ОСНОВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к основе питательных сред, получаемой из молочной сыворотки. Такая основа может быть использована в технологии микробиологического синтеза:
- преимущественно незаменимых аминокислот (в особенности L-лизина, а также треонина, триптофана, лейцина, валина, пролина),
- антибиотиков (например : окситетрациклина и тетрациклина) и
- витаминов (например, рибофлавина),
а также в производстве предпочтительно пекарских дрожжей.

Потребность в указанных продуктах микробиологического синтеза весьма велика. Поэтому к сырью для осуществления технологических процессов их производства предъявляют комплекс систематически ужесточающихся трудносовместимых требований.

Действительно, весьма желательно, чтобы используемое сырье было:
- в существенной степени сбалансировано по качественному и количественному составу питательных веществ, необходимых и достаточных для эффективного культивирования микроорганизмов и поэтому наиболее полно усвояемых в процессах микробиологического синтеза;
- доступным для использования в промышленных масштабах;
- практически нетоксичным не только для культивируемых микроорганизмов, но и для производственного персонала и потребителей конечных продуктов, если остатки питательных сред входят в качестве составной части в целевые продукты;
- термостабильным и, соответственно, допускающим термическую стерилизацию;
- как можно более гомогенным.

Раздельное выполнение указанных требований или некоторых из их частичных сочетаний не представляет существенных затруднений.

Действительно, широко известно использование белково-витаминного концентрата (БВК, или паприна) в качестве полноценной по комплексу ростовых веществ основы питательных сред для культивирования микроорганизмов-продуцентов аминокислот, витаминов и протеолитических ферментов (см., например, соответственно: 1. Бекер В.Ф., Бекер М.Е. Лизин микробного синтеза - Рига: Зинатне, 1974, с. 37-38; 2. Панкова Т.А. Применение кислотного гидролизата БВК при производстве лизина//Микробиологическая промышленность, 1983, N 3, с.9).

Однако БВК, полученный микробиологическим синтезом с использованием грибков рода Candia, культивируемых на парафинах нефти, в условиях систематического роста цен на энергоносители становится все менее доступным для промышленного микробиологического синтеза аминокислот. Кроме того, БВК весьма опасен как аллерген для промышленного персонала, пожаро- и взрывоопасен при транспортировке и хранении и, наконец, служит источником трудноудаляемых балластных примесей в целевых продуктах типа содержащих аминокислоты кормовых добавок.

Если же учесть, что синтез БВК сам по себе чрезвычайно экологически опасен, то ясно, что в качестве питательных сред для культивирования микроорганизмов следует использовать материалы из более безопасных и легче возобновляемых источников.

Примером такого материала может служить кукурузный экстракт, получаемый из замочных вод при переработке кукурузного зерна на крахмал (см., например, уже упомянутую книгу Бекер В.Ф. и Бекер М.Е., с.36). Этот экстракт, как и БВК, может служить полноценной по комплексу ростовых веществ (и более богатой витаминами) основой питательных сред для культивирования микроорганизмов-продуцентов аминокислот, витаминов и протеолитических ферментов.

Однако он, как правило, обильно инфицирован вульгарной микрофлорой (см., например, Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей. Справочник - М.: Агропромиздат, 1990, с.58) и содержит крупные (до 3 мм в поперечнике) взвешенные частицы, что затрудняет его стерилизацию. Кроме того, доля кукурузного экстракта в суммарном объеме производства крахмало-паточной промышленности невелика и его выпуск не в состоянии покрыть потребности микробиологической и пищевой промышленности.

Поэтому проблема надежного обеспечения микробиологических производств сырьем остается достаточно острой.

Одним из направлений ее решения может служить использование отходов молочного производства в виде молочной сыворотки, получаемой при изготовлении творога и сыров. Эта сыворотка содержит до 6% по массе сухих веществ, в том числе до 4% дисахарида (лактозы), от 0,6 до 1% белков (молочных протеинов: альбуминов, казеина) и свойственный молоку комплекс минеральных солей и витаминов (см. , например, Ростроса Н.К. Справочник по цельномолочному производству - М.: Пищевая промышленность, 1976).

