, LosAngeles, Sydney, vol. 1, 1984; vol. 2, 1986; vol. 3, 1989; vol. 4, 1989), их принадлежность к: Alcaligenes species- ВСБ-13; Pseudomonas species- ВСБ-14.

Проведение исследования патогенности селекционированных штаммов ВСБ-13; ВСБ-14 подтвердили отсутствие их патогенности.

Морфологические признаки Alcaligenes species ВСБ-13.

Клетки трехсуточной культуры, выращенной на МПА, имеют вид прямых палочек одиночных или парных, размером 0,7 - 1,3 • 0,8 - 2,7 мкм, подвижные, один жгутик, расположенный полярно.

Морфологические признаки Pseudomonas species ВСБ-14.

Клетки трехсуточной культуры, выращенной на МПА, имеют вид прямых палочек одиночных или парных, размером 0,5 - 1,0 • 1,8 - 4,2 мкм, подвижные, один жгутик, расположенный полярно.

Культуральные признаки Alcaligenes species ВСБ-13.

Штамм образует округлые колонии размером 2 - 4 мм, выпуклого профиля, блестящие до матовых, белые с розовым оттенком, с ровным краем, однородной структурой, мягкой консистенцией.

Культуральные признаки Pseudomonas species ВСБ-14.

Штамм образует округлые колонии размером 2 - 3 мм, выпуклого профиля, блестящие, бесцветные, с гладким краем, однородной структурой, мягкой консистенцией.

Физиолого-биохимические признаки Alcaligenes species ВСБ-13.

Грамотрицательный аэроб, тип метаболизма - дыхательный, обладает каталазной и оксидазной активностью, не использует для роста глюкозу, фруктозу, сорбит, лактозу, сахарозу, арабинозу, не гидролизует крахмал, слабо гидролизует желатину, не образует флуоресцирующий пигмент, не способна накапливать в клетках поли-β-гидроксибутират, не способна осуществлять процесс денитрификации.

Физиолого-биохимические признаки Pseudomonas species ВСБ-14.

Грамотрицательный аэроб, тип метаболизма - дыхательный, обладает каталазной и оксидазной активностью, не обладает нитрогеназной активностью, не использует метан в качестве единственного источника углерода, не окисляет этанол до уксусной кислоты, отсутствует потребность в NaCl и в факторах роста, не выделяет при росте H₂S, отсутствует подавление роста хлористым тетразолием в концентрации 0,1%.

Кариологические, генотаксономические и маркерные признаки штаммов бактерий Alcaligenes species ВСБ-13, Pseudomonas species ВСБ-14 не излучались.

Штамм Alcaligenes species ВСБ-13 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером ВКПМ В-7003.

Штамм Pseudomonas species ВСБ-14 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером ВКПМ В-7004.

Получение консорциума.

Консорциум состоит из клеток, относящихся к двум следующим видам бактерий - Alcaligenes species, Pseudomonas species, выделенных из технологических стоков нефтеперерабатывающего производства на Украине, адаптированных и селекционированных в лабораторных и камеральных условиях на минеральной среде 1 с 0,8 - 1,0% об/об продуктов фенолформальдегидного ряда.

Доминирующим компонентом консорциума является Pseudomonas species, тип взаимодействия между штаммами в консорциуме симбиотический.

Консорциум может быть составлен из суспензии клеток при равной плотности суспензии в соотношении 1 : 2 соответственно.

Условия хранения консорциума и составляющих его штаммов. Консорциум хранят на жидкой синтетической среде 1 при температуре 4^oC, производя пересев один раз в три недели. Лабораторные культуры поддерживаются на косяках МПА с 0,5% об/об продуктов фенолформальдегидного ряда и пересевается раз в два месяца.

Штаммы бактерий Alcaligenes species - ВКПМ B-7003 и Pseudomonas species - ВКПМ B-7004 хранятся лиофильно высушенными в коллекции института ГосНИИсинтезбелок, свойства штаммов при этом устойчивы.

Предлагаемый консорциум штаммов бактерий был испытан в камеральных условиях при непрерывном режиме в ферментере объемом 10 л на минеральной среде 1, в которой источником углерода служили продукты фенолформальдегидного ряда - фенол, формальдегид, меркаптаны, метилацетат.

Температура выращивания - 25 - 35^oC; pH среды - 6,5 - 7,0; скорость протока - 0,25 ч^-1; обороты мешалки - 1000 об/об; расход воздуха - 1 об/об мин.

Получение засевной биомассы.

Засевную биомассу готовили, выращивая консорциум бактерий в качалочных колбах на минеральной среде 1 в течение 2 сут., источником углерода служила смесь продуктов фенолформальдегидного ряда в равных соотношениях с концентрацией 1%.

Для сравнительной оценки были проведены исследования с известными консорциумом бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobacillus methanolovorus ВКМ B-1447Д. Культивирование проводили в непрерывном режиме в ферментере 10 л при следующих условиях: температура выращивания 28 - 32^oC; pH среды 6,8 - 7,2; скорость протока - 0,25 ч^-1; обороты мешалки 1000 об/мин; расход воздуха - 1 об/об мин.