Однако в исходном виде эта сыворотка содержит до 94% воды, что делает нецелесообразным ее транспортировку и прямое использование в качестве источника питательных веществ для культивирования микроорганизмов. Кроме того, содержащиеся в ней лактоза и протеины в исходном виде могут быть усвоены лишь некоторыми промышленными штаммами микроорганизмов.

Поэтому ее обычно подвергают дополнительной переработке.

Один из вариантов такой переработки предусматривает выделение молочного белка ("альбуминного молока") из исходной сыворотки, частичный гидролиз альбуминов с использованием 3% соляной кислоты или 30% уксусной кислоты, или протеолитического фермента (а именно - препарата "Протосубтилин ГЗх") и использование гидролизата в качестве основы питательных сред для культивирования микроорганизмов-продуцентов аминокислот (см. Межиня Г.Р., Яковича В.Т., Дунце М.Э. и Лиепиньш Г.К. Использование альбуминного молока при биосинтезе аминокислот//Продуценты аминокислот и ферментов - Рига: Зинатне, 1978, с. 80-85).

Однако описанный гидролизат в сравнении с исходной молочной сывороткой существенно обеднен такими питательными веществами, как сахара, витамины, минеральные соли и микроэлементы, что вынуждает впоследствии существенно обогащать ими питательные среды из других источников. Кроме того, кислотный гидролиз белка дает низкий выход свободных аминокислот, а при использовании уксусной кислоты целевой продукт перенасыщается продуктами ее нейтрализации. Ферментативный же гидролиз протосубтилином ГЗх, который представляет собой неочищенный от спор препарат Bacillus subtilis, приводит к загрязнению питательных сред на основе "альбуминного молока" термоустойчивой микрофлорой.

Поэтому в производстве основных питательных сред для культивирования микроорганизмов предпочтительно использование концентратов молочной сыворотки, например, содержащих 40-60% сухих веществ (см., в частности: ТУ 49-195-72) или имеющих остаточную влажность не более 5% (см. ТУ 49-189-72).

Из числа известных основ такого типа к предлагаемой по технической сущности наиболее близка основа питательных сред для культивирования микроорганизмов - с целью микробиологического синтеза L-лизина) по патенту Франции 2526808.

Эта основа представляет собой частичный гидролизат концентрированной молочной сыворотки, который получен с использованием действующих на углеводороды ферментов (например, бета-галактозидазы).

Такие ферменты преобразуют дисахарид (лактозу) в смесь моносахаридов (глюкозу и галактозу), присутствующую в целевом продукте и на фоне неизмененных протеинов, минеральных солей и витаминов.

Соответственно, при культивировании микроорганизмов в жидких питательных средах, приготовленных на основе указанного гидролизата, существенно повышается лишь усвояемость углерода из углеводных источников. Усвоение же питательных веществ протеинов возможно постольку, поскольку культивируемые штаммы способны их самостоятельно ассимилировать. Следует отметить, что большинство промышленных штаммов-продуцентов аминокислот и витаминов и некоторые штаммы-продуценты антибиотиков не содержат протеолитических ферментов и потому утилизируют лишь свободные аминокислоты и олигопептиды, концентрация которых в указанном гидролизате незначительна.

В связи с изложенным в основу изобретения положена задача путем усовершенствования гидролизата концентрированной молочной сыворотки создать такую основу питательной среды для культивирования микроорганизмов, которая была бы наиболее полно усвояемой в процессах микробиологического синтеза.

Поставленная задача решена тем, что основа питательной среды для культивирования микроорганизмов, представляющая собой гидролизат концентрированной молочной сыворотки, согласно изобретению представляет собой гидролизат, который получен глубоким кислотным гидролизом указанной сыворотки в присутствии 2,0-5,0N минеральной кислоты при температуре 90-125^oC в течение от 12 до 1 ч.

Этот гидролизат содержит по существу смесь аминокислот и моносахаридов с примесью обычных для указанного сырья витаминов и солей минеральных и органических кислот. Тем самым усвояемость практически всех питательных веществ молочной сыворотки культивируемыми микроорганизмами существенно повышается.

Первое дополнительное отличие состоит в том, что гидролизат получен в присутствии 2,0-4,0N серной кислоты, что наиболее предпочтительно и в технологическом, и в потребительском аспектах. Действительно, серная кислота может быть введена в указанное сырье в высококонцентрированном (до 96%) виде, что позволяет получить более насыщенный питательными веществами целевой продукт. Далее, низкая летучесть серной кислоты практически исключает потребность в улавливании ее паров в процессе гидролизата. И, наконец, получаемые при нейтрализации серной кислоты соли (в особенности - сульфат аммония) обычно легче усваивается большинством культивируемых микроорганизмов.

Далее сущность изобретения поясняется:
- конкретными данными о качественном и количественном составе предлагаемой основы питательной среды для культивирования микроорганизмов.

- подробным описанием способа ее получения с конкретными примерами его осуществления и
- результатами испытаний основы питательных сред согласно изобретению в процессах микробиологического синтеза.

Усредненные данные о качественном и количественном составе предлагаемой основы приведены в табл. 1 в сравнении с данными для наиболее полноценных по комплексу питательных веществ аналогичных основ питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Как видно из табл. 1, предложенная основа, уступая гидролизату БВК по суммарной концентрации аминокислот и по концентрации большинства отдельно взятых аминокислот, существенно превосходит гидролизат БВК по наличию легко усвояемых микроорганизмами-продуцентами моносахаридов. При этом кажущееся преимущество гидролизата БВК в сравнении с гидролизатом согласно изобретению по содержанию аминокислот "нейтрализуется" почти вдвое большим содержанием сульфата аммония. Поэтому гидролизат БВК при введении в питательные среды для культивирования микроорганизмов приходится существенно разбавлять.

Если же учесть, что БВК сам по себе является дорогостоящим продуктом микробиологического синтеза и что такой синтез БВК экологически весьма опасен, то ясно, что утилизация (также экологически опасной в чистом виде) молочной сыворотки обеспечивает заметные преимущества.

В общем случае способ изготовления предложенной основы питательной среды для культивирования микроорганизмов заключается в следующем.

В исходном концентрате молочной сыворотки на основе паспортных данных или по результатам дополнительного лабораторного анализа определяют сухой остаток и, если необходимо, доводят его до примерно 40% по массе (поскольку сухой концентрат молочной сыворотки гидролизовать невозможно, а концентраты с большим чем 40% содержанием сухого остатка технологически неудобны из-за низкой текучести).

Указанное возможное разбавление сырья можно проводить как перед приготовлением, так и в процессе приготовления кислых рабочих растворов для гидролиза.

Далее с соблюдением общеизвестных правил безопасности приготавливают упомянутые кислые рабочие растворы на основе сильной минеральной (предпочтительно соляной или, что особенно предпочтительно, серной) кислоты с таким расчетом, чтобы нормальность находилась в интервале 2,0-5,0N (а для серной кислоты - в более узком интервале 2,0-4,0N).

Затем комплекс молочных протеинов и галактозу, содержащиеся в приготовленных кислых рабочих растворах, совместно подвергают глубокому гидролизу при температуре 90-125^oC в течение от 12 до 1 ч, то есть тем быстрее, чем выше температура.

Описанный способ существенно отличается от известного (см., например Гауровиц Ф. Химия и функции белков. - М.: МИР, 1965, с.36-40) способа полного гидролиза протеинсодержащих материалов в среде 6N соляной кислоты при кипячении проб в запаянных стеклянных ампулах в течение 72 ч для аналитических нужд. Эти отличия касаются прежде всего условий гидролиза (температура, отсутствие кислорода, кислотность среды, длительность, использование только HCl как катализатора) и, соответственно, качества получаемого продукта. Действительно, нейтрализация известного гидролизата перед введением в питательные среды приведет к чрезмерной концентрации хлоридов.

Для обоснования интервалов режимов выполнения описанного способа были проведены серии экспериментов.

Эксперименты 1-й серии имели целью установление допустимого и предпочтительного интервалов кислотности рабочих растворов, рецептуры которых соответствовали указанным в табл. 2.

Рабочие растворы приготовляли в колбах емкостью 250 мл. В вариантах 1-5 в колбы вначале вливали воду, а в варианте 6 - 40%-ный концентрат молочной сыворотки. Затем при непрерывном перемешивании через капельницу подавали серную кислоту.