На среде ( среда "Д") следующего состава:
(NH₄)H₂PO₄ - 1,0 г/л;
K₂HPO₄ - 1,0 г/л;
MgSO₄7H₂O - 0,2 г/л;
FeSO₄7H₂O - 0,004 г/л;
NaCl - 5,0 г/л.

В качестве источника углерода служил метилацетат, фенол, формальдегид, меркаптаны.

Пример 1. Консорциум бактерий Alcaligenes species ВКПМ В-7003 и Pseudomonas species ВКПМ В-7004 в соотношении 1 : 2 культивировали в непрерывном режиме в ферментере объемом 10 л на среде 1 при температуре выращивания 28 - 30^oC; pH среды 6,5 - 7,0; скорость протока 0,25 ч^-1; обороты мешалки 1000 об/мин; расход воздуха 1 об/об мин, субстрат - метилацетат в концентрациях от 5,0 до 8,0 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации метилацетата составила 97 - 98%.

При тех же условиях было проведено культивирование консорциума бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobacillus methanolovorus ВКМ В-1447Д (прототип) на минеральной среде "Д", в качестве субстрата использовали метилацетат в концентрации от 3,0 до 5,0 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации метилацетата составила 85 - 90%.

Полученные данные показывают, что консорциум (прототип) в непрерывных условиях культивирования менее устойчив, чем заявляемый консорциум, утилизирует более низкие концентрации метилацетата и с меньшей эффективностью.

Пример 2. Заявляемый консорциум бактерий выращивали при тех же условиях, что в примере 1, но субстратом служил фенол в концентрациях от 1,0 до 1,5 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации достигла 97%.

Консорциум бактерий (прототип) выращивали при тех же условиях, что в примере 1, но субстратом служил этилацетат в концентрациях от 1,0 до 1,5 г/л. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации составила 8 - 9%.

Большая эффективность и стабильность утилизации этилацетата новым консорциумом обусловлена адаптированностью к субстрату.

Пример 3. Заявляемый консорциум бактерий выращивали при тех же условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали формальдегид в концентрациях от 10 до 15 г/л к протоку.

Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации достигала 98%.

Консорциум бактерий (прототип) на формальдегиде не растет.

Пример 4. Заявляемый консорциум бактерий выращивали при тех же условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали меркаптаны в концентрациях от 1,0 до 1,5 г/л к протоку. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации достигала 95 - 98%.

Консорциум бактерий (прототип) на меркаптанах не растет.

Пример 5. Заявляемый консорциум бактерий выращивали при тех же условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали смесь продуктов фенолформальдегидного ряда в равных количественных соотношениях. Концентрация смеси к протоку составляла от 5,0 до 12,0 г/л. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации достигала 95 - 98%.

Консорциум бактерий (прототип) выращивали при тех же условиях, что в примере 1, в качестве субстрата использовали смесь продуктов нефтепереработки в равных количественных соотношениях. Концентрация смеси к протоку составляла от 4,0 до 6,0 г/л. Длительность процесса 4 сут. Степень утилизации 8 - 10%.

Низкая степень утилизации по сравнению с заявляемым консорциумом обусловлена тем, что консорциум (прототип) утилизирует из смеси только метилацетат, а остальные его ингибируют.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый консорциум бактерий Alcaligenes species ВКПМ В-7003 и Pseudomonos species ВКПМ В-7004 является новым углеводородассимилирующим консорциумом, характеризующимся отличительными признаками от прототипа консорциума бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobacillus methanolovorus ВКМ В-1447Д тем, что
активно растет в непрерывных условиях на питательной среде с высокой концентрацией метилацетата, обеспечивая степень утилизации 98%;
активно растет на феноле, стабильно обеспечивая степень утилизации 97%;
активно растет на формальдегиде и меркаптанах, обеспечивая степень утилизации 95 - 98%;
активно растет на смеси углеводородов, обеспечивая степень утилизации 95 - 98%;
конкурентноспособен, доминируя в биоценозе биоабсорбера или биофильтра.

Полученный консорциум используется в процессах биоочистки вентиляционных выбросов лакокрасочного и окрасочного производств, а также в производстве смол.

Изобретение представляет новый консорциум штаммов бактерий Alcaligenes species ВКПМ В-7003 и Pseudomonas species ВКПМ В-7004, ассимилирующий продукты фенолформальдегидного ряда: фенол, формальдегид, меркаптаны, метилацетат со степенью утилизации 85 - 98%. Консорциум выделен и селекционирован из промышленных стоков, соотношение штаммов 1 : 2. Технический результат использования предлагаемого консорциума бактерий - увеличение эффективности утилизации метилацетата, кроме того, показана возможность активного роста на феноле, формальдегиде и меркаптанах.

Консорциум штаммов бактерий Alcaligenes species ВКПМ В-7003 и Pseudomonas species ВКПМ В-7004, разлагающий продукты фенолформальдегидного ряда.