Колбы с растворами помещали в автоклав и выдерживали при температуре 125^oC в течение 2 ч. Глубину гидролиза углеводов (лактозы) оценивали по содержанию глюкозы, а глубину гидролиза белков - по суммарному содержанию азота в гидролизате.

Анализы гидролизатов показали, что содержание глюкозы во всех вариантах составило 10,5%, что указывает на полный гидролиз лактозы независимо от кислотности рабочих растворов.

Конечная концентрация аминного азота в гидролизатах представлена в колонке 6 табл. 2. Анализ этих данных свидетельствует, что:
- кислотность менее 2N недостаточно для эффективного гидролиза молочных протеинов;
- кислотность более 5N не повышает эффективность гидролиза молочных протеинов;
- кислотность на уровне 4N вполне достаточна для эффективного гидролиза молочных протеинов и более приемлема с точки зрения последующей утилизации солей аммония в процессах культивирования микроорганизмов.

Эксперименты 2-й серии имели целью установление допустимого интервала температуры гидролиза.

Рабочие растворы, как и в 1-й серии, приготовляли в колбах емкостью 250 мл по рецептуре 3-го варианта из табл. 2. Температуру гидролиза задавали как указано в табл. 3. При гидролизе колбы в вариантах 3.1, 3.2 и 3.3 снабжали обратным холодильником и нагревали на масляной бане, а в вариантах 3.3, 3.5 и 3.6 - автоклавировали. Гидролиз вели в течение 12 ч.

Конечные результаты анализов гидролизатов, представленные в колонках 3 и 4 табл. 3 подтверждают, что температуры гидролиза ниже 90^oC и выше 125^oC неэффективны.

Эксперименты 3-й серии имели целью установление допустимого интервала длительности гидролиза. Для этого были проведены две группы экспериментов при разных температурах гидролиза.

Рабочие растворы, как и в 1-й серии, приготовляли в колбах емкостью 250 мл по рецептуре 3-го варианта из табл. 2. Температуру гидролиза задавали на уровнях, соответствующих номерам вариантов из табл. 3 (то есть для примеров, содержащих в номерах сочетание цифр "3.5" - 125^oC и "3.2" - 90^oC). Соответственно той же табл. 3 при гидролизе использовали обратные холодильники или автоклавы.

Результаты анализа готовых гидролизатов даны в табл. 4.

Как видно из табл. 4, длительность гидролиза менее 1 ч приводит к резкому снижению глубины гидролиза белков даже при температуре 125^oC и к не менее резкому снижению эффективность гидролиза лактозы при температуре 90^oC. Далее, гидролиз более 12 ч при 90^oC не повышает аминокислот и моносахаридов.

Пригодность гидролизата концентрированной молочной сыворотки в качестве основы питательных сред для культивирования микроорганизмов была проведена для синтеза разных аминокислот с использованием разных штаммов-продуцентов.

Микробиологический синтез L-лизина.

Микробиологический синтез проводили в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл. В экспериментах использовали: по 2 мл смыва физиологическим раствором 24-часовой культуры Brevibacterium sp. ВНИИгенетика-90, выращенной на косяках мясопептонного агара - в качестве посевного материала; по 20 мл питательных сред, которые были приготовлены:
а) с использованием предложенной основы в виде гидролизата концентрированной молочной сыворотки (далее - гидролизат КМС), нейтрализованного аммиаком перед смешиванием с другими общепринятыми источниками питательных веществ (такая среда обозначена далее как "опытная" с добавлением, при необходимости, цифровых индексов для указания вариантов состава) и
б) с использованием в качестве наиболее эффективной из известных основ уже упомянутого гидролизата БВК (такая среда обозначена далее как "контрольная").

Колбы с питательными средами стерилизовали 30 мин при температуре 121^oC, доводили pH до 7,2 прикапыванием 25%-го стерильного раствора аммиака и вносили посевной материал.

Ферментацию вели при температуре 30^oC в течение 72 ч на качалке при 250 об./мин с амплитудой 50 мм.

В готовой культуральной жидкости определяли концентрацию лизина (в г/л) и выход лизина (как долю от потребленного сахара).

Состав указанных сред (в % по массе) и результаты анализа культуральной жидкости приведены в табл. 5.

Аналогично описанному выше был проведен микробиологический синтез лизина со штаммом-продуцентом Brevibacterium lactofermentum НИТИА-88 на питательной среде "Опытная-1". Концентрация лизина в культуральной жидкости составила 51 г/л при выходе 0.44 для контрольной и 56,4 г/л и выходе 0,45 - для опытной питательной среды.

Как видно из табл. 5 и внетабличных данных, во всех указанных случаях предложенная основа питательных сред оказывается более эффективной и допускает отказ от дефицитного кукурузного экстракта в качестве ингредиента питательных сред.

Микробиологический синтез триптофана.

Посевным материалом служил инокулят Bacillus subtilis ВНИИ-генетика-15. В качестве контрольной использовали питательную среду согласно отраслевому регламенту Минмедбиопрома СССР ОПР N04688648-001-93, в качестве опытной - среду на основе гидролизата КМС.

Составы сред (с указанием концентрации ингредиентов в г/л) и результаты анализа культуральной жидкости приведены в табл. 6.

При подготовке питательных сред раствор мочевины стерилизовали фильтрованием через мембрану, а раствор остальных компонентов - автоклавировали при температуре 121^oC в течение 30 мин. В колбы Эрленмейера емкостью 750 мл вносили по 30 мл питательной среды и по 2 мл инокулята. Ферментацию вели при температуре 37^oC в течение 48 ч на качалке при 250 об./мин и амплитуде 50 мм.

Как видно из табл. 6, при микробиологическом синтезе триптофана гидролизат КМС согласно изобретению вполне эквивалентен кукурузному экстракту в качестве основы питательной среды.

Микробиологический синтез хлортетрациклина и витамина B12.

Для синтеза использовали питательную среду на основе гидролизата КМС согласно изобретению, которая имела состав, мас.%:
Крахмал растительный - 2,0
Гидролизат КМС - 2,0
Нитрат аммония - 0,7
Хлорид натрия - 0,2
Карбонат кальция (мел) - 0,4
Хлорид кобальта - 0,00005
Масло подсолнечное - 0,1
Указанную среду в количестве 50 мл вносили в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл и стерилизовали при 121^oC в течение 30 мин. Затем в колбы вносили роданистый бензил из расчета 1,5 мкг/мл среды и высевали по 2,5 мл мицелия штамма-продуцента хлортетрациклина Actinomyces aureofaciens.

Ферментацию вели в течение 56 ч при температуре 28^oC на качалке при 250 об./мин и амплитуде 50 мм.

Анализом в культуральной жидкости были обнаружены 6000 ед./мл хлортетрациклина и 1,5 мкг/мл витамина B12.

Промышленная применимость изобретения обоснована вышеприведенными примерами. Дополнительно следует отметить экологический эффект, заключающийся в утилизации отхода молочной промышленности, который нередко попадал в промышленные сточные воды и загрязнял поверхностные воды.

Изобретение относится к основе питательных сред, получаемой из молочной сыворотки. Основа питательной среды для культивирования микроорганизмов представляет собой гидролизат концентрированной молочной сыворотки предназначена для достижения практически полной усовяемости в процессах микробиологического синтеза незаменимых аминокислот, антибиотиков и витаминов. Гидролизат получают глубоким кислотным гидролизом указанной сыворотки в присутствии 2,0 - 5,0 N минеральной (предпочтительно 2,0 - 4,0 N серной) кислоты при 90 - 125^oС от 12 до 1 ч. гидролизат содержит не менее 50% глюкозы и галактозы и суммарно не менее 13500 мг % аминокислот в расчете на сухой остаток. Усвояемость практически всех питательных веществ молочной сыворотки культивируемыми микроорганизмами существенно повышается. 1 з.п.ф-лы, 6 табл.

1. Основа питательной среды для культивирования микроорганизмов, представляющая собой гидролизат концентрированной молочной сыворотки, отличающаяся тем, что гидролизат получен глубоким кислотным гидролизом указанной сыворотки в присутствии 2,0 - 5,0 N минеральной кислоты при 90 - 125^oС в течение от 12 до 1 ч и содержит не менее 50% глюкозы и галактозы и суммарно не менее 13500 мг% аминокислот в расчете на сухой остаток. 2. Основа по п.1, отличающаяся тем, что гидролизат получен в присутствии 2,0 - 4,0 N серной кислоты